響應(yīng)面法優(yōu)化石斑魚(yú)骨酶解工藝及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性研究

中圖分類號(hào)：TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2025）05-0075-07

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.05.011

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process of Grouper Bones by Response Surface Methodology and Study on Antioxidant Activity of Enzymatic Hydrolysates

LIU Mei-jiao1，LI Zhu-yi1，CHEN Qiu-han1，YANG Xue-bo1，LIU Shou-chun ^1，2 * ZHONG Sai-yi1，HONG Peng-zhi1’2， ZHU Chun-hua3，CHEN Kang-jian4 （1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety， Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Seafood，Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Aquatic Prepared Food Processing and Quality Control， College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524o88，China; 2. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Provincial Laboratory （Zhanjiang）， Zhanjiang 524o25，China；3.College ofFisheries，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524o88，China;4.Guangdong Evergreen Group Co.，Ltd.，Zhanjiang 5240o0，China）

Abstract：Four kinds of proteases are used to enzymolize the grouper bone，and the optimal hydrolysis enzyme is screened with thecontent of polypeptides and soluble calcium as the indexes. The efects of enzyme addition amount，solid-liquid ratio and enzymatic hydrolysis time on the content of polypeptides and solublecalcium are investigated，and the enzymatic hydrolysis process is optimized by response surface methodology. The content of amino acids and the antioxidant activity of the enzymatic hydrolysates obtained under the optimal conditions are determined. The results show that the polypeptide content is 11.07mg/mL and the soluble calcium content is 80.49mg/L when enzymatic hydrolysis time is ，solid-liquid ratio is 1：6 and enzyme addition amount is 4 500U/g ， The essential amino acids in the enzymatic hydrolysates account for 35.87% of the total amino acids. The antioxidant activity of enzymatic hydrolysates increases with the increase of mass concentration，and the DPPH radical scavenging rate is 94.62% when the mass concentration is 5mg/mL ，which reaches the level of the same concentration of v_c ，indicating that they have good antioxidant activity. In this study，a kind of enzymatic hydrolysate of grouper bone that is rich in polypeptides and soluble calcium and has antioxidant activity is prepared，which has provided a certain theoretical basis for the utilization of grouper bone resources.

Key words： grouper bone;enzymatic hydrolysis； ploypeptide； soluble calcium;antioxidant activity

石斑魚(yú)屬鱸形目鮨科，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、味道鮮美，是一種低脂肪、高蛋白、富含多種不飽和脂肪酸的上等食用魚(yú)[1]。近年來(lái)，石斑魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量激增，2021年已達(dá)到20萬(wàn)噸。隨著市場(chǎng)上對(duì)石斑魚(yú)需求量的增大，魚(yú)片、魚(yú)糜等加工產(chǎn)品也在不斷增多，同時(shí)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，其中近 25% 是魚(yú)骨[2]。關(guān)于石斑魚(yú)肉和魚(yú)皮用來(lái)開(kāi)發(fā)蛋白多肽的研究已有報(bào)道[3-4]，但是關(guān)于石斑魚(yú)骨加工利用的研究報(bào)道極少。魚(yú)骨中含有豐富的膠原多肽和礦物質(zhì)，具有生產(chǎn)抗氧化肽、ACE抑制肽[5]和生物活性鈣的潛力，是一種天然活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)的良好來(lái)源。魚(yú)骨膠原具有由2個(gè) α∝1 鏈和1個(gè) α2 鏈組成的I型膠原的特性，魚(yú)骨中的膠原蛋白被歸類為I型膠原蛋白，其中含有大量的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸。同時(shí)，魚(yú)骨中鈣含量豐富， Ca²⁺ 溶出有助于提高多肽的抗氧化活性[8]。范秀萍等[9]通過(guò)生物酶解法制備石斑魚(yú)頭酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其在分子質(zhì)量 時(shí)具有較好的抗氧化活性。張蕾等[0]以河蜆為原料制備多肽螯合鈣，結(jié)果表明添加 Ca²⁺ 的多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力提高。

本研究以石斑魚(yú)骨為原料，采用不同蛋白酶進(jìn)行酶解，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳酶解工藝，并測(cè)定最佳工藝條件下得到的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，該研究結(jié)果為石斑魚(yú)的高值化利用和生物活性研究提供了理論參考。

