木本油料作物星油藤LAV亞家族成員鑒定及再生相關(guān)基因PvoLEC2的功能初探

摘""要：LEC2是植物B3超家族中LAV亞家族的重要成員，在胚胎發(fā)育以及分生組織維持等過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。為了探究LEC2基因在星油藤細(xì)胞再生過(guò)程中的作用，本研究通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化等生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)技術(shù)克隆星油藤PvoLEC2的基因組序列（gPvoLEC2），利用本氏煙草驗(yàn)證gPvoLEC2促進(jìn)植物再生的功能，并且對(duì)星油藤毛狀根中的gPvoLEC2的功能進(jìn)行研究。系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)分析表明，星油藤等大戟科植物與擬南芥、水稻、楊樹(shù)的LAV亞家族中LEC2-ABI3亞群比較保守。表達(dá)分析顯示，PvoLEC2僅在星油藤種子發(fā)育晚期（50～65"DAP）微弱表達(dá)，且B3結(jié)構(gòu)域的基序及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)保守。過(guò)表達(dá)gPvoLEC2導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因本氏煙草植株矮化、主莖難以長(zhǎng)高、葉片發(fā)育畸形，同時(shí)gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因本氏煙草器官離體培養(yǎng)的再生能力明顯高于野生型，但低于陽(yáng)性對(duì)照——ZmWUS2"amp;"STM轉(zhuǎn)基因本氏煙草，而在星油藤毛狀根中過(guò)表達(dá)gPvoLEC2導(dǎo)致其縮短、增粗。本研究結(jié)果表明星油藤PvoLEC2的基因組序列是一段具有促進(jìn)植物再生的功能序列，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致植物發(fā)育畸形。

關(guān)鍵詞：星油藤；PvoLEC2；LAV亞家族；植物再生；本氏煙草中圖分類號(hào)：S565.9""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Identification"of"Members"of"the"LAV"Subfamily"in"Woody"Oil"Crops"Plukenetia"volubilis"L."and"the"Function"of"Regeneration-related"Gene"PvoLEC2

DENG"Shiling1，2，"MO"Jinhui1，2，"YU"Jingjing2，"CHEN"Yingda2，3，"MA"Shitao1，2，"LU"Yuandong1，2，"WANG"Yi1，2*

1."Key"Laboratory"of"Fast-growing"Timber"Breeding"in"Central"and"South"China，"National"Forestry"and"Grassland"Administration，"Nanning，"Guangxi"530000，"China;"2."College"of"Forestry，"Guangxi"University，"Nanning，"Guangxi"530000，"China;"3."Key"Laboratory"of"Cultivation"and"Utilisation"of"Subtropical"Plantation"Forests"in"Guangxi"Colleges"and"Universities，"Nanning，"Guangxi"530000，"China

Abstract："LEC2"is"an"important"member"of"the"LAV"subfamily"in"the"plant"B3"superfamily"and"plays"a"significant"regulatory"role"in"embryo"development"and"meristem"maintenance."To"explore"the"function"of"the"PvoLEC2"in"the"cell"regeneration"of"Plukenetia"volubilis，"the"genomic"sequence"of"PvoLEC2"（gPvoLEC2）"was"cloned"through"phylogenetic"analysis"and"molecular"biology"techniques."The"function"of"gPvoLEC2"in"promoting"plantnbsp;regeneration"was"verified"in"Nicotiana"benthamiana，"and"the"function"of"gPvoLEC2"was"studied"in"P."volubilis"hairy"roots."Phylogenetic"and"gene"structure"analysis"indicated"that"the"LEC2-ABI3"subfamily"of"Euphorbiaceae"plants"such"as"P."volubilis，"and"Arabidopsis"thaliana，"Oryza"sativa，"Populus"spp."were"relatively"conserved."Expression"analysis"showed"that"PvoLEC2"was"only"weakly"expressed"in"the"late"stage"of"P."volubilis"seed"development"（50-65"DAP），"and"the"motifs"and"key"amino"acid"sites"of"the"B3"domain"were"conserved."Overexpression"of"gPvoLEC2"led"to"dwarfing"of"transgenic"N."benthamiana"plants，"difficulty"in"the"growth"of"the"main"stem，"and"abnormal"leaf"development."At"the"same"time，"the"regeneration"ability"of"gPvoLEC2"transgenic"N."benthamiana"organs"in"vitro"was"significantly"higher"than"that"of"the"wild"type，"but"lower"than"that"of"the"positive"control-ZmWUS2"amp;"STM"transgenic"N."benthamiana."Overexpression"of"gPvoLEC2"in"P."volubilis"hairy"roots"led"to"their"shortening"and"thickening."The"results"indicate"that"the"genomic"sequence"of"PvoLEC2"is"a"functional"sequence"that"promotes"plant"regeneration，"but"it"also"causes"abnormal"development.

Keywords："Plukenetia"volubilis"L.;"PvoLEC2;"LAV"subfamily;"plant"regeneration;"Nicotiana"benthamiana

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.006

星油藤（Plukenetia"volubilis"L.）是大戟科（Euphorbiaceaec）多年生木質(zhì)藤本植物，又名美藤果、南美油藤、印奇果等，原產(chǎn)于南美洲的熱帶雨林，是一種熱帶油料作物，與油用牡丹（Paeonia"suffruticosa）、元寶楓（Acer"truncatum"Bunge）并稱為三大新興木本油料作物[1]。冷榨的星油藤油有豐富的亞麻酸、亞油酸、維生素E及多種微量元素，是一種優(yōu)秀的新資源食品[2-3]，在食用和藥用方面均有廣闊的應(yīng)用前景[2，"4]。同時(shí)，星油藤的種植周期短于油茶樹(shù)（Camellia"oleifera"Abel）、油橄欖樹(shù)（Olea"europaea"L.）等木本油料植物，在種植當(dāng)年就可收獲果實(shí)[2，"5]。但由于星油藤細(xì)胞再生比較困難，限制了該物種的遺傳改良。提高星油藤再生效率將有助于利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)造高產(chǎn)、多抗、環(huán)境友好的新品種，從而保證我國(guó)星油藤產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

