蜂花粉黃酮的固態(tài)發(fā)酵提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

中圖分類號：TS201.2 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）05-0217-06

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.05.032

Optimization of Solid-State Fermentation Extraction Process of Flavonoids from Bee Pollen and Study on Their Antioxidant Activity

DONG Cai-wen1，2，QIU Yan-jun¹ ，WANG Ming-lei1 ，LI Ya-qin¹ ，WEI Tao1，2* （1.School of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002， China； 2. Collaborative Innovation Center of Food Production and Safety in Hennan Province，Zhengzhou 450002，China）

Abstract：Yeast is utilized to improve the solid-state fermentation process of rape bee pollen，and the optimal extraction results of flavonoids are obtained by response surface design with the aid of weak alternating magnetic field. The results show that when the OD value of bacterial solution is 1.O，the sugar liquid concentration is 40% ，the magnetic field treatment time is 4.3h ，and the fermentation temperature is （202 33.0^°C ，the content of flavonoids in fermented pollen extract reaches 1.40mg/mL ，which is 31.2% higher than that of the blank group. After fermentation，the DPPH·scavenging rate of pollen extract is 78.35% ， the ·OH scavenging rate is 87.65% ，and the ABTS⁺ ·scavenging rate is 73.65% . The Fe³⁺ reducing capacity of yeast pollen extract is equivalent to 66.65mg/100mLI v_c ，and the total antioxidant capacity of yeast pollen extract is 163.65U/mL

Key words： solid-state fermentation； yeast；bee pollen； antioxidation； process optimization

蜂花粉獨特的細胞壁結構導致其營養(yǎng)成分不容易釋放而被吸收 [1-4] 。目前，利用微生物發(fā)酵進行破壁很普遍 [5-8] ，其機理是利用微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶的作用[9]。其中，酵母菌發(fā)酵破壁的效果明顯，條件溫和且可滅菌，對熱敏性的營養(yǎng)物質破壞性小[10-12]。

隨著磁場對微生物作用的深入研究，目前出現(xiàn)了很多使用弱磁場來促進微生物生長的報道，以達到促進發(fā)酵的目的[13-15]。

現(xiàn)代科學家們發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物在自然界中的生物學作用比較顯著，如抑制膽固醇和癌細胞生長、減輕疼痛感[16-17]。目前，多數(shù)研究表明蜂花粉的抗氧化性與黃酮類物質密切相關[18-19]。因此，蜂花粉能清除人體內(nèi)的自由基，對延緩人體衰老和預防心血管類疾病有作用[20]。目前國內(nèi)外對一些液態(tài)發(fā)酵和自然發(fā)酵蜂花粉抗氧化性的研究較多，但對固態(tài)發(fā)酵蜂花粉抗氧化性的研究較少。

電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）是近年來發(fā)展起來的一種儀器，可以用于檢測自由基[21]。DPPH·在常溫下較穩(wěn)定，可以在ESR中形成有規(guī)律的五重峰譜圖，因此，在試驗中常用于反映物質的抗氧化能力[22]。

本文選用酵母菌固態(tài)發(fā)酵油菜蜂花粉，利用響應面法優(yōu)化工藝[23-24]。通過研究發(fā)酵前后蜂花粉黃酮含量的變化及其抗氧化特性，為蜂花粉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供了參考。

1材料和方法

1. 1 材料與試劑

油菜蜂花粉：購于河南省長葛市；酵母菌：實驗室保藏；蘆?。ˋR）：上海源葉生物科技有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH，分析純）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯乙酸、無水乙醇（均為分析純）：鄭州派尼化學試劑廠；抗壞血酸（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；總抗氧化能力試劑盒：南京建成生物工程研究所；YPD液態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)基：北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MFI-F1磁場輔助冷凍冷藏試驗箱英都斯特（無錫）感應科技有限公司；SHZ-82A回旋式水浴恒溫振蕩器上海析達儀器有限公司；EMXplus電子順磁共振波譜儀布魯克（北京）科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

YPD液體和固體培養(yǎng)基：按照要求進行配制，于115^°C 滅菌 20min ，冷卻備用。

1.3.2 菌種的培養(yǎng)