1材料與方法

1. 1 原料與試劑

石斑魚(yú)：購(gòu)于霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；中性蛋白酶（1×10⁵U/g） 、堿性蛋白酶 （2×10⁵U/g） ：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶 （1×10⁵U/g） 、復(fù)配蛋白酶（3.5×10⁵U/g） ：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、Ca標(biāo)準(zhǔn)溶液 （1000μg/mL） 、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水楊酸、抗壞血酸（ v_c ）等試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1. 2 儀器與設(shè)備

800C多功能粉碎機(jī)永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；ThermoLYNX6OOO高速落地式離心機(jī)美國(guó)賽默飛世爾科技公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋常州鴻澤實(shí)驗(yàn)科技有限公司;PHS-3CpH計(jì)上海雷磁儀器廠；TAS-990火焰原子吸收分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FD8508真空冷凍干燥機(jī)韓國(guó)ILSHIN公司。

1. 3 試驗(yàn)方法

1.3.1石斑魚(yú)骨粉制備和酶解工藝

新鮮石斑魚(yú) $$ 采肉 $$ 高壓蒸煮 （121°C，0.1MPa） 洗凈殘肉 $$ 烘干 $$ 粉碎 ? 過(guò)60自篩 $$ 石斑魚(yú)骨粉 $$ 根據(jù)料液比加水 $$ 調(diào)節(jié) 根據(jù)加酶量加入蛋白酶 $$ 設(shè)定溫度和時(shí)間水浴酶解 $$ 滅酶（沸水浴，10min） 離心 （5000r/min，20min） 冷凍干燥上清液 $$ 石斑魚(yú)骨酶解產(chǎn)物。

1.3.2 多肽含量測(cè)定

采用雙縮脲法[1]進(jìn)行測(cè)定。向離心管中加人 5mL 樣液、 .5mL 三氯乙酸（ 10% ），搖勻后靜置 10min ，離心取上清液，加入4倍體積的雙縮脲試劑，搖勻靜置10min 后測(cè)定 OD_540nm ，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中的多肽含量。

1.3.3 可溶性鈣含量測(cè)定

可溶性鈣含量參照GB5009.92—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鈣的測(cè)定》中火焰原子吸收光譜法測(cè)定。

1.3.4 蛋白酶篩選

選取4種蛋白酶，根據(jù)各自的適宜溫度和pH（中性蛋白酶和木瓜蛋白酶： 50°C ， pH7.0 ；堿性蛋白酶：60^°C，pH8.0 ；復(fù)配蛋白酶： 55°C . pH8.5AA ，各種酶的添加量均為 6000U/g ，對(duì)石斑魚(yú)骨粉進(jìn)行酶解， 3h 后準(zhǔn)時(shí)取出滅酶，冷卻后離心 （5000r/min，15min） .測(cè)定上清液中多肽和可溶性鈣的含量。

1.3.5酶解單因素試驗(yàn)

對(duì)酶解工藝條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化，設(shè)置基本條件為酶解時(shí)間 ^3h 、加酶量 6000U/g 、料液比 1：6 。改變其中一個(gè)條件，固定其他條件不變。各因素水平設(shè)計(jì)為酶解時(shí)間 （2，3，4，5，6h） 、料液比 （1：4.1：5 F1：6.1：7.1：8） 、加酶量 （4000，5000，6000，7000 8000U/g? ，分析各單因素對(duì)多肽含量和可溶性鈣含量的影響。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以多肽含量和可溶性鈣含量為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.3.7 氨基酸組成分析

參考GB5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》中的方法測(cè)定酶解產(chǎn)物中氨基酸組成。

1.3.8 抗氧化活性測(cè)定

1.3.8.1DPPH自由基清除率測(cè)定

根據(jù)Luo等[12]的方法并稍作修改，將酶解產(chǎn)物配制成不同濃度的樣液，將等體積的樣液與DPPH-乙醇溶液 （0.1mmol/L） 混合，避光靜置 30min ，在 517nm 處測(cè)定OD值 （A₁ ），同時(shí)以無(wú)水乙醇代替DPPH-乙醇溶液測(cè)定OD值 （A₂） ，以蒸餾水代替樣液測(cè)定OD值 （A₀） L以 5mg/mL 的 v_c 溶液作對(duì)比。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率 中