LAV"[LEAFY"COTYLEDON2"（LEC2）–ABS CISIC"ACID"INSENSITIVE3"（ABI3）–VAL"（VP1/"ABI3-LIKE）]亞家族屬于B3超家族，由LEC2-"ABI3亞群和VAL亞群組成。在擬南芥（Arabidopsis"thaliana）中LAV亞家族包含6個(gè)基因，LEC2-"ABI3亞群的LEAFY"COTYLEDON2"（LEC2）、ABSCISIC"ACID"INSENSITIVE3"（ABI3）、FUSCA3"（FUS3）以及VAL亞群的VAL1、VAL2、VAL3。LEC2-ABI3亞群的基因在種子發(fā)育過(guò)程中起重要作用，這些基因在種子中高水平表達(dá)，而在其他植物器官中的表達(dá)量較低。ABI3在種子發(fā)育過(guò)程中調(diào)控脫落酸響應(yīng)基因，參與種子萌發(fā)過(guò)程。LEC2和FUS3基因能夠促進(jìn)種子胚胎發(fā)育，F(xiàn)US3參與種子成熟以及種子儲(chǔ)存蛋白表達(dá)等過(guò)程，LEC2通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素生物合成相關(guān)基因誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生[6]。研究表明，F(xiàn)US3或LEC2的過(guò)表達(dá)會(huì)使?fàn)I養(yǎng)器官（或組織）出現(xiàn)胚性特征[7-8]，如轉(zhuǎn)基因擬南芥真葉具有子葉特征，無(wú)表皮毛等。與LEC2-ABI3亞群不同，VAL亞群的基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，在多個(gè)植物器官中表達(dá)，抑制細(xì)胞再生。當(dāng)前對(duì)VAL亞群的3個(gè)成員中研究較多的是VAL1和VAL2[9]。val1val2雙突變體植株在根和莖上長(zhǎng)出胚性愈傷組織，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FUS3和LEC2在val1val2雙突變體中顯著上調(diào)表達(dá)，這表明VAL1、VAL2是植物組織再生的負(fù)調(diào)控因子[10]。

LEC2基因是LAV亞家族中被充分研究的基因之一，最初是在模式植物擬南芥中過(guò)表達(dá)LEC2基因發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生[8]。研究表明LEC2過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎產(chǎn)生的原因可能是LEC2基因能夠誘導(dǎo)IPA-YUC生長(zhǎng)素合成途徑中YUC1、YUC4和YUC10等關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)[6]。同時(shí)，過(guò)表達(dá)LEC2還可以有效提高種子含油量，在擬南芥中過(guò)表達(dá)蓖麻（Ricinus"communis"L.）RcLEC2基因，能激活油體蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，種子含油量增加約2.7倍[11]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)木本植物的LEC2也具有促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的功能，在可可（Theobroma"cacao"L.）子葉中過(guò)表達(dá)TcLEC2可以顯著增加體細(xì)胞胚胎發(fā)生的頻率[12]，在木薯（Manihot"esculenta"Crantz）中過(guò)表達(dá)MeLEC2，轉(zhuǎn)基因木薯成熟葉的葉肉細(xì)胞可通過(guò)體細(xì)胞胚途徑誘導(dǎo)出再生芽[13]。

在破解玉米（Zea"mays"L.）、高粱（Sorghum"bicolor"L.）、小麥（Triticum"aestivum"L.）等作物遺傳轉(zhuǎn)化障礙的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，具有再生功能的發(fā)育調(diào)節(jié)基因通常來(lái)源于WUSCHEL-RELATED"HOMEOBOX"（WOX）、APETALA2"/ETHYLENE-"RESPONSIVE"FACTOR"（AP2/ERF）等基因家族，很少關(guān)注LAV亞家族。前期研究表明，星油藤的遺傳轉(zhuǎn)化可誘導(dǎo)出轉(zhuǎn)基因愈傷，但難以從這些轉(zhuǎn)基因愈傷中誘導(dǎo)出再生芽或體細(xì)胞胚胎。本研究從星油藤、蓖麻等大戟科植物中鑒定LAV亞家族，分析該基因家族成員在大戟科植物與擬南芥、水稻（Oryza"sativa"L.）等模式物種間的保守性，同時(shí)利用本氏煙草（Nicotiana"benthamiana）驗(yàn)證PvoLEC2的基因組序列（gPvoLEC2）的再生功能，并且在星油藤的毛狀根中對(duì)gPvoLEC2的功能進(jìn)行初步研究，為提高星油藤的再生能力以及遺傳改良提供優(yōu)質(zhì)的候選基因。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""本氏煙草種子經(jīng)75%乙醇和1%次氯酸鈉溶液消毒后播種于MS固體培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)30"d后，葉片可用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。星油藤種子由云南普洱市寧洱哈尼族彝族自治縣農(nóng)戶提供。星油藤種子去殼后經(jīng)75%乙醇和2.5%次氯酸鈉溶液消毒后播種于WPM培養(yǎng)基，培養(yǎng)7～10"d時(shí)可用于轉(zhuǎn)基因星油藤毛狀根誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌株由北京林業(yè)大學(xué)孟冬教授惠贈(zèng)，根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2""數(shù)據(jù)來(lái)源""星油藤、蓖麻、橡膠樹(shù)[Hevea"brasiliensis"（Willd."ex"A."Juss.）"Müll."Arg.]、小桐子（Jatropha"curcas"L.）、木薯等大戟科物種全基因數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均來(lái)自EupDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//"eupdb.liu-lab.com/）；擬南芥LAV亞家族序列來(lái)自擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）；水稻、楊樹(shù)（Populus"spp.）、玉米LAV亞家族序列及數(shù)據(jù)來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2""方法

1.2.1""LAV基因家族的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析""從TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中分別下載擬南芥LAV家族各成員的氨基酸序列，在Geneious"prime"2021本地BLAST插件的星油藤、蓖麻、小桐子等物種本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)（參數(shù)為Elt;1e–10），獲得與擬南芥相似度較高的LAV序列信息，作為候選基因。從Pfam（http：//"pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載含有B3基因家族的特征結(jié)構(gòu)域PF00847的隱馬爾科夫模型，使用HMMER"3.0（http：//hmmer.janelia.org）在線軟件建立HMM模型進(jìn)行同源序列的鑒定。利用CDD"（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和ExPASy"Proteomics"Server"（https：//prosite.expasy.org/scan-"prosite/）在線軟件確認(rèn)候選序列具有完整的B3特征結(jié)構(gòu)域的LAV亞家族基因。使用Mega"11.0軟件，采用最大似然法（maximum"likelihood，ML）生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap重復(fù)1000次。