在超凈工作臺上將凍存的酵母菌接種到 10mL YPD液體培養(yǎng)基中，然后在 33°C 搖床中培養(yǎng) 12h 。取0.1mL 細菌懸浮液，將其涂布在YPD板上，然后在33^°C 培養(yǎng) ^12h ，選擇單個菌落，將其放置在 100mL YPD液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng) 12h 。

1.3.3 花粉黃酮的提取工藝

稱取 2g 發(fā)酵花粉置于 50mL 離心管中，加人 20mL

80% 甲醇溶液，混勻。在 35°C 條件下于水浴恒溫振蕩器中振蕩 12h ，然后在 3500r/min 條件下離心 10min ，取上清液，用 80% 甲醇補充至原來的體積。

1.3.4花粉黃酮質量濃度的測定

參考米智等[25]的方法，以蘆丁質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程： y=0.2344x+ 0.001 7（R²=0.9997） ，根據(jù)標準曲線方程得到黃酮質量濃度。

1.3.5 響應面試驗設計

在菌液OD值、糖液濃度、磁場處理時間、磁場強度等單因素試驗的基礎上，結合響應面試驗設計，選取3個影響較大的因素，考察其對花粉黃酮含量的影響，響應面試驗因素水平見表1。

1.3.6.1 ESR的操作方法

用石英毛細管吸取待測樣品 23.77μL（d=0.93mm h=35mm） ，當其吸入2/3時，插入固體膠內(nèi)封底，并擦凈外部殘留液體和多余固體膠，然后將E-scan量規(guī)放入石英套筒中調節(jié)位置，刻度線可指向待測液面的中間部位，最后置于諧振腔內(nèi)，自動調諧并進行計量。

ESR的測定參數(shù)參照章銀良等[21-22]的方法，設備的具體參數(shù)一致。

1.3.6.2 DPPH標準曲線的建立

用無水乙醇配制 0.1～1.0mmol/L 的DPPH溶液，按照上述方法測定，并建立關于DPPH的ESR標準曲線。

1.3.6.3樣品暗反應時間的確定

單次掃描時間為 20.97s ，掃描間隔時間為 158.23s 掃描40次，其余參數(shù)不變?？瞻捉MESR譜圖中第3個特征峰的峰高表示反應 0min 時的強度值，吸取 0.1mL 花粉提取液與 2mL0.5mmol/L DPPH混勻并計時，上樣調諧后立即測量，建立樣品的DPPH第3個特征峰的峰高和時間變化關系圖。

1.3.6.4 DPPH·清除率的測定

參照章銀良等[21-22]的方法并稍作修改。取 0.5mL 花粉提取液和 4.5mL80% 甲醇，配制成10倍稀釋液，然后取 100μL 花粉提取液與 2mL0.5mmol/L DPPH溶液充分混合，空白組用 80% 甲醇溶液代替樣品，其他操作不變，暗反應 20min 后，開始測量。

在布魯克自帶軟件WinEPR-Processing中上傳掃描波譜圖，進行二重積分，樣品的二重積分值記為A₁ ；對照組用 0.5mL80% 甲醇溶液代替 0.5mL 稀釋后的樣品溶液，其他操作不變，記為 A₂ 。陽性對照用 1mg/mLV_c 代替花粉提取液，其他操作不變，抗氧化試驗平行測定2次。花粉提取液的DPPH·清除率計算公式如下：

1.3.7 ·OH清除率的測定

參考劉子菱[26的方法，以 v_c 濃度為橫坐標，加入0.6mL 稀釋5倍的花粉提取液，然后分別加入相應的溶液，在 37^°C 水浴鍋中暗反應 30min 。用 2mL80% 甲醇代替水楊酸作為對照組，記為 A₁ ；用 0.6mL 80% 甲醇代替樣品作為空白組，記為 A₂ ；樣品的吸光度為 A₃ ，陽性對照用 1mg/mLV_c 溶液代替花粉提取液，其他操作不變，抗氧化試驗平行測定2次?！H清除率計算公式如下：

