不同產(chǎn)地青花椒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的鑒定及其生物活性研究

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.05.030

中圖分類號：TS264.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）05-0207-06

ldentification of Volatile Aroma Substances in Green Peppers from Different Places of Origin and Study on Their Bioactivity

ZHANG Jian-xun1 ，SHANG Guang-bin2 （1.The National Police University for Criminal Justice，Baoding O710oo，China;2.Research Center for Differentiation and Development of TCM Basic Theory，Jiangxi University of Chinese Medicine，Nanchang 33oo04，China）

Abstract： Green pepper has an important position in cooking and traditional medicine due to its unique spicy flavor and medicinal value. It contains active components such as volatile oils and alkaloids，and hasmultiple pharmacological efects such asantioxidant，anti-inflammatory，antibacterial and analgesic effects.In order to explore the diffrences in volatile aroma substances in green pepper from different places of origin，in this study，green peppers from six different regions（A Dali in Yunnan，B Hanyuan in Sichuan， C Shexian in Hebei， D Yueyang in Hunan，E Maoxian in Sichuan，F(xiàn) Hancheng in Shaanxi） are analyzed.It is found that the main volatile compounds in these green peppers are myrcene and linalool， and the odor activity values （OAVs） of these two compounds in the green peppers from the six places of origin are all over 1000 ，indicating that they are important volatile compounds shared by green peppers. In addition，the core target genes and key nodes of green pepper extract in the anti-fatigue process are analyzed through transcriptomics and bioinformatics methods，which has provided a scientific basis for the further development and utilization of green pepper.

Key words： transcriptome;green pepper;bioactivity;extract

青花椒，學(xué)名Zanthoxylumschinifolium，隸屬于蕓香科，是一種具有悠久歷史的食藥同源植物[1-2]，它以獨特的麻味和香氣而著稱，這種特殊的風(fēng)味源自其含有的揮發(fā)油和化學(xué)成分[3]。青花椒不僅能夠為食品增添層次豐富的口感，而且能提升食品的整體品質(zhì)，使其成為烹飪中不可或缺的調(diào)味品[4-5]。在食品加工領(lǐng)域，青花椒被廣泛應(yīng)用于各種菜肴的調(diào)味，尤其是在川菜中，它是許多經(jīng)典菜品不可或缺的原料之一[]，由于其獨特的香味能夠激發(fā)食欲，增加食物的吸引力，除了調(diào)味外，青花椒還具有多種健康益處，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中認(rèn)為其具有溫中散寒、殺菌消炎的功效?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，青花椒含有的生物活性成分具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用，使其在保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域也顯示出巨大的應(yīng)用潛力。隨著對青花椒活性成分研究的深人，其在食品保鮮、健康食品開發(fā)等方面也展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[9]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門研究細(xì)胞內(nèi)所有RNA分子的學(xué)科，它通過高通量測序技術(shù)捕捉基因表達(dá)的全貌，揭示生物體內(nèi)在特定條件下的基因活性狀態(tài)[10-11]。這項技術(shù)能夠檢測mRNA、非編碼RNA以及其他多種RNA分子，為理解生物學(xué)過程和疾病機(jī)制提供了重要視角[12]。生物信息學(xué)是應(yīng)用計算和統(tǒng)計方法分析生物數(shù)據(jù)的學(xué)科，它通過算法和軟件工具處理大量的生物學(xué)信息，如基因序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)[13-14]。

采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)分析青花椒中的抗疲勞活性基因，能夠揭示其潛在的分子機(jī)制和生物活性。高通量測序技術(shù)能夠有效識別青花椒在不同生理狀態(tài)下的基因表達(dá)情況，并發(fā)現(xiàn)與抗疲勞相關(guān)的特異性基因[15]。

生物信息學(xué)的開發(fā)和應(yīng)用增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的應(yīng)用價值，通過算法和統(tǒng)計模型對大量數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、比較和分析，識別出關(guān)鍵的基因表達(dá)差異、功能富集的代謝途徑以及基因間的相互作用，不僅有助于理解青花椒抗疲勞活性的分子基礎(chǔ)，而且能夠為青花椒的種植、加工和新藥開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

6個不同產(chǎn)地的青花椒（A云南大理、B四川漢源、C河北涉縣、D湖南岳陽、E四川茂縣、F陜西韓城）、乳酸試劑盒、異丙醇、氯仿、20只小鼠、Tiangen試劑盒、75%酒精；青花椒提取物為6個不同產(chǎn)地青花椒混合物。