1.3.8.2羥基自由基清除率測(cè)定

參照曹曉霞等[13]的方法，吸取 FeSO₄ （2 mmol/L）、H₂O₂（1mmol/L） 和水楊酸 （6mmol/L） 溶液各 3mL 混勻， 37^°C 水浴 15min ，在 510nm 處測(cè)定OD值 （A₀） ），隨后加入 1mL 樣液， 水浴 15min ，在 510nm 處測(cè)定OD值 （A₁） ），同時(shí)以蒸餾水代替 H₂O₂ 溶液測(cè)定OD值 （A₂ ），以 5mg/mL 的 v_c 溶液作對(duì)比。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

羥基自由基清除率

1.3.8.3超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

根據(jù) Pan 等[14]的方法并稍作修改，吸取Tris-HCl緩沖液 （pH8.2，50mmol/L）5mL 于試管中， 25°C 水浴20min ，再加入樣液和焦性沒(méi)食子酸溶液（25mmol/L）各0.5mL，25PC 水浴 5min ，最后加入鹽酸溶液 （8mol/L） 1mL 終止反應(yīng)，測(cè)定 299nm 處的OD值 （A₁ ），同時(shí)以蒸餾水代替樣液測(cè)定OD值 （A₀） ，以 5mg/mL 的 v_c 溶液作對(duì)比。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下：

超氧陰離子自由基清除率 0

1.3.8.4 總還原力測(cè)定

參照Chan等[5]的方法，吸取樣液 0.2mL 、磷酸緩沖溶液 （0.2mol/L，pH 6.6） 和鐵氰化鉀溶液 （1% ）各 0.5mL 于試管中，混勻， 50^°C 水浴 20min ，再加人三氯乙酸溶液 （10%）0.5mL ，混勻，離心 （3500r/min 10min） ，吸取等體積上清液與蒸餾水，加入 0.1mL 三氯化鐵溶液 （0.1%） ，靜置 2min ，測(cè)定 700nm 處的OD值，同時(shí)以蒸餾水代替樣液作為空白對(duì)照，以 5mg/mL 的v_c 溶液作對(duì)比。

1.4數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Design-ExpertV8.O.6.1軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，采用Origin2024繪圖。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，顯著性水平為 Plt;0.05 。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶篩選

注：相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著（ ?Pgt;0.05） ，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著 ?Plt;0.05） ，下圖同。

由圖1可知，復(fù)配蛋白酶的多肽含量顯著高于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶（ Plt;0.05; ，與堿性蛋白酶無(wú)顯著性差異（ Pgt;0.05 ，復(fù)配蛋白酶的可溶性鈣含量顯著高于其他3種蛋白酶 ?Plt;0. 05 。復(fù)配蛋白酶由不同的酶組成，可切斷蛋白質(zhì)不同的肽鏈，從而得到更多的多肽和氨基酸[15]。綜合考慮，選用復(fù)配蛋白酶作為最佳水解酶。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1酶解時(shí)間對(duì)多肽含量和可溶性鈣含量的影響

由圖2可知，酶解時(shí)間在 2～3h 時(shí)，多肽含量和可溶性鈣含量升高，均在 3h 時(shí)達(dá)到最高值，隨后可溶性鈣含量變化平緩，而多肽含量在 ⁴h 后顯著下降 （Plt;0.05） ，這是由于酶解時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白酶的水解度增大到一定程度，部分膠原多肽可能被降解成游離氨基酸，因此多肽含量隨酶解時(shí)間的增加而降低[16]。因此，選擇最適酶解時(shí)間為 3h 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖3可知，隨著料液比的升高，多肽含量和可溶性鈣含量整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，且均在 1：7 時(shí)達(dá)到最高值，之后開(kāi)始下降，說(shuō)明添加適量的水可以促進(jìn)酶解反應(yīng)，料液比過(guò)低導(dǎo)致反應(yīng)體系中酶濃度過(guò)高，抑制酶解反應(yīng)，而料液比過(guò)高會(huì)使酶濃度過(guò)低，降低酶解反應(yīng)速率，與郭耀華等[7]的研究結(jié)果一致。因此，選擇最適料液比為 1：7 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖4可知，隨著加酶量的增加，多肽含量和可溶性鈣含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在 4000～5000U/g 范圍內(nèi)迅速升高，在 5 000U/g 時(shí)達(dá)到最高值。加酶量的增加可以使水解強(qiáng)度增加，但加酶量達(dá)到一定值時(shí)，與底物的反應(yīng)達(dá)到飽和，導(dǎo)致酶自身相互水解，使酶解效果下降[18]。另外，加酶量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蛋白過(guò)度水解，使多肽繼續(xù)水解成游離氨基酸，多肽含量在加酶量 gt;5000U/g 后顯著下降（ Plt;0.05; 。因此，選擇最適加酶量為 5000U/g 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，以酶解液中多肽含量和可溶性鈣含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)17組響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案，結(jié)果見(jiàn)表2。