·OH清除率

1.3.8 ABTS+·清除率的測定

參照牛德芳等[27]的方法，配制 6mmol/L ABTS溶液，取 4mL 花粉提取液和 1mg/mLV_c ，加入 4mL ABTS工作液，搖勻，避光靜置 6min 。使用 80% 甲醇溶液，用蒸餾水調零，在 734nm 處測定其吸光度，作為空白組，記為 A₁ ，樣品組記為 A₂ 。抗氧化試驗平行測定2次。ABTS+·清除率計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 響應面試驗結果

2.1.1 響應面試驗結果分析

根據(jù)Design-Expert8.O.6軟件進行分析，對表2中數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到黃酮含量（Y）對自變量菌液OD值（A）糖液濃度（B）和磁場處理時間 （C） 的回歸擬合方程 ：Y=1.38+0.022A-0.043B-0.034C-0.11AB+ 0.015AC+0.16BC-0.18A²+0.068B²-0.10C² 0

表2響應面試驗結果

ABTS⁺ ·清除率

1.3.9 Fe³⁺ 還原能力的測定

參考劉秉杰等[28]的方法，以 v_c 濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制 v_c 標準曲線。取 1mL 花粉提取液，磷酸鹽緩沖液和 1% 鐵氰化鉀各 2.5mL ，水?。囟葹?50^°C ）反應 20min ，冷卻，加 2.5mL （204號 10% 三氯乙酸，然后取反應后的溶液 2.5mL ，加水 2.5mL 和 0.1% 三氯化鐵 0.5mL 。在 700nm 處測定，以試劑空白為參比，吸光度越大表示還原能力越強?？寡趸囼炂叫袦y定2次。

1.3.10 總抗氧化能力的測定

酵母菌發(fā)酵后花粉提取液總抗氧化能力的測定：按照試劑盒中列明的公式計算總抗氧化能力 （U/mL） 。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert10.0軟件優(yōu)化工藝參數(shù)，確定本研究的最優(yōu)條件，采用SPSS軟件對抗氧化試驗結果進行分析。

注：“ ? ”表示影響顯著 （Plt;0.05） ，“ $＼ntimes ＼ntimes$ ”表示影響極顯著1 ?Plt;0.01） 。

由表3可知， F 值為 4.22，P 值 lt;0.05 ，失擬項的P 值 =0.2258gt;0.05 ，失擬項不顯著，表明該模型的選擇合理。

2.1.2 驗證試驗

通過響應面設計得到最優(yōu)組合：菌液OD值為1.02，糖液濃度為 39.6% ，磁場處理時間為 4.25h ，此時黃酮質量濃度預測值為 1.42mg/mL 。在調整條件下，即菌液OD值1.0、糖液濃度 40.0% 、磁場處理時間 4.3h 時，驗證試驗得到的黃酮質量濃度為 1.40mg/mL ，誤差較小，表明模型合理。

2.1.3 發(fā)酵前后黃酮含量的變化

用YPD液體培養(yǎng)基代替菌液作為空白組，得到的發(fā)酵花粉黃酮含量平均值為 1.05mg/mL ，最優(yōu)條件下得到的黃酮含量為 1.40mg/mL ，比空白組提高了 31.2% 。

2.2DPPH濃度與不同樣品暗反應時間的確定

Fig.1 The relationship diagram between integral values of DPPH with different concentrations and concentration （A） and ESR graph （B）

由圖1可知，隨著DPPH濃度的升高，五重峰譜圖的峰形和峰寬幾乎沒有變化，然而峰高發(fā)生明顯變化，線性方程為 y=7.9594x+0.0526，R²=0.9918 ，說明在 0.1～1.0mmol/L 區(qū)間內(nèi)，二者之間的二重積分值線性關系良好，此過程實際是DPPH含量減少的過程，因此，DPPH濃度的變化可以用ESR譜圖的二重積分值表示。

由圖2可知，將DPPH與樣品混合后，DPPH自由基數(shù)量下降迅速，反應過程比較快速，第3個特征峰的強度隨著時間的增加緩慢降低，花粉提取液中DPPH自由基數(shù)量在 20min 后基本保持不變，因此，花粉提取液暗反應時間為 20min 。