1.2 試驗儀器

AE240型電子分析天平梅特勒-托利多儀器有限公司；JB-41TP型攪拌器上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DYCP-31DN型電泳槽北京六一生物科技有限公司；SA209型強(qiáng)迫游泳實驗箱江蘇賽昂斯生物科技有限公司；DW-86L828J型超低溫冰箱青島海爾生物醫(yī)療科技有限公司；TDZ5-WS型低速離心機(jī)湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；JYB-152型恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；XW-80A型旋渦混合器上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；HZQ-X300C型恒溫振蕩箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Agilent8890-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國安捷倫科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

每個青花椒樣品選取5g質(zhì)量上乘的部分，然后向其中加入 1μL 濃度為 0.33μg/μL 的二氯苯溶液，并充分混合?；旌虾?，將樣品置于頂空瓶中，迅速密封，并在60℃環(huán)境中進(jìn)行恒溫水浴處理，持續(xù)20min后萃取30min。萃取完成后，將萃取頭插入GC進(jìn)口瓶中，繼續(xù)萃取 15min 。每個樣品需要進(jìn)行3次獨立的重復(fù)測量以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3.2 GC-MS的參數(shù)和程序

將萃取過程中的溫度提高到65℃，并維持水浴處理時間不變，仍為 20min 。同時，將萃取時間延長至30min。在氣相色譜（GC）條件的設(shè)置上，將進(jìn)樣口溫度設(shè)定為230℃，使用HP-5MS型號的毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分析。設(shè)置柱溫為63℃，分流比例為15：1進(jìn)樣。MS測定中的檢測器溫度為210℃，傳輸線溫度為 210^°C 。

1.3.3小鼠肌肉組織收集及轉(zhuǎn)錄組測序

1.3.3.1 樣品采集

首先需要選擇合適的肌肉組織進(jìn)行采集，確保在無菌條件下操作以避免污染。采集后，應(yīng)盡快處理樣品以保持其新鮮度，這對試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

1.3.3.2 樣品處理

采集的肌肉組織需要經(jīng)過分離、清洗、剪切等步驟，這些處理過程需要謹(jǐn)慎操作，以避免對樣品造成損傷或引入污染。

1.3.3.3 RNA提取

從處理后的肌肉組織中提取總RNA，這一步驟對后續(xù)的測序質(zhì)量有直接影響，因此需要采用高效的RNA提取方法，并確保RNA的完整性和純度。

1.3.3.4 文庫構(gòu)建

使用提取的RNA構(gòu)建測序文庫，這一步驟涉及到將RNA片段化、加尾、連接接頭等操作，為高通量測序做好準(zhǔn)備。

1.3.3.5 高通量測序

將構(gòu)建好的文庫進(jìn)行高通量測序，如Illumina平臺測序，以獲得大量的RNA序列信息。

1.3.3.6 數(shù)據(jù)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)需要通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行質(zhì)量控制、比對、定量、差異表達(dá)分析等，以識別基因表達(dá)的變化和模式。

1.3.4實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerasechainreaction，qPCR）是一種高靈敏度的核酸檢測技術(shù)，用于定量分析特定DNA序列的拷貝數(shù)。以下是進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測的一般步驟。

1.3.4.1 樣品準(zhǔn)備

收集并處理樣品，提取高質(zhì)量的RNA。

l.3.4.2 cDNA合成（如果使用RNA樣品）

使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA樣品轉(zhuǎn)換為cDNA。

1. 3.4.3 數(shù)據(jù)收集

儀器在每個循環(huán)的特定階段收集熒光信號，并將其轉(zhuǎn)換為實時數(shù)據(jù)。

1. 3.4.4 基線和閾值設(shè)置

在分析軟件中設(shè)置基線和閾值，以確定PCR擴(kuò)增的線性階段。

1.3.4.5 Ct值確定

軟件自動計算每個樣品的Ct值（熒光信號達(dá)到閥值時的循環(huán)數(shù)）。

1.3.4.6 結(jié)果分析

根據(jù)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算目標(biāo)基因的相對或絕對拷貝數(shù)。