將試驗(yàn)中各響應(yīng)值輸入，通過(guò)響應(yīng)面軟件進(jìn)行回歸擬合分析，得到酶解液中多肽含量 （Y₁ ）和可溶性鈣含量 （Y₂ ）的回歸方程：

Y₁=7.80+0.65A-1.91B-0.39C+0.060AB- 0 .59AC+0.008197BC+1.10A²+0.43B²-0.66C² Y₂=69.93+12.61A-0.026B-3.26C-7.42AB- 4.62AC+0.97BC-14.10A²-5.49B²-10.85C²

由表3中 Y₁ 回歸方程的方差分析可知，回歸模型的 P=0.000 1 ，模型極顯著，失擬項(xiàng)的 P=0.928 9gt; 0.05，失擬項(xiàng)不顯著， R²=0.971 0 ；由表4中 Y₂ 回歸方程的方差分析可知，回歸模型的 Plt;0. 000 1 ，模型極顯著，失擬項(xiàng)的 P=0.0756gt;0.05 ，失擬項(xiàng)不顯著，R²=0.9855 。方差分析結(jié)果表明兩個(gè)模型與試驗(yàn)結(jié)果的擬合較好，試驗(yàn)結(jié)果可靠，能夠反映出3個(gè)因素與多肽含量和可溶性鈣含量的關(guān)系，可用來(lái)預(yù)測(cè)酶解石斑魚(yú)骨粉的多肽含量和可溶性鈣含量變化。由表3可知，一次項(xiàng) A，B 和二次項(xiàng) A² 對(duì)多肽含量的影響均極顯著 （Plt;0.01） ，一次項(xiàng) c 、交互項(xiàng) AC 和二次項(xiàng) C² 對(duì)多肽含量的影響均顯著 （Plt;0.05） ，其他項(xiàng)的影響均不顯著 （Pgt;0.05） 。由表4可知，一次項(xiàng) A，C ，交互項(xiàng) AB 、AC 和二次項(xiàng) A²，B²，C² 對(duì)可溶性鈣含量的影響均極顯著 （Plt;0.01） ，其他項(xiàng)的影響均不顯著 ?Pgt;0.05） 。

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果和回歸分析，以多肽含量和可溶性鈣含量為響應(yīng)值得到的最佳酶解工藝參數(shù)為酶解時(shí)間 3.95h 、料液比 1：6.12 加酶量 4425.41U/g 此條件下多肽含量預(yù)測(cè)值為 11.69mg/mL ，可溶性鈣含量預(yù)測(cè)值為 72.47mg/L ?？紤]到操作的可行性，將試驗(yàn)條件定為酶解時(shí)間 ^4h 料液比 1：6 、加酶量 4500U/g ，以此工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到多肽含量為 11.07mg/mL 可溶性鈣含量為 80.49mg/L。

2.4氨基酸組成分析

酶解產(chǎn)物的氨基酸組成見(jiàn)表5。

由表5可知，酶解產(chǎn)物的氨基酸種類齊全，必需氨基酸豐富，占總氨基酸的 35.87% 。其中，精氨酸含量（9.98mg/g） 最高，且組氨酸含量 （1.40mg/g） 、酪氨酸含量 （1.72mg/g） 、賴氨酸含量 （1.84mg/g） 也相對(duì)較高，疏水氨基酸（甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸）含量占總氨基酸的 30.25% ，可能對(duì)提高抗氧化活性有相關(guān)作用[19]。支鏈氨基酸（氨酸、異亮氨酸、亮氨酸）含量占總氨基酸的 21.01% ，具有促進(jìn)合成代謝、減少運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用[20]。結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物中氨基酸種類齊全、含量豐富，有利于人體健康和提高抗氧化活性。

