基于RPA技術(shù)的紅火蟻快速可視化檢測方法

摘""要：紅火蟻（Solenopsis"invicta）是一種原產(chǎn)于南美洲的嚴(yán)重入侵害蟲，目前已在我國廣泛分布，對農(nóng)業(yè)、自然生態(tài)系統(tǒng)及公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅。出入境檢疫作為防止紅火蟻入侵和擴(kuò)散的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需要在短時間內(nèi)對檢疫對象進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。現(xiàn)有紅火蟻鑒定方法包括形態(tài)學(xué)鑒定、DNA條形碼、免疫檢測及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增等技術(shù)，這些技術(shù)均存在一定局限性，在簡便性、檢測時間和靈敏度等方面難以滿足快速檢測的要求。重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase"polymerase"amplification，"RPA）是一種具有反應(yīng)條件簡單、靈敏度高及擴(kuò)增效率高的等溫擴(kuò)增技術(shù)。為實現(xiàn)紅火蟻快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)場檢測，本研究基于RPA技術(shù)，建立了一種紅火蟻可視化快速檢測方法。通過分析NCBI數(shù)據(jù)庫中紅火蟻及其近緣種、形近種的線粒體基因組序列，比對后選取線粒體NADH2脫氫酶基因作為擴(kuò)增目標(biāo)，并設(shè)計了RPA特異性引物。結(jié)果表明：設(shè)計引物對紅火蟻具有高度特異性；瓊脂糖凝膠電泳檢測的RPA反應(yīng)靈敏度達(dá)到1.0×10?4"ng/μL，為PCR反應(yīng)靈敏度的1.0×103倍。同時通過檢測添加核酸染料后的熒光反應(yīng)開發(fā)了可視化檢測技術(shù)，可視化熒光檢測的靈敏度約為1.0×10?1"ng/μL。最后本研究探索了DNA樣品的快速提取方法，采用無菌超純水研磨螞蟻樣品，并在100"℃水浴加熱1"min條件下成功粗提DNA，取代傳統(tǒng)DNA提取過程。本方法可在37"℃下完成對紅火蟻基因的擴(kuò)增，并通過熒光反應(yīng)判斷檢測結(jié)果，30"min內(nèi)完成對紅火蟻的快速檢測，為紅火蟻的檢疫和防控提供了方便、快速、準(zhǔn)確、可靠的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：紅火蟻；重組聚合酶擴(kuò)增；可視化；快速檢測；靈敏度中圖分類號：Q968.1；S433""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

A"Rapid"Visual"Detection"Method"for"Red"Fire"Ants"Based"on"RPA"Technology

QIN"Lei，"ZHANG"Xufeng，"YUAN"Hongchao，"GUO"Jixing，"ZHOU"Xiang*

School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University"/"Key"Laboratory"of"Green"Prevention"and"Control"of"Tropical"Plant"Diseases"and"Pests"（Ministry"of"Education），"Danzhou，"Hainan"571700，"China