1. 3.4.7 數(shù)據(jù)解釋

對試驗結(jié)果進(jìn)行解釋，包括基因表達(dá)水平的比較、相對定量分析等。

2 結(jié)果與討論

2.1GC-MS測定不同產(chǎn)地青花椒中揮發(fā)性成分熱圖

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對6個不同產(chǎn)地的青花椒樣品進(jìn)行揮發(fā)性成分分析。分析結(jié)果顯示，這些樣品在揮發(fā)性化合物的種類和含量上存在明顯的差異。青花椒中的揮發(fā)性化合物總含量為745.3～3123.78mg/kg。共鑒定出83種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中烯烴類化合物最豐富，包括23種不同的化合物；醛類化合物有17種；酯類化合物有10種；酮類化合物有5種；其他類化合物有6種；酸類化合物最少，僅鑒定出2種。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，烴類化合物的含量在所有揮發(fā)性成分中最高。主要的揮發(fā)性化合物包括芳樟酯、檜烯、芳樟醇、月桂烯、檸檬烯和羅勒烯等，這些化合物是青花椒獨特風(fēng)味的關(guān)鍵貢獻(xiàn)者。

2.2 青花椒香氣物質(zhì)及OAV

氣味活性值（OAV）對于評估揮發(fā)性化合物對香氣的貢獻(xiàn)至關(guān)重要，當(dāng)OAV大于1時，則表明這種化合物對青花椒整體香氣成分的影響較大，而OAV越大，表明這種化合物對青花椒香氣的影響越大，通過整理發(fā)現(xiàn)6個產(chǎn)地的青花椒中共包括香氣物質(zhì)31種，不同產(chǎn)地的青花椒香氣成分及OAV見表1。

由表1可知，6個不同產(chǎn)地的青花椒中共有的香氣化合物有10種，這10種香氣化合物分別為芳樟醇、松油醇、乙酸芳樟酯、乙醛、乙酸、檜烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯和羅勒烯；其中，月桂烯和芳樟醇的OAV均大于 1 000 ，說明這兩種化合物對青花椒香氣成分的影響較大；檸檬烯、羅勒烯和乙酸芳樟酯這3種香氣化合物的OAV為 100～1 000 ，也具有較高的OAV，這些化合物對青花椒的香氣成分仍然具有較大貢獻(xiàn)；揮發(fā)性化合物乙酸、檜烯、 ?_?β -蒎烯和松油醇也是6個不同產(chǎn)地青花椒中共有的揮發(fā)性化合物，只是含量存在明顯差異。上述分析結(jié)果表明不同產(chǎn)地的青花椒中主要的揮發(fā)性化合物均為月桂烯和芳樟醇；然而由于產(chǎn)地的不同，青花椒中揮發(fā)性化合物的含量和種類也存在一定程度的差異。

3青花椒中生物活性功能研究

3.1轉(zhuǎn)錄組測序的篩選及分析

將測序獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行整理分析，結(jié)果見表2。

表2過濾后的測序數(shù)據(jù)質(zhì)控統(tǒng)計

由表2可知，本試驗一共檢測了第N小組（等時游泳運動空白對照組，灌胃純凈水）試驗6個樣品、第E小組（等時游泳運動試驗組，灌胃低劑量青花椒提取物）試驗6個樣品、第B小組（等時游泳運動試驗組，灌胃高劑量青花椒提取物）試驗6個樣品。轉(zhuǎn)錄組測序后，共獲得CleanBases總數(shù)196.62GB，平均每個樣品的數(shù)據(jù)量為10.92GB，結(jié)果顯示測序深度充足，足以支撐后續(xù)復(fù)雜的生物信息學(xué)分析。 Q20 的比例范圍為96.11%～98.23%， Q30的比例范圍為 90.73%～94.73% 測序結(jié)構(gòu)質(zhì)控較好，錯誤率極低，數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性得到保證，能夠用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

總對比率，即樣品基因與參考基因組匹配的比率，直接反映了轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的利用效率。較高的總對比率意味著數(shù)據(jù)的利用效率較好，這一比率會受到測序質(zhì)量、參考基因組的完整性等因素的影響。在本研究中，測序數(shù)據(jù)的總對比率達(dá)到 94.21% 以上，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，足以支持后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

3.2差異表達(dá)基因的分析結(jié)果

利用FPKM（每千個堿基每百萬個reads數(shù)）值來評估RNA測序中的基因表達(dá)水平，通過Featurecount軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，首先獲得原始的readcount數(shù)據(jù)，然后對這些readcount數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以便于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異。在數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，根據(jù)設(shè)計的統(tǒng)計模型和假設(shè)條件，計算出 P 值，用于評估基因表達(dá)差異的顯著性。為了控制多重假設(shè)檢驗帶來的假陽性結(jié)果，對 P 值進(jìn)行校正，得到校正后的 值。通過比較N和E兩組樣品，共鑒定出367個差異表達(dá)基因，其中97個上調(diào)基因，270個下調(diào)基因。在E和B兩組樣品的比較中，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因342個，包括300個上調(diào)基因和42個下調(diào)基因。進(jìn)一步對這兩組比較結(jié)果中的差異表達(dá)基因進(jìn)行交集分析，找出在N組與E組以及E組與B組之間共同差異表達(dá)的基因，共計35個，這些共同差異表達(dá)的基因可能在研究的生物學(xué)過程中起到關(guān)鍵作用。查閱對比后發(fā)現(xiàn)與運動相關(guān)的基因包括有7對，見表3。