2.5 抗氧化活性測(cè)定

2.5.1 DPPH自由基清除率

DPPH溶解于乙醇中表現(xiàn)為深紫色，酶解產(chǎn)物的多肽或鈣離子可能會(huì)產(chǎn)生與DPPH自由基結(jié)合的質(zhì)子，從而形成更穩(wěn)定的分子，這反映在吸收率的降低上[21]。由圖5可知，隨著酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的升高，DPPH自由基清除率在 1～3mg/mL 范圍內(nèi)顯著升高 ?Plt;0.05） ，在 3～5mg/mL 范圍內(nèi)無(wú)顯著變化（ Pgt;0.05） 。當(dāng)酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為 5mg/mL 時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到 94.62% ，與相同濃度下 v_c 的DPPH自由基清除率無(wú)顯著性差異 （Pgt;0.05） ，此結(jié)果表明石斑魚(yú)骨酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基有較好的清除效果。蛋白質(zhì)通過(guò)酶解產(chǎn)生較小分子的肽和氨基酸，表現(xiàn)出較好的DPPH自由基清除能力，與Escudero等[22]的研究結(jié)果一致。

頓反應(yīng)產(chǎn)生，可引起膜脂、蛋白質(zhì)、核酸的氧化損傷和油脂的酸敗[23]。由圖6可知，隨著酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的升高，羥基自由基清除率整體呈上升趨勢(shì)，在 5mg/mL 時(shí)羥基自由基清除率達(dá)到 49.69% ，低于同濃度下 v_c 的羥基自由基清除率（98. 43% ，說(shuō)明酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的升高會(huì)增強(qiáng)羥基自由基的清除率，但是清除能力低于v_c ，與熊明澤等[24]的研究結(jié)果相似。

2.5.3超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子自由基（ O₂^- ·）可以促進(jìn)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)氧化氫和羥基自由基[25]。測(cè)定 O₂^- ·清除率是評(píng)價(jià)樣品抗氧化活性的方式之一。由圖7可知，酶解產(chǎn)物的 O₂^- ·清除率隨著酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加而升高，在 5mg/mL 時(shí) O₂^- ·清除率為 24.31% ，而同濃度下Vc的O?·清除能力較弱，于智慧等[26]研究驢骨酶解液的抗氧化活性時(shí)也發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果。

物質(zhì)的抗氧化能力可以通過(guò)還原力進(jìn)行判斷，抗氧化能力與還原力強(qiáng)度呈正相關(guān)[27]。由圖8可知，隨著酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，酶解產(chǎn)物的總還原力升高，這可能與酶解產(chǎn)物中多肽和鈣的含量有關(guān)。同濃度 5mg/mL 下， v_c 的總還原力顯著高于酶解產(chǎn)物（ Plt;0.05） ，酶解產(chǎn)物的總還原力約為 v_c 的 50% ，與羥基自由基清除率結(jié)果一致。

3結(jié)論

本研究通過(guò)蛋白酶水解石斑魚(yú)骨，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳酶解工藝參數(shù)為酶解時(shí)間 料液比 1：6 、加酶量 4500U/g ，此條件下得到的多肽含量為 11.07mg/mL ，可溶性鈣含量為 80.49mg/L 說(shuō)明蛋白酶對(duì)魚(yú)骨中多肽的水解效果較好。氨基酸組成分析表明酶解產(chǎn)物中含有豐富的氨基酸，其中必需氨基酸含量占總氨基酸的 35.87% ，且富含疏水氨基酸，與提高抗氧化活性相關(guān)?？寡趸钚噪S著酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加而升高，與同濃度下的 v_c 相比，羥基自由基清除率和總還原力約為 v_c 的 50% ，超氧陰離子自由基清除率較低，DPPH自由基清除率可達(dá)到 94.62% ，說(shuō)明石斑魚(yú)骨酶解產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性，為石斑魚(yú)骨的綜合利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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