1.2.2""表達(dá)分析""利用大戟科植物EupDB公共數(shù)據(jù)庫(kù)中星油藤不同組織器官的RNA-seq數(shù)據(jù)，對(duì)星油藤LAV亞家族基因在不同組織器官[根（root）、莖（stem）、葉（leaf）、雌花序（female"inflorescence）、雄花序（male"inflorescence）、果（fruit）和種子（seed）]的表達(dá)進(jìn)行分析。提取基因在各組織器官表達(dá)的FPKM值，利用GraphPad"Prism"8.0[14]軟件繪制表達(dá)熱圖。

1.2.3""基因克隆及過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建""設(shè)計(jì)特異性引物（gPvoLEC2-F："ttttctgattaacagggtaccATG GAGAACCTTTTTTCACTTTTGT，"gPvoLEC2-R："tcttcatcttcatatggatccCTAAGCGCTGCACAAGTCT TCC；小寫字母為Infusion同源臂），利用In-fusion技術(shù)將gPvoLEC2克隆至pW502載體獲得UBI10pro：：gPvoLEC2的過(guò)表達(dá)載體（圖1）。

1.2.4""本氏煙草遺傳轉(zhuǎn)化及離體誘導(dǎo)""分別挑取攜帶目的基因UBI10pro：：gPvoLEC2（簡(jiǎn)稱gPvoLEC2）、NOSpro：：ZmWUS2"amp;"CmYLCVpro：：STM（簡(jiǎn)稱ZmWUS2"amp;"STM，圖1）的根癌農(nóng)桿菌GV3101單菌落接種于含50"mg/L"卡那霉素（kanamycin）和20"mg/L利福平（rifampicin）的LB液體培養(yǎng)基中，在28"℃、220"r/min的條件下振蕩培養(yǎng)至OD=0.6～1.0。將菌液轉(zhuǎn)移至50"mL離心管，4000"r/min離心10"min，棄上清液，用含100"μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基（pH"5.8）重懸農(nóng)桿菌至OD=0.3～0.4。本氏煙草的侵染流程參照J(rèn)ANSING等[15]的方法實(shí)施。

收集T0代gPvoLEC2、ZmWUS2"amp;"STM轉(zhuǎn)基因煙草植株種子（T1代），經(jīng)75%乙醇和1%次氯酸鈉溶液消毒后播種于MS固體培養(yǎng)基上。待轉(zhuǎn)基因本氏煙草幼苗生長(zhǎng)至12"d，將其切分為3種外植體（子葉、下胚軸和根），并以相同生長(zhǎng)條件下的野生型本氏煙草作為對(duì)照。將3種外植體分別放入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含1"mg/L"6-BA、0.1"mg/L"NAA、200"mg/L頭孢噻肟鈉、100"mg/L特美汀的MS固體培養(yǎng)基）中誘導(dǎo)，培養(yǎng)25"d時(shí)統(tǒng)計(jì)再生芽誘導(dǎo)情況。

1.2.5""星油藤轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導(dǎo)""利用攜帶目的基因35S：：DsRed2（簡(jiǎn)稱DsRed2，圖1）、35S：：gPvoLEC2的發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染星油藤幼苗，參考俞璟菁等[16]的方法誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因毛狀根，并稍作修改。星油藤幼苗裹菌后放入含2"mg/L"6-BA、0.2"mg/L"IBA、400"mg/L頭孢噻肟鈉、100"mg/L特美汀的WPM固體培養(yǎng)基，在26"℃暗培養(yǎng)5"d后，轉(zhuǎn)入26"℃、16"h光照/8"h黑暗的光周期條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因星油藤毛狀根。

2""結(jié)果與分析

2.1""大戟科物種LAV基因家族基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化顯示，星油藤LEC2-ABI3亞群中LEC2（PvoB3-69）、ABI3（PvoB3-03）、FUS3

（PvoB3-18）與蓖麻、小桐子、橡膠樹(shù)等大戟科物種的LEC2-ABI3亞群的基因均為單拷貝（圖2）。玉米LEC2和ABI3均有2個(gè)成員，不存在FUS3，但在水稻中存在OsFUS3a和OsFUS3b兩個(gè)成員。VAL亞群變化較大，供試的5種大戟科物種中的VAL3數(shù)量較少，僅有蓖麻中有1個(gè)RcVAL3；但存在多個(gè)VAL1和VAL2成員，如橡膠樹(shù)、木薯。星油藤VAL亞群中僅含有PvoB3-06（VAL2）和PvoB3-27（VAL1）2個(gè)成員。從基因結(jié)構(gòu)（圖2）來(lái)看，LEC2-ABI3亞群比較保守，星油藤等大戟科植物以及擬南芥、楊樹(shù)等木本植物均有6個(gè)外顯子，但玉米ZmLEC2a、ZmLEC2b以及水稻OsLEC2均含有9個(gè)外顯子。VAL亞群變異幅度較大，VAL1和VAL2兩個(gè)進(jìn)化支含有12～13個(gè)外顯子。在VAL3進(jìn)化枝中，擬南芥VAL3含有8個(gè)外顯子，水稻和玉米的VAL3成員含有12個(gè)外顯子，而蓖麻的RcVAL3有14個(gè)外顯子。由此可知，星油藤LAV亞家族中LEC2-ABI3亞群的數(shù)量和基因結(jié)構(gòu)與其他雙子葉植物相同，功能可能比較保守。