分析結(jié)果

將NvsE和EvsB的差異表達(dá)結(jié)果進(jìn)行整理并疊加，制備獲得圖2的韋恩圖，左圖為NvsE圖，右圖為EvsB圖，由圖2可知，兩種對比的差異顯示基因有35個。

繼續(xù)對差異顯示的35個基因進(jìn)行深入分析，N組和E組對比有97個水平上調(diào)的基因差異，E組和B組對比有300個水平上調(diào)的基因差異，兩個對比小組中共包括差異表達(dá)基因10個，其中與運動和能量相關(guān)的基因有5個，分別為Gpam、Kif27、Scl8al、Cdh10、Zfp92。

N組和E組對比有270個水平上調(diào)的基因差異，E組和B組對比有42個水平上調(diào)的基因差異，兩個對比小組中共包括差異表達(dá)基因25個，其中與運動和能量相關(guān)的基因有2個，分別為Mt1和Mt2。差異表達(dá)基因的聚類圖見圖3。

通過KEGG富集分析結(jié)果對KEGG通路進(jìn)行分析，尋找并搜索到的通路見表4。N組和E組對比組的表達(dá)水平上調(diào)50個通路，E組和B組對比組的表達(dá)水平下調(diào)15個通路，N組和E組對比組與E組和B組對比組之間共有2個通路，分別為代謝通路（mmu01101）和cGMP-PKG信號通路 ：mmu04023） 。

N組和E組對比組的表達(dá)水平下調(diào)45個通路，E組和B組對比組的表達(dá)水平上調(diào)70個通路，N組和E組對比組與E組和B組對比組之間共有13個通路，分別為糖酵解通路（mmu05413）、MAPK信號通路 （mmu00011 、細(xì)胞因子受體相互作用通路 ：mmu05144） 、甲型流感通路（mmu04009）病毒性心肌炎通路 （mmu05201 ）、酪氨酸代謝通路 （mmu04059 ）、HIF-1信號通路 （mmu05165） 、TNF信號通路 （mmu05417） 、鞘脂代謝通路 （mmu0351） ）、丁酸丁酯和新霉素的生物合成通路（ ?mmu04065 ）、二型糖尿病通路 Δ（mmu04667 、鞘脂信號通路（mmu00589）和炎癥性腸病通路 （mmu05322） ，與代謝相關(guān)。

Gpam基因主要編碼甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，本研究發(fā)現(xiàn)Gpam基因的KEGG通路主要富集在代謝通路（mmu01101）。N組的Gpam基因表達(dá)量為8000，E組的Gpam基因表達(dá)量為20O0，B組的Gpam基因表達(dá)量為7000。同理，比較其他基因表達(dá)量，E組低劑量青花椒添加量的基因表達(dá)量與N（空白對照）和B（高劑量青花椒添加量）兩組之間的基因表達(dá)量差異較明顯，見表5。

4小結(jié)

青花椒是一種具有獨特風(fēng)味的調(diào)味品，雖然青花椒的產(chǎn)地存在差異，但是其主要的揮發(fā)性化合物成分仍然相同，通過GC-MS法對青花椒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)6個不同產(chǎn)地的青花椒中的主要化合物為月桂烯和芳樟醇，且OAV均大于1000，說明這兩種化合物是青花椒主要的成分之一。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析青花椒提取物對小鼠運動性疲勞的改善，對空白對照、低劑量青花椒提取物和高劑量青花椒提取物的小鼠肌肉組織進(jìn)行高通量測序分析，通過研究等時運動導(dǎo)致小鼠運動性疲勞的生理病變以及干預(yù)小鼠運動性疲勞的生物學(xué)過程，進(jìn)而分析小鼠運動性疲勞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制。

經(jīng)過細(xì)致的對比研究，發(fā)現(xiàn)青花椒提取物具有顯著的抗疲勞活性，這種活性通過精細(xì)調(diào)控小鼠體內(nèi)的Gamp、Mt2和Slc8al3個關(guān)鍵基因的表達(dá)水平來實現(xiàn)，3個基因在能量代謝和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，該發(fā)現(xiàn)為青花椒在運動營養(yǎng)和健康領(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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