由圖3可知，將DPPH與 v_c 混合后，DPPH自由基數(shù)量迅速下降，在 15min 后基本保持不變，因此， v_c 暗反應時間為 15min 。將DPPH與空白花粉提取液混合后，空白花粉提取液的DPPH自由基數(shù)量與 v_c 相比下降速度明顯放緩，DPPH自由基數(shù)量在 20min 后基本保持不變，因此，空白花粉提取液暗反應時間為 20min 。

注：不同小寫字母表示差異顯著（ ?Plt;0.05 ），下圖同。

由圖4可知，相較于未發(fā)酵的花粉，發(fā)酵后的花粉有著更好的DPPH·清除能力。DPPH·清除率越高，抗氧化能力越強。酵母菌花粉提取液的DPPH·清除能力達到 78.35% ，空白花粉提取液的DPPH ? 清除能力較差，為 46.35% v_c 的DPPH·清除能力最強，超過90% ，三者DPPH ? 清除能力之間存在顯著性差異。

2.4花粉提取液清除·OH能力

·OH不穩(wěn)定，易得電子，對身體造成氧化損傷，在人體內(nèi)也容易與其他生物大分子物質發(fā)生反應，比如降解蛋白質、破壞細胞膜等。因此，有效地清除·OH能夠保護人體健康，延緩衰老。

由圖5可知，相較于未發(fā)酵的花粉，發(fā)酵后的花粉有著更好的·OH清除能力。酵母菌花粉提取液的·OH清除能力最強，達到 87.65% ，其次是 V_c，?OH 清除率達到 80‰ ，兩者之間沒有顯著性差異。未發(fā)酵的花粉的·OH清除能力為 50.35% ，與前兩者存在顯著性差異。

由圖6可知， v_c 的 ABTS⁺ ·清除能力最強，達到80.43% ，其次是酵母菌花粉提取液，其ABTS+·清除能力為 73.65% ，兩者之間沒有顯著性差異?？瞻谆ǚ厶崛∫旱?ABTS⁺ ·清除能力較差，為 46.35% .與前兩者存在顯著性差異。相較于未發(fā)酵的花粉，發(fā)酵后的花粉有著更好的ABTS+·清除能力。

2.6 （204號 v_c 標準曲線

由圖7可知， v_c 標準曲線方程為 y=0. 009 82x+ 0.017 67， R²=0.993 65 ，線性關系較好。

2.7花粉提取液 Fe³⁺ 還原能力

Fig. 8 Fe³⁺ reducing power of pollen extract由圖8可知，酵母菌花粉提取液的 Fe³⁺ 還原能力相當于 66.65mg/100mLV ；空白花粉提取液的Fe³⁺ 還原能力較弱，相當于 20.35mg/100mL^′ v_c ，兩者之間存在顯著性差異。

由圖9可知， v_c 的總抗氧化能力最強，達到175.43 U/mL 酵母菌花粉提取液的總抗氧化能力達到 163.65U/mL .兩者之間不存在顯著性差異?？瞻谆ǚ厶崛∫旱目偪寡趸芰ψ钊?，為 19.24U/mL ，發(fā)酵后的花粉與未發(fā)酵的花粉的抗氧化能力存在顯著性差異。

3結論

本試驗采用酵母菌固態(tài)發(fā)酵蜂花粉，有利于黃酮物質的溶出，提高了黃酮含量。通過響應面優(yōu)化得到最佳工藝條件為菌液OD值1.0、發(fā)酵溫度 33.0°C 、糖液濃度 40% 、磁場處理時間 4.3h ，此時得到的黃酮含量為 1.40mg/mL ，空白組黃酮含量為 1.05mg/mL ，提高了 33.3% 。研究發(fā)酵后花粉提取液的抗氧化能力，酵母菌花粉提取液的DPPH·清除率為 78.35% ，·OH清除率為 87.65% ABTS⁺ ·清除率為 73.65% ；酵母菌花粉提取液的 Fe³⁺ 還原能力相當于 66.65mg/100mL v_c ；酵母菌花粉提取液的總抗氧化能力為 163.65U/mL 0

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