2.2""星油藤LAV亞家族表達(dá)分析

為了研究星油藤LAV亞家族成員的表達(dá)特異性，對(duì)鑒定得到的LAV亞家族基因在根、莖、莖尖、葉、雌花序、雄花序和種子等不同組織器官中的表達(dá)特征進(jìn)行分析。結(jié)果（圖3）表明，PvoABI3、PvoFUS3在開(kāi)花后50～65"d的種子內(nèi)特異性表達(dá)，且PvoABI3的表達(dá)量很高，PvoLEC2在各個(gè)組織部位的表達(dá)量均較低。PvoVAL1在果中特異性表達(dá)，在種子中也有少量低豐度的表達(dá)；PvoVAL2在根系以及雄花中表達(dá)，其中在根中的表達(dá)量較高，在莖和果中也有低豐度表達(dá)。研究表明，擬南芥LEC2在球形胚等胚胎發(fā)育早期表達(dá)，調(diào)控胚胎的形態(tài)建成。本研究選取星油藤果實(shí)發(fā)育早期的樣品提取RNA，仍未檢測(cè)到PvoLEC2表達(dá)，推測(cè)該基因可能在星油藤胚胎發(fā)育更早期表達(dá)。因此，克隆該基因的基因組序列g(shù)PvoLEC2用于后期功能研究。gPvoLEC2基因全長(zhǎng)序列為2896"bp，基因結(jié)構(gòu)如圖2中PvoB3-69所示，包含6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子（GenBank"accession："PP454233）。

2.3""星油藤PvoLEC2及其同源基因多重序列比對(duì)分析

以擬南芥RAV1的B3結(jié)構(gòu)域?yàn)槟０澹瑢?duì)星油藤PvoLEC2與橡膠、木薯、蓖麻、小桐子等物種的同源蛋白B3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域由7個(gè)β-折疊和2個(gè)α-螺旋組成（圖4）。β-折疊內(nèi)部的疏水鏈核心氨基酸Leu267、Ile282、Leu284、Val307、Trp318、Leu320、Phe322、Leu335、Leu354、Leu356、Leu366、Phe368在星油藤PvoLEC2與其他物種同源蛋白B3結(jié)構(gòu)域中是保守的，α-螺旋核心氨基酸Thr339、Phe342在星油藤PvoLEC2與其他物種同源蛋白B3結(jié)構(gòu)域中也是保守的。這表明不同物種LEC2同源蛋白的B3結(jié)構(gòu)域的功能可能相同。

2.4""過(guò)表達(dá)gPvoLEC2促進(jìn)轉(zhuǎn)基因本氏煙草再生

為了探究過(guò)表達(dá)gPvoLEC2是否具有促進(jìn)再生的功能，對(duì)10"d的gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因無(wú)菌苗進(jìn)行器官離體培養(yǎng)，以先前已經(jīng)證明具有再生能力的ZmWUS2"amp;"STM轉(zhuǎn)基因本氏煙草作為陽(yáng)性對(duì)照。離體培養(yǎng)25"d后發(fā)現(xiàn)（表1，圖5），WT的72片子葉中8片子葉能夠誘導(dǎo)出再生芽，誘導(dǎo)率為11.1%。gPvoLEC2的126片子葉中66片子葉能夠誘導(dǎo)出再生芽，誘導(dǎo)率為52.4%，且誘導(dǎo)出的再生芽多集中在葉基部。ZmWUS2"amp;"STM的84片子葉中78片子葉能夠誘導(dǎo)出再生芽，誘導(dǎo)率為92.9%，再生芽誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于野生型本氏煙草和gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因本氏煙草子葉。ZmWUS2"amp;"STM轉(zhuǎn)基因煙草子葉上誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)基因芽更為密集，子葉的各個(gè)部位均能誘導(dǎo)出再生芽，并且多集中在子葉的近軸面。

對(duì)胚軸的再生情況統(tǒng)計(jì)顯示，gPvoLEC2的63個(gè)胚軸中31個(gè)胚軸能夠誘導(dǎo)出再生芽，誘導(dǎo)率為49.2%；WT的36個(gè)胚軸中5個(gè)胚軸能夠誘導(dǎo)出再生芽，誘導(dǎo)率為13.9%；ZmWUS2"amp;"STM的42個(gè)胚軸中21個(gè)胚軸能夠誘導(dǎo)出再生芽，誘導(dǎo)率為50.0%。野生型本氏煙草胚軸膨大不明顯，再生芽的誘導(dǎo)數(shù)也極少，gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因本氏煙草和ZmWUS2"amp;"STM轉(zhuǎn)基因煙草胚軸的轉(zhuǎn)基因芽誘導(dǎo)率相當(dāng)，且遠(yuǎn)高于野生型本氏煙草胚軸的再生芽誘導(dǎo)率。gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因本氏煙草胚軸和ZmWUS2"amp;"STM轉(zhuǎn)基因煙草胚軸誘導(dǎo)的再生芽主要集中在兩端的切口處。

對(duì)主根的再生情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，野生型本氏煙草根愈傷增殖速度最慢，36條根中2條根能夠誘導(dǎo)出再生芽，誘導(dǎo)率為5.6%，再生芽誘導(dǎo)效率最低。gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因本氏煙草根愈傷增殖速度最快，63條根中10條根能夠誘導(dǎo)出再生芽，誘導(dǎo)率為15.9%，再生芽誘導(dǎo)率高于ZmWUS2"amp;"STM和WT。ZmWUS2"amp;"STM的42條根中3條根能夠誘導(dǎo)出再生芽，誘導(dǎo)率為7.1%。以上結(jié)果表明，相較于野生型本氏煙草，gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因本氏煙草子葉、胚軸以及主根的再生芽誘導(dǎo)能力均有所提升，即gPvoLEC2具有促進(jìn)植物再生的功能。

2.5""過(guò)表達(dá)gPvoLEC2導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因本氏煙草發(fā)育畸形

為探究過(guò)表達(dá)gPvoLEC2以及ZmWUS2"amp;"STM對(duì)本氏煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響，將ZmWUS2"amp;"STM和gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因本氏煙草的種子播種至土壤中，38"d后對(duì)T1代植株進(jìn)行表型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因本氏煙草體型與野生型存在較大差別，地上部分主莖縮短，很難伸長(zhǎng)，植株明顯矮化。gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因本氏煙草T1代植株葉片圓肥，形態(tài)不規(guī)則，部分畸形且葉脈偏心、不突出，革質(zhì)化。T1代ZmWUS2"amp;"STM轉(zhuǎn)基因本氏煙草呈侏儒狀，體型大小趨近于WT幼年期，莖不伸長(zhǎng)，葉片簇生，葉小而密，植株地上部分高度通常為3～5"cm，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)也無(wú)明顯生長(zhǎng)趨勢(shì)，葉片極小且密，葉片無(wú)明顯卷曲（圖6）。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)gPvoLEC2、ZmWUS2"amp;"STM都會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因本氏煙草發(fā)育畸形，但表型變異并不一致。