Abstract："Red"fire"ant，"Solenopsis"invicta，"a"serious"invasive"pest"native"to"South"America，nbsp;has"been"widely"distributed"in"China，"posing"significant"threats"to"agriculture，"natural"ecosystems，"and"public"health."Effective"entry-exit"quarantine"measures"are"essential"to"prevent"the"invasion"and"spread"of"S."invicta，"which"requires"rapid"and"accurate"identification"of"the"pest."Existing"detection"methods，"including"morphological"identification，"DNA"barcoding，"immunoassay，"and"loop-mediated"isothermal"amplification"（LAMP）"have"limitations"in"simplicity，"detection"speed"and"sensitivity."Recombinase"polymerase"amplification"（RPA）"is"an"isothermal"amplification"technique"characterized"by"its"simplicity，"high"sensitivity，"and"efficient"amplification."To"enable"rapid"and"accurate"on-site"detection"of"S."invicta，"this"study"developed"a"visual"detection"method"based"on"RPA"technology."Mitochondrial"genome"sequences"of"S."invicta"and"closely"related"or"morphologically"similar"species"were"analyzed"using"data"from"the"NCBI"database."The"mitochondrial"NADH2"dehydrogenase"gene"was"selected"as"the"target"for"amplification，"and"specific"RPA"primers"were"designed."Experimental"results"confirmed"that"the"primers"demonstrated"high"specificity"for"S."invicta."Sensitivity"testing"using"agarose"gel"electrophoresis"revealed"that"the"RPA"reaction"could"detect"as"low"as"1.0×10?4"ng/μL，"which"is"103"times"more"sensitive"than"conventional"PCR."A"visual"detection"method"was"further"developed"by"incorporating"nucleic"acid"dyes"into"the"reaction，"achieving"a"sensitivity"of"approximately"1.0×10?1"ng/μL."Additionally，"a"rapid"DNA"extraction"method"was"explored."This"method"involved"grinding"ant"samples"in"sterile"water"followed"by"heating"at"100"℃"in"a"water"bath"for"one"minute，"which"successfully"yielding"crude"DNA."The"developed"method"enables"gene"amplification"of"S."invicta"at"37"℃，"with"detection"results"assessed"via"fluorescence"reactions，"completing"the"entire"process"within"30"minutes."This"approach"provides"a"convenient，"rapid，"accurate，"and"reliable"technical"method"for"detecting"S."invicta，"offering"valuable"technical"support"for"its"quarantine，"prevention"and"control.

Keywords："Solenopsis"invicta;"recombinant"polymerase"amplification;"visualization;"rapid"detection;"sensitivity

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.023

紅火蟻（Solenopsis"invicta）原生于南美洲巴拉那河流域[1]，被認(rèn)為是世界上最危險的100種惡性入侵物種之一[2]。在全球化貿(mào)易背景下，紅火蟻隨著人類活動，借助各類交通工具在全球范圍內(nèi)快速傳播擴(kuò)散[3]。我國最早在2003年于臺灣省桃園、嘉義發(fā)現(xiàn)紅火蟻入侵，隨后2004年在廣東省吳川市出現(xiàn)，此后分布范圍不斷擴(kuò)大。截至2021年，華南、華中、華東和西南地區(qū)的12個省份均有紅火蟻發(fā)生的報道[4]。紅火蟻具有極強(qiáng)的破壞力和環(huán)境適應(yīng)能力，能夠在農(nóng)田、綠化帶、草地等多種生境中迅速定殖并成為優(yōu)勢種，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)、城市及公共衛(wèi)生等方面帶來嚴(yán)重危害[5-8]。

紅火蟻的入侵主要通過人類活動傳播，例如隨苗木和土壤運輸?shù)韧緩綌U(kuò)散[9]。檢疫措施是防止紅火蟻進(jìn)一步擴(kuò)散的重要手段[10]，而快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)是檢疫工作的關(guān)鍵。目前紅火蟻的鑒定依賴形態(tài)學(xué)和DNA條碼技術(shù)鑒定，但紅火蟻的體型小，形態(tài)特征不易觀察，特別是在脫離蟻巢后，直觀識別難度大，需借助體視顯微鏡并依賴專業(yè)人員的經(jīng)驗。而DNA條碼技術(shù)雖然準(zhǔn)確性高，但檢測流程繁瑣，耗時較長，難以滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。VALLES等[11]開發(fā)了基于紅火蟻特異性毒液蛋白的單克隆抗體檢測法，但該方法需要至少5只工蟻的毒液蛋白，靈敏度較低，當(dāng)捕獲的蟻群較少時難以滿足檢測需求。LAMP技術(shù)被開發(fā)用于紅火蟻檢測[12]，但LAMP技術(shù)容易受氣溶膠污染產(chǎn)生假陽性，此外反應(yīng)需要60"℃和90"℃"2個反應(yīng)溫度，需要儀器設(shè)備且操作流程相對繁瑣，檢測時間較長[13-17]。因此，開發(fā)一種準(zhǔn)確、高效、簡便的紅火蟻檢測方法具有重要意義。重組聚合酶擴(kuò)增（recombinase"polymerase"amplification，"RPA）是一種不通過高溫解旋，利用酶打開模板鏈，不需要高溫使DNA變性，也不需要高溫進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)[18]，不依賴PCR儀完成核酸指數(shù)擴(kuò)增的恒溫擴(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)條件簡單，在25～43"℃恒溫條件下即可實現(xiàn)核酸的指數(shù)擴(kuò)增[19-20]。相對PCR和其他恒溫擴(kuò)增技術(shù)，如環(huán)介等溫擴(kuò)增（loop-mediated"isothermal"amplification，"LAMP），反應(yīng)時間更短，條件更簡單，靈敏度更高。自2006年報道以來[21]，RPA已被廣泛應(yīng)用于多種有害生物的現(xiàn)場快速檢測。本研究開發(fā)了一種基于RPA技術(shù)的紅火蟻可視化檢測方法，快速高效、簡便易行，靈敏準(zhǔn)確，對于防控紅火蟻的進(jìn)一步擴(kuò)散具有重要的應(yīng)用價值。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試蟲源""紅火蟻（Solenopsis"invicta）、法老小家蟻（Monomorium"pharaonis）采自海南省儋州市海南大學(xué)儋州校區(qū)，熱帶火蟻（S."geminata）采自海南省海口市那央村，廣大頭蟻（Pheidole"megacephala）采自海南省樂東黎族自治縣尖峰嶺，細(xì)紋毛切葉蟻（Trichomyrmex"destructor）、邁氏毛切葉蟻（T."mayri）采自海南省瓊中黎族自治縣黎母山。螞蟻樣本均為成蟲，保存在無水乙醇中，存放于?20"℃冰箱內(nèi)。