2.6""過(guò)表達(dá)gPvoLEC2影響星油藤毛狀根發(fā)育

為探究過(guò)表達(dá)gPvoLEC2對(duì)星油藤生長(zhǎng)發(fā)育的影響，使用攜帶目的基因DsRed2、gPvoLEC2、ZmWUS2"amp;"STM的發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導(dǎo)星油藤轉(zhuǎn)基因毛狀根。最終成功誘導(dǎo)出DsRed2和gPvoLEC2的星油藤轉(zhuǎn)基因毛狀根，未能誘導(dǎo)出ZmWUS2"amp;"STM的星油藤轉(zhuǎn)基因毛狀根。由圖7可知，gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因星油藤毛狀根與DsRed2轉(zhuǎn)基因毛狀根存在較為明顯的區(qū)別，相較于3條獨(dú)立的DsRed2轉(zhuǎn)基因星油藤毛狀根，3條獨(dú)立的gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因星油藤毛狀根均出現(xiàn)了較為明顯的膨大和縮短，部分毛狀根出現(xiàn)卷曲。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因毛狀根很緩慢的伸長(zhǎng)，與DsRed2轉(zhuǎn)基因毛狀根的細(xì)長(zhǎng)表型呈現(xiàn)出明顯的區(qū)別?？梢?jiàn)，過(guò)表達(dá)gPvoLEC2抑制星油藤毛狀根伸長(zhǎng)，這與過(guò)表達(dá)抑制本氏煙草莖伸長(zhǎng)的表型類似，但是否促進(jìn)毛狀根再生還有待研究。

3""討論

3.1""LAV亞家族基因具的保守性

對(duì)擬南芥、水稻、楊樹(shù)、玉米以及星油藤、蓖麻、橡膠樹(shù)、小桐子、木薯等大戟科物種LAV基因家族的基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示星油藤等大戟科植物的LEC2-ABI3亞群比較保守。前期研究表明ABI3的基因結(jié)構(gòu)在陸生植物進(jìn)化過(guò)程中相當(dāng)保守，幾乎所有陸生植物ABI3基因的內(nèi)含子相位都是一致的，F(xiàn)US3和LEC2在進(jìn)化的過(guò)程中也具有較高的保守性[17]，與本研究結(jié)果一致。雖然已報(bào)道LEC2-ABI3亞群的ABI3、FUS3、LEC2與胚胎發(fā)育有關(guān)，但ABI3參與調(diào)控植物激素ABA信號(hào)傳導(dǎo)[18]，是種子萌發(fā)的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控基因[19-20]。FUS3基因是調(diào)控油脂合成的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子之一，在擬南芥中FUS3基因在油脂積累方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[21]。LEC2在多個(gè)物種中的同源基因均能促進(jìn)體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變、誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，如蘿卜（Raphanus"sativus"L.）[22]、可可、木薯等。因此，本研究推測(cè)LEC2在星油藤中的同源基因PvoLEC2可能也具有促進(jìn)再生的功能。

3.2""利用模式植物快速篩查具有再生功能的發(fā)育調(diào)節(jié)基因

本研究通過(guò)本氏煙草驗(yàn)證了星油藤gPvoLEC2的再生功能，對(duì)于挖掘林木中與再生相關(guān)的發(fā)育調(diào)節(jié)基因提供了新思路。近年來(lái)利用BABY"BOOM（BBM）和WUSCHEL（WUS）等促進(jìn)細(xì)胞再生功能的發(fā)育調(diào)節(jié)基因顯著提高了玉米、高粱等作物的遺傳轉(zhuǎn)化效率[23]，這些作物在以往的研究中是難以轉(zhuǎn)化的。這些研究案例具備2個(gè)特點(diǎn)：一是使用的發(fā)育調(diào)節(jié)基因大多是已知功能的同源基因，如BBM和WUS；二是被轉(zhuǎn)化的物種具備基本的遺傳轉(zhuǎn)化條件。但是，在林木中使用發(fā)育調(diào)節(jié)基因促進(jìn)遺傳轉(zhuǎn)化難以獲得成功，可能是已知功能的發(fā)育調(diào)節(jié)基因在林木中并不一定可行。如植物細(xì)胞全能性的關(guān)鍵調(diào)控因子BBM基因，在甘藍(lán)型油菜（Brassica"napus）中過(guò)表達(dá)BnBBM可誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生[24]，在擬南芥和毛白楊

（Populus"tomentosa"Carrière）中過(guò)表達(dá)BnBBM均能誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的形成[24-25]，在再生困難的辣椒中過(guò)表達(dá)BnBBM也能有效地促進(jìn)再生[25]，但林木中目前僅有蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化借助MdBBM取得了成功[26]。另外，林木中普遍缺乏基本的遺傳轉(zhuǎn)化體系，直接使用發(fā)育調(diào)節(jié)基因破解林木遺傳轉(zhuǎn)化障礙需要逐一嘗試，工作量過(guò)大且難以成功。

據(jù)報(bào)道，常用的發(fā)育調(diào)節(jié)基因有SOMATIC"EMBRYOGENESIS"RECEPTOR-LIKE"KINASE"（SERK）、LEC2、BBM、WUS、SHOOT-MERIST EMLESS"（STM）等[8，"23，"27-29]。星油藤中這些發(fā)育調(diào)節(jié)基因的功能還無(wú)法確定，并且遺傳轉(zhuǎn)化步驟繁雜，轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)，將這些發(fā)育調(diào)節(jié)基因不經(jīng)篩選直接應(yīng)用的可行性較差?？紤]到本氏煙草在基礎(chǔ)生物學(xué)中的諸多優(yōu)勢(shì)，使用具備再生功能的ZmWUS2"amp;"STM轉(zhuǎn)基因煙草作為陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證gPvoLEC2的再生功能，結(jié)果表明gPvoLEC2轉(zhuǎn)基因本氏煙草的子葉、胚軸和主根離體培養(yǎng)的再生芽誘導(dǎo)率相較于野生型本氏煙草均有所提高。

3.3""gPvoLEC2抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育

在本氏煙草和星油藤的毛狀根中過(guò)表達(dá)gPvoLEC2均導(dǎo)致植物（器官）發(fā)育異常，轉(zhuǎn)基因本氏煙草莖縮短、明顯矮化、葉片畸形，轉(zhuǎn)基因星油藤毛狀根縮短、增粗，二者表型類似。此前有研究顯示在煙草（Nicotiana"tabacum"L.）中過(guò)表達(dá)LEC2基因，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出胚軸縮短，子葉縮小甚至畸形的現(xiàn)象[30-31]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)大豆GmLEC2基因也表現(xiàn)出相似的表型，植株矮化，蓮座葉變小[32]。在可可中過(guò)表達(dá)TcLEC2基因，雖然能夠提高體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的效率，但這些體細(xì)胞胚胎生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到影響，難以發(fā)育成完整植株[12]。在可可中過(guò)表達(dá)TcBBM可以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生，但是持續(xù)的過(guò)表達(dá)TcBBM影響可可的正常生長(zhǎng)發(fā)育，誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚胎也無(wú)法發(fā)育成完整植株[33]。在蘋果（Malus"pumila"Mill）中過(guò)表達(dá)MdBBM也產(chǎn)生了多效性影響，一方面MdBBM顯著提高了蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化效率，另一方面轉(zhuǎn)基因蘋果幼苗難以生根，根系的形態(tài)產(chǎn)生變化，生長(zhǎng)發(fā)育受到影響[26]。為獲得正常發(fā)育的植株，在玉米中過(guò)表達(dá)BBM和WUS2，有效地促進(jìn)了再生的同時(shí)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行更換，獲得了健康可育的植株[34]。還有研究表明，可以通過(guò)雌二醇誘導(dǎo)的系統(tǒng)來(lái)控制發(fā)育調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株后關(guān)閉發(fā)育調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而避免發(fā)育調(diào)節(jié)基因負(fù)面效應(yīng)，該策略在不同的物種中得到了有效的應(yīng)用[26，"35]。因此，如何削減gPvoLEC2負(fù)面效應(yīng)是該基因在星油藤基因工程的應(yīng)用過(guò)程中需要攻克的難點(diǎn)。

4""結(jié)論

本研究通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化、氨基酸序列多重比對(duì)，結(jié)合本氏煙草功能驗(yàn)證，從星油藤LAV亞家族中鑒定了1個(gè)促進(jìn)細(xì)胞再生的發(fā)育調(diào)節(jié)基因gPvoLEC2，這表明在缺乏基本遺傳轉(zhuǎn)化的林木中，利用本氏煙草驗(yàn)證發(fā)育調(diào)節(jié)基因的再生功能行之有效。在后續(xù)研究中，探討PvoLEC2的編碼區(qū)序列以及LAV亞家族其他成員在星油藤再生過(guò)程中的作用也非常必要。

參考文獻(xiàn)

• 尹丹丹，"李珊珊，"吳倩，"馮成庸，"李冰，"王倩玉，"王亮生，"徐文忠."我國(guó)6種主要木本油料作物的研究進(jìn)展[J]."植物學(xué)報(bào)，"2018，"53（1）："110-125.YIN"D"D，"LI"S"S，"WU"Q，"FENG"C"Y，"LI"B，"WANG"Q"Y，"WANG"L"S，"XU"W"Z."Research"progress"of"6"main"woody"oil"crops"in"China[J]."Chinese"Bulletin"of"Botany，"2018，"53（1）："110-125."（in"Chinese）

[2]"謝藍(lán)華，"陳佳，"張曉琴，"張嘉怡，"杜冰，"陳軍."對(duì)新資源食品——美藤果油的一些研究[J]."云南科技管理，"2015，"28（1）："81-83."XIE"L"H，"CHEN"J，"ZHANG"X"Q，"ZHANG"J"Y，"DU"B，"CHEN"J."Some"studies"on"Plukenetia"volubilis"oil，"a"new"resource"food[J]."Yunnan"Science"and"Technology"Management，"2015，"28（1）："81-83."（in"Chinese）

[3]"中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部公告[J]."中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部公報(bào)，"2013（1）："1-3.Announcement"of"Ministry"of"Health"of"the"People's"Republic"of"China[J]."Announcement"of"Ministry"of"Health"of"the"People's"Republic"of"China，"2013（1）："1-3."（in"Chinese）

[4]"董玉玲，"陳茂盛，"王秀蘭，"牛龍見(jiàn)，"付乾堂，"徐增富."木本油料作物美藤果組織培養(yǎng)植株再生體系的建立[J]."分子植物育種，nbsp;2016，"14（2）："462-470.DONG"Y"L，"CHEN"M"S，"WANG"X"L，"NIU"L"J，"FU"Q"T，"XU"Z"F."Establishment"of"in"vitro"regeneration"system"of"woody"oil"crop"Plukenetia"volubilis[J]."Molecular"Plant"Breeding，"2016，"14（2）："462-470."（in"Chinese）

[5]"張嘉怡，"杜冰，"謝藍(lán)華，"陳軍，"陳佳，"楊公明."綠色新資源食品："美藤果油[J]."中國(guó)油脂，"2013，"38（7）："1-4.ZHANG"J"Y，"DU"B，"XIE"L"H，"CHEN"J，"CHEN"J，"YANG"G"M."A"new"resource"green"food："Sacha"inchi"oil[J]."China"Oils"and"Fats，"2013，"38（7）："1-4."（in"Chinese）