1.1.2""主要試劑""血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)（DH5α）購自天根生化科技（北京）有限公司，Premix"Taq酶、載體pMD?18-T購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，RPA基礎(chǔ)擴(kuò)增試劑盒購自英國TwistDx公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自德國默克公司。

1.2"""方法

1.2.1""DNA提取""用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書，分別提取幾種螞蟻樣本DNA，用超微量紫外分光光度計（歐洲米歐儀器有限公司）對提取DNA的濃度及質(zhì)量進(jìn)行測定，保存在?20"℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2""PCR擴(kuò)增及物種鑒定""COI基因通用引物L(fēng)CO1490和HCO2198[22]由擎科生物科技股份有限公司（海口）合成，對各螞蟻樣本的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)使用25"μL體系，包括12.5"μL"Premix"Taq、9.5"μL無菌超純水、1.0"μL"DNA模板和正、反向引物（10.0"μmol/L）各1"uL。LCO1490的PCR反應(yīng)條件：94"℃預(yù)變性1"min；94"℃變性40"s，45"℃退火30"s，72"℃延伸1"min，預(yù)擴(kuò)增5個循環(huán)；HCO2198的PCR反應(yīng)條件：94"℃變性40"s，51"℃退火40"s，72"℃延伸1"min，35個循環(huán)；72"℃延伸5"min。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，使用DNA純化回收試劑盒對目的條帶進(jìn)行純化回收，將純化產(chǎn)物和載體pMD?18-T連接，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)（DH5α）中，篩選陽性克隆，將菌液送往擎科生物科技股份有限公司（海口）測序。

1.2.3""引物設(shè)計""引物按照TwistAmp?檢測設(shè)計手冊指南（https：//www.twist"dx.co.uk）設(shè)計，根據(jù)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的紅火蟻線粒體全基因組與試驗中5種近緣種和形體近似螞蟻的線粒體全基因組用MEGA"11進(jìn)行比對，找到紅火蟻的特異性堿基位點，最終選取長度為961"bp的紅火蟻的線粒體NADH脫氫酶2（ND2）基因序列，使用Primer"Premier"5軟件設(shè)計引物，將設(shè)計引物序列在NCBI使用Primer-BLAST功能對引物進(jìn)行分析篩選，得到ND2F和ND2R，初步檢驗引物的特異性，篩選出特異性良好的引物，并由擎科生物科技股份有限公司（?？冢┖铣桑ū?）。

1.2.4""PCR驗證引物特異性""對RPA引物進(jìn)行PCR反應(yīng)驗證特異性，在25"μL體系中進(jìn)行，體系包括12.5"μL"Premix"Taq酶，10"μL無菌超純水，正反向引物各1"μL，0.5"μL"DNA模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94"℃預(yù)變性5"min；94"℃變性30"s；58"℃退火30"s；72"℃延伸30"s，30個循環(huán)；72"℃延伸10"min。取20"μL反應(yīng)產(chǎn)物，在3%瓊脂糖凝膠100"V恒壓電泳30"min，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)紫外透射下觀察并且保存結(jié)果。

1.2.5nbsp;"RPA驗證引物特異性""對引物進(jìn)行RPA反應(yīng)檢驗，按照試劑盒進(jìn)行操作，RPA反應(yīng)體系為50"μL體系，包括29.5"μL"Rehydration"buffer，11.2"μL無菌超純水，正反向引物各2.4"μL，1"μL"DNA模板，2.5"μL"280"mmol/L醋酸鎂[Mg（CH3COO）2]溶液，簡寫為MgOAc，先將Rehydration"buffer、無菌超純水、正反向引物混勻后加入反應(yīng)管溶解管中的酶，后加入DNA模板和MgOAc，充分震蕩混勻后離心，在PCR儀上37"℃孵育20"min終止反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書進(jìn)行純化后，取20"μL與2"μL"10×loading"buffer混勻點樣，在3%瓊脂糖凝膠上100"V恒壓電泳30"min，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)紫外透射下觀察并且保存結(jié)果。

1.2.6""反應(yīng)終點的可視化""將螞蟻DNA進(jìn)行RPA反應(yīng)后產(chǎn)物中加入1"μL的SYBR"GREEN"Ⅰ"核酸染料震蕩離心后，放在激發(fā)光源下進(jìn)行觀察。

1.2.7""RPA反應(yīng)的靈敏度檢驗""將初始濃度為100"ng/μL紅火蟻DNA模版按照梯度依次稀釋至1.0×101、1.0、1.0×10?1、1.0×10?2、1.0×10?3、1.0×"10?4、1.0×10?5"ng/μL，PCR和RPA的體系不變，分別進(jìn)行RCR和RPA反應(yīng)，PCR結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，RPA結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳和熒光反應(yīng)驗證。

1.2.8""DNA快速提取方法的探索""參照PRITI等[23]在棕櫚薊馬RPA檢測中的DNA快速提取方法。在1.5"mL離心管中加入50"μL無菌超純水，用研磨棒對螞蟻進(jìn)行充分研磨，研磨后將離心管在100"℃水浴鍋中水浴加熱1"min得到螞蟻DNA粗提液。用12.2"μL的粗提液等體積代替原體系中11.2"μL無菌超純水和DNA進(jìn)行RPA反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書進(jìn)行純化后，取20"μL與2"μL"10×loading"buffer混勻點樣，在3%瓊脂糖凝膠上100"V恒壓電泳50"min，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)紫外透射下觀察并且保存結(jié)果。

將待檢測螞蟻放入裝有50"μL無菌超純水的離心管中用研磨棒研磨，將離心管放入便攜式金屬浴中100"℃加熱1～2"min，取11.2"μL粗提液加入提前混入引物與buffer的反應(yīng)管中，加入2.5"μL"MgOAc顛倒混勻，將反應(yīng)管握在手中或放入37"℃便攜式金屬浴水浴加熱20"min后，加入1"μL"SYBR"GREEN"Ⅰ核酸染料，搖勻后在激發(fā)光源下觀察。

2""結(jié)果與分析

2.1""紅火蟻及近似種鑒定

COI通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，1～6號泳道均出現(xiàn)條帶，表明目標(biāo)片段擴(kuò)增成功。通過NCBI的BLAST工具將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的物種基因序列進(jìn)行比對，序列同源性均大于98%，可確認(rèn)螞蟻樣本物種。

2.2""RPA引物特異性分析

首先利用普通PCR對RPA引物的特異性進(jìn)行分析，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，1號泳道有明顯條帶，2～6泳道無條帶出現(xiàn)，引物特異性良好。

RPA反應(yīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，泳道1有明顯條帶，泳道2～6無條帶出現(xiàn)，引物在RPA反應(yīng)中特異性良好。