• WóJCIKOWSKA"B，"JASKó?A"K，"G?SIOREK"P，"MEUS"M，"NOWAK"K，"GAJ"M"D."LEAFY"COTYLEDON2"（LEC2）"promotes"embryogenic"induction"in"somatic"tissues"of"Arabidopsis，"via"YUCCA-mediated"auxin"biosynthesis[J]."Planta，"2013，"238（3）："425-440.
• TSUCHIYA"Y，"NAMBARA"E，"NAITO"S，"MCCOURT"P."The"FUS3"transcription"factor"functions"through"the"epidermal"regulator"TTG1"during"embryogenesis"in"Arabidopsis[J]."The"Plant"Journal，"2004，"37："73-81.
• STONE"S"L，"KWONG"L"W，"YEE"K"M，"PELLETIER"J，"LEPINIEC"L，"FISCHER"R"L，"GOLDBERG"R"B，"HARADA"J"J."LEAFY"COTYLEDON2"encodes"a"B3"domain"transcription"factor"that"induces"embryo"development[J]."Proceedings"of"the"National"Academy"of"Sciences"of"the"United"States"of"America，"2001，"98（20）："11806-11811.
• 馬瑞景，"張晴雯，"龔霞，"許亞飛，"袁文雅."擬南芥B3結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)VALs互作轉(zhuǎn)錄因子的篩選[J]."湖北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），"2020，"42（6）："597-602.MA"R"J，"ZHANG"Q"W，"GONG"X，"XU"Y"F，"YUAN"W"Y."Screening"of"transcription"factors"interacting"with"VALs"containing"B3"domain"in"Arabidopsis"thaliana[J]."Journal"of"Hubei"University"（Natural"Science），"2020，"42（6）："597-602."（in"Chinese）
• SWAMINATHAN"K，"PETERSON"K，"JACK"T."The"plant"B3"superfamily[J]."Trends"in"Plant"Science，"2008，"13（12）："647-655.
• KIM"H"U，"JUNG"S"J，"LEE"K"R，"KIM"E"H，"LEE"S"M，"ROH"K"H，"KIM"J"B."Ectopic"overexpression"of"castor"bean"LEAFY"COTYLEDON2"（LEC2）"in"Arabidopsis"triggers"the"expression"of"genes"that"encode"regulators"of"seed"maturation"and"oil"body"proteins"in"vegetative"tissues[J]."FEBS"Open"Bio，"2013，"4："25-32.

[12]"ZHANG"Y"F，"CLEMENS"A，"MAXIMOVA"S"N，"GUILTINAN"M"J"."The"Theobroma"cacao"B3"domain"transcription"factor"TcLEC2"plays"a"duel"role"in"control"of"embryo"development"and"maturation[J]."BMC"Plant"Biology，"2014，"14："106.

[13]"BRAND"A，"QUIMBAYA"M，"TOHME"J，"AGUIRRE"P"C."Arabidopsis"LEC1"and"LEC2"orthologous"genes"are"key"regulators"of"somatic"embryogenesis"in"cassava[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2019，"10："673.

[14]"CAI"Y，"SUN"M，"CORKE"H."Identification"and"distribution"of"simple"and"acylated"betacyanins"in"the"Amaranthaceae[J]."Journal"of"Agricultural"and"Food"Chemistry，"2001，"49（4）："1971-1978.

[15]"JANSING"J，"SACK"M，"AUGUSTINE"S"M，"FISCHER"R，"BORTESI"L."CRISPR/Cas9-mediated"knockout"of"six"glycosyltransferase"genes"in"Nicotiana"benthamiana"for"the"production"of"recombinant"proteins"lacking"β-1，2-xylose"and"core"α-1，3-fucose[J]."Plant"Biotechnoogyl"Journal，"2019，"17（2）："350-361.

[16]"YU"J"J，"DENG"S"L，"HUANG"H，"MO"J"H，"XU"Z"F，"WANG"Y."Exploring"the"potential"applications"of"the"noninvasive"reporter"gene"RUBY"in"plant"genetic"transformation[J]."Forests，"2023，"14（3）："637.

[17]"唐通."植物中油脂調(diào)節(jié)基因ABSCISIC"ACID"INSENSI TIVE3?FUSCA3和LEAFY"COTYLEDON2的鑒定?系統(tǒng)進(jìn)化和結(jié)構(gòu)特征分析[D]."咸陽(yáng)："西北農(nóng)林科技大學(xué)，"2019.TANG"T."Identification，"evolution"analysis"and"structure"characterization"of"oil-regulating"genes"ABSCISIC"ACIDINSENSITIVE3，"FUSCA3"and"LEAFYCOTYLEDON2"in"plants[D]."Xianyang："Northwest"A"amp;"F"University，"2019."（in"Chinese）

[18]"LOPEZ-MOLINA"L，"MONGRAND"S，"MCLACHLIN"D"T，"CHAIT"B"T，"CHUA"N"H."ABI5"acts"downstream"of"ABI3"to"execute"an"ABA-dependent"growth"arrest"during"germination[J]."The"Plant"Journal，"2002，"32（3）："317-328.

[19]"LIU"X"D，"ZHANG"H，"ZHAO"Y，"FENG"Z"Y，"LI"Q，"YANG"H"Q，"LUAN"S，"LI"J"M，"HE"Z"H."Auxin"controls"seed"dormancy"through"stimulation"of"abscisic"acid"signaling"by"inducing"ARF-mediated"ABI3"activation"in"Arabidopsis[J]."Proceedings"of"the"National"Academy"of"Sciences"of"the"United"States"of"America，"2013，"110（38）："15485-15490.

[20]"HORSTMAN"A，"LI"M"F，"HEIDMANN"I，"WEEMEN"M，"CHEN"B"J，"MUINO"J"M，"ANGENENT"G"C，"BOUTILIER"K."The"BABY"BOOM"transcription"factor"activates"the"LEC1-ABI3-FUS3-LEC2"network"to"induce"somatic"embryogenesis[J]."Plant"Physiology，"2017，"175（2）："848-857.

[21]"ROSCOE"T"T，"GUILLEMINOT"J，"BESSOULE"J"J，"BERGER"F，"DEVIC"M."Complementation"of"seed"maturation"phenotypes"by"ectopic"expression"of"ABSCISIC"ACID"INSENSITIVE3，"FUSCA3"and"LEAFY"COTYLEDON2"in"Arabidopsis[J]."Plant"and"Cell"Physiology，"2015，"56（6）："1215-1228.