2.3""可視化熒光檢測分析

對5種螞蟻DNA樣品進(jìn)行RPA反應(yīng)，反應(yīng)后向體系內(nèi)加入1"μL"SYBR"GREEN核酸染料，震蕩混勻。結(jié)果顯示，1號管的樣品在激發(fā)光源下呈顯著熒光，2～6號管無熒光現(xiàn)象（圖4）。

2.4""PCR與RPA反應(yīng)靈敏度檢測

利用普通PCR方法分析RPA引物對不同濃度模版檢測靈敏度，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，1～3號泳道有明顯條帶，4號泳道隱約可見條帶，5號泳道無條帶出現(xiàn)，PCR反應(yīng)的靈敏度檢測最低限度為1.0×10?1"ng/μL（圖5）。

RPA反應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示1～4號泳道有明顯條帶，5～7號泳道隱約可見條帶，8號泳道無條帶出現(xiàn)，RPA反應(yīng)的靈敏度檢測最低限度為1.0×10?4"ng/μL（圖6）。

可視化熒光檢測結(jié)果顯示，1～3號管可檢測到顯著熒光信號，4～6號管未檢測到熒光信號，RPA反應(yīng)的可視化熒光檢測靈敏度檢測最低限度為1.0×10?1"ng/μL（圖7）。

2.5""DNA快速提取方法的探索

將粗提的DNA進(jìn)行RPA反應(yīng)，再將反應(yīng)產(chǎn)物純化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，泳道1有明顯的條帶，證明引物對紅火蟻粗提的DNA成功擴(kuò)增（圖8）。該結(jié)果同時證明，可用粗提DNA的方式代替DNA提取，來達(dá)到減少檢測時間，提高檢測效率的目的。

以粗提DNA代替試劑盒提取DNA過程，RPA反應(yīng)后向體系加入1"μL"SYBR"GREEN核酸染料，在激發(fā)光源下，管1有顯著熒光現(xiàn)象（圖9）。據(jù)該結(jié)果，可用向體系中加入核酸染料在激發(fā)光源下觀察是否有熒光現(xiàn)象代替瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)而減少檢測時間，提高檢測效率。

3""討論

紅火蟻作為一種適應(yīng)能力極強(qiáng)、危害嚴(yán)重的入侵害蟲，已引起全球范圍的高度關(guān)注[24]。紅火蟻通過人類活動、苗木及土壤等途徑傳播擴(kuò)散，全球諸多地區(qū)均存在紅火蟻入侵的潛在風(fēng)險，隨著經(jīng)濟(jì)貿(mào)易全球化，世界各國之間貿(mào)易往來頻繁，增加了紅火蟻通過人類活動隨交通工具進(jìn)行傳播的風(fēng)險。紅火蟻一旦定殖，紅火蟻對農(nóng)業(yè)、環(huán)境、城市基礎(chǔ)設(shè)施及人類健康都會造成嚴(yán)重危害。目前檢疫仍是預(yù)防紅火蟻入侵最有效的手段，國內(nèi)外對紅火蟻檢疫工作越來越重視，快速、準(zhǔn)確的分子檢測技術(shù)對紅火蟻的早期防控至關(guān)重要。本研究開發(fā)了一種基于RPA技術(shù)的紅火蟻可視化檢測方法，快速高效、簡便易行，靈敏準(zhǔn)確，對于防控紅火蟻的進(jìn)一步擴(kuò)散具有重要的應(yīng)用價值。