[22]"王川藝."蘿卜體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及RsLEC2基因的功能驗(yàn)證[D]."重慶："重慶三峽學(xué)院，"2024.WANG"C"Y."Identification"of"transcription"factors"associated"with"somatic"embryogenesis"and"functional"verification"of"RsLEC2"gene"in"Raphnaus"sativus[D]."Chongqing："Chongqing"Three"Gorges"University，"2024."（in"Chinese）

• LOWE"K，"WU"E，"WANG"N，"WANG"N，"HOERSTER"G，"HASTINGS"C，"CHO"M"J，"SCELONGE"C，"LENDERTS"B，"CHAMBERLIN"M，"CUSHATT"J，"WANG"L"J，"RYAN"L，"KHAN"T，"YIU"J"C，"HUA"W，"YU"M，"BANH"J，"BAO"Z"M，"BRINK"K，"IGO"E，"RUDRAPPA"B，"SHAMSEER"P"M，"BRUCE"W，"NEWMAN"L，"SHEN"B，"ZHENG"P"Z，"BIDNEY"D，"FALCO"C，"REGISTER"J，"ZHAO"Z"Y，"XU"D"P，"JONES"T，"KAMM"W"G."Morphogenic"regulators"Baby"boom"and"Wuschel"improve"monocot"transformation[J]."The"Plant"Cell，"2016，"28（9）："1998-2015.
• BOUTILIER"K，"OFFRINGA"R，"SHARMA"V"K，"KIEFT"H，"OUELLET"T，"ZHANG"L"M，"HATTORI"J，"LIU"C"M，"LAMMEREN"A"A"M，"MIKI"B"L"A，"CUSTERS"J"B"M，"CAMPAGNE"M"M"L."Ectopic"expression"of"BABY"BOOM"triggers"a"conversion"from"vegetative"to"embryonic"growth[J]."The"Plant"Cell，"2002，"14（8）："1737-1749.

[25]"DENG"W，"LUO"K"M，"LI"Z"G，YANG"Y"W."A"novel"method"for"induction"of"plant"regeneration"via"somatic"embryogenesis[J]."Plant"Science，"2009，"177："43-48.

[26]"肖旭."蘋果Baby"Boom基因在遺傳轉(zhuǎn)化和體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的功能鑒定[D]."泰安："山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2022.XIAO"X."Functional"identification"of"apple"Baby"Boom"in"genetic"transformation"and"somatic"embryogenesis[D]."Taian："Shandong"Agricultural"University，"2022."（in"Chinese）

[27]"HECHT"V"R，"VIELLE-CALZADA"J"P，"HARTOG"M"V，"HARTOG"M"V，"SCHMIDT"E"D"L，"BOUTILIER"K，"GROSSNIKLAUS"U，"VRIES"S"C."The"Arabidopsis"somatic"embryogenesis"receptor"Kinase"1"gene"is"expressed"in"developing"ovules"and"embryos"and"enhances"embryogenic"competence"in"culture[J]."Plant"Physiology，"2001，"127（3）："803-816.

[28]"PéREZ-PASCUAL"D，"JIMéNEZ-GUILLEN"D，"VILLANU EVA-ALONZO"H，"SOUZA-PERERA"R，"GODOY-"HERNáNDEZ"G，"Zú?IGA-AGUILAR"J"J."Ectopic"expression"of"the"Coffea"canephora"SERK1"homolog-induced"differential"transcription"of"genesnbsp;involved"in"auxin"metabolism"and"in"the"developmental"control"of"embryogenesis[J]."Physiologia"Plantarum，"2018，"163（4）："530-551.

[29]"LONG"J"A，"MOAN"E"I，"MEDFORD"J"I，"BARTON"M"K."A"member"of"the"KNOTTED"class"of"homeodomain"proteins"encoded"by"the"STM"gene"of"Arabidopsis[J]."Nature，"1996，"379（6560）："66-69.

[30]"LI"K，"WANG"J，"LIU"C"L，"LI"C"S，"QIU"J"J，"ZHAO"C"Z，"XIA"H，"MA"C"L，"WANG"X"J，"LI"P"C."Expression"of"AtLEC2"and"AtIPTs"promotes"embryogenic"callus"formation"and"shoot"regeneration"in"tobacco[J]."BMC"Plant"Biology，"2019，"19（1）："314.

[31]"郭鳳丹."LEC基因促進(jìn)植物體細(xì)胞胚形成及機(jī)理的研究[D]."濟(jì)南："山東師范大學(xué)，"2012.GUO"F"D."Study"on"the"promotion"and"mechanism"of"LEC"gene"in"plant"somatic"embryo"formation[D]."Jinan："Shandong"Normal"University，"2012."（in"Chinese）

[32]"馬彥龍."大豆GmLEC2基因的克隆及再生功能的初步分析[D]."哈爾濱："東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2016.MA"Y"L."Cloning"and"regenerative"function"preliminary"analysis"of"GmLEC2"gene"in"soybean[D]."Harbin："Northeast"Agricultural"University，"2016."（in"Chinese）

[33]"FLOREZ"S"L，"ERWIN"R"L，"MAXIMOVA"S"N，"GUILTINAN"M"J，"CURTIS"W"R."Enhanced"somatic"embryogenesis"in"Theobroma"cacao"using"the"homologous"BABYnbsp;BOOM"transcription"factor[J]."BMC"Plant"Biology，"2015，"15："121.

[34]"LOWE"K，"ROTA"L"M，"HOERSTER"G，"HASTINGS"C，"WANG"N，"CHAMBERLIN"M，"WU"E，"JONES"T，"GORDON-KAMM"W."Rapid"genotype"“independent”"Zea"mays"L."（maize）"transformation"via"direct"somatic"embryogenesis[J]."In"Vitro"Cellular"amp;"Developmental"Biology-plant，"2018，"54（3）："240-252.

[35]"LUTZ"K"A，"MARTIN"C，"KHAIRZADA"S，"MALIGA"P."Steroid-inducible"BABY"BOOM"system"for"development"of"fertile"Arabidopsis"thaliana"plants"after"prolonged"tissue"culture[J]."Plant"Cell"Report，"2015，"34（10）："1849-1856.