RPA檢測為紅火蟻分子鑒定提供了新的方式，相較于DNA條形碼、免疫檢測法、LAMP等方法，RPA檢測時間更短，靈敏度更高，操作更簡便，無需儀器即可完成，適用于各個場景，為其他膜翅目害蟲的分子鑒定提供了可借鑒的技術(shù)支持?，F(xiàn)階段RPA等溫擴(kuò)增技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于病原菌和病毒的快速檢測，但在昆蟲的鑒定和檢疫中，應(yīng)用案例較少。PRITI等[23]建立了基于RPA反應(yīng)的棕櫚薊馬快速檢測方法，是RPA等溫擴(kuò)增在昆蟲的檢測與檢疫的首次應(yīng)用，該方法無需PCR儀等設(shè)備即可在30"min內(nèi)完成檢測，僅通過觀察反應(yīng)前后指示劑顏色變化就能判斷反應(yīng)結(jié)果；LEWALD等[25]基于RPA技術(shù)結(jié)合Cas12a，建立了番茄潛葉蛾（Phthorimaea"absoluta）的快速檢測方法，該方法僅需0.1"ng的DNA作為模板即可完成擴(kuò)增，且僅需簡單的紫外激發(fā)光源就能判斷反應(yīng)結(jié)果，方法簡便對操作人無知識儲備要求；SHASHANK等[26]結(jié)合了RPA和CRISPR，相比實時熒光定量PCR，RPA反應(yīng)時間更短，靈敏度更高，對番茄莖麥蛾、番茄潛葉蛾和斜紋夜蛾（Spodoptera"litura）準(zhǔn)確性達(dá)到了100%。ZENG等[27]建立的谷斑皮蠹（Tro g od erma"granarium）RPA和CRISPR/Cas12a快速可視化檢測，能夠在40"min完成對目標(biāo)的檢測，靈敏度達(dá)到了1.0×"10?1"ng/μL，王雅娜等[28]建立的基于RPA-CRISPR/"Cas12a的美國白蛾可視化快速檢測通過RPA擴(kuò)增目標(biāo)序列，結(jié)合CRISPR檢測技術(shù)并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終該體系靈敏度可檢測的最低限度為1.0×10?1"ng/μL，檢測體系在30"min內(nèi)即可實現(xiàn)對害蟲的現(xiàn)場快速、可視化、精準(zhǔn)鑒定。

為有效防控紅火蟻，在檢疫中快速、準(zhǔn)確地鑒定紅火蟻，本研究對紅火蟻和近緣種和近似種的螞蟻通過RPA反應(yīng)對目標(biāo)序列擴(kuò)增，實現(xiàn)對紅火蟻的快速鑒定。為滿足在野外以及海關(guān)口岸等場景下快速檢測的目的，應(yīng)精簡反應(yīng)所需設(shè)備與流程。RPA反應(yīng)所需溫度和人體溫接近，將反應(yīng)的試管握在手中20"min代替PCR儀或在37"℃便攜式金屬浴中加熱，皆可完成RPA反應(yīng)。在現(xiàn)場檢測場景中，若無凝膠成像系統(tǒng)，則無法觀察瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果，同時瓊脂糖凝膠電泳耗時較長，不符合現(xiàn)場檢測簡便性這一重要原則，故采取使用熒光染料作為反應(yīng)終點的指示劑代替瓊脂糖凝膠電泳過程。成功擴(kuò)增的核酸被核酸染料染色，在激發(fā)光源下，有顯著熒光現(xiàn)象。反應(yīng)后在藍(lán)光或紫外燈等激發(fā)光源下有顯著熒光現(xiàn)象，靈敏度約為1.0×10?1"ng/μL，時間比RPA結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳減少了30"min，比LAMP反應(yīng)減少了60"min。該檢測方法經(jīng)多次重復(fù)檢驗，重復(fù)性良好，且鑒定結(jié)果實現(xiàn)可視化，適用場景包括海關(guān)口岸、田間以及缺少實驗設(shè)備的地方，該方法在發(fā)現(xiàn)殘缺蟲體，難以區(qū)分時，仍可以準(zhǔn)確鑒定，同時該方法使用簡便，非專業(yè)人員仍可按方法準(zhǔn)確鑒別。新方法為紅火蟻的檢疫防控提供了技術(shù)支持，同時為其他檢疫害蟲的快速檢測提供了經(jīng)驗。

本研究相比形態(tài)學(xué)鑒定、DNA條形碼、LAMP等方法，有檢測時間更短，靈敏度更高等優(yōu)點。但是同時目前該方法仍存在不足之處，該檢測體系有待進(jìn)一步改進(jìn)。包括指示劑的改良，羥基萘酚藍(lán)作為指示劑相比熒光染料更加簡便，無需激發(fā)光源即可觀察檢測結(jié)果，但在該方法中測試反應(yīng)前后顏色變化不明顯，有待進(jìn)一步研究。

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