鑒定調(diào)控橡膠樹(shù)膠乳特異表達(dá)HbCPT7的MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子

摘""要：天然橡膠是重要的工業(yè)原料，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活中。在橡膠樹(shù)（Hevea"brasiliensis）的產(chǎn)膠細(xì)胞乳管中，順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（cis-prenyltransferase，CPT）是催化天然橡膠合成的關(guān)鍵組分。已報(bào)道的HbCPT7和HbCPT8在膠乳中特異表達(dá)，并且在酵母和煙草中的HblMYB19和HblMYB44能夠顯著促進(jìn)HbCPT8的表達(dá)。然而，調(diào)控HbCPT7膠乳特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)HbCPT7的啟動(dòng)子區(qū)具有多個(gè)MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件，通過(guò)生物信息學(xué)分析，在橡膠樹(shù)全基因組水平上鑒定到226個(gè)HbMYBs和19個(gè)HbMYCs轉(zhuǎn)錄因子，其中HbMYB1、HbMYB2、HbMYC1、HbMYC2、HbMYC3、HbMYC4和HbMYC5在膠乳中高表達(dá)。本研究成功克隆了HbMYB1、HbMYB2、HbMYC1、HbMYC4和HbMYC5，并通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)HbMYC5能夠結(jié)合HbCPT7起始密碼子上游1～1000"bp和1501～1971"bp的啟動(dòng)子區(qū)域。本研究為解析HbCPT7調(diào)控天然橡膠合成的分子機(jī)制提供新的線索。

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù)；HbCPT7；HbMYC；HbMYB中圖分類號(hào)：S794.1""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Identification"of"MYB"and"MYC"Transcription"Factors"Regulating"the"Latex-specific"Expression"of"HbCPT7"in"Hevea"brasiliensis

ZHOU"Miaomiao1，2，"LUO"Xiaomei1，"YANG"Yiqing1，"LIU"Kaiye1，2，"ZHANG"Shengmin1，2，"QI"Jiyan1，2，"TANG"Chaorong1，2，"CAO"Jie1，2*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry"（Agriculture"and"Rural"College，"Rural"Revitalization"College），"Hainan"University"/"Natural"Rubber"Provincial"and"Ministerial"Collaborative"Innovation"Center，"Haikou，"Hainan"570028，"China;"2."School"of"Breeding"and"Multiplication"（Sanya"Institute"of"Breeding"and"Multiplication），"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572025，"China

Abstract："Natural"rubber"is"a"key"and"widely"used"industrial"raw"material，"which"is"mainly"produced"from"Hevea"brasiliensis."Cis-prenyltransferase"（CPT）"is"an"important"component"of"natural"rubber"biosynthesis"in"laticiferous"cells."It"has"been"reported"that"HbCPT7"and"HbCPT8"are"specifically"and"highly"expressed"in"latex，"which"is"the"cytoplasm"of"laticifers，"and"HblMYB19"and"HblMYB44"can"significantly"promote"the"expression"of"HbCPT8"in"tobacco"and"yeast."However，"the"transcription"factors"that"regulate"the"specific"expression"of"HbCPT7"in"latex"are"still"not"clear."Here，"we"found"there"are"several"MYB-"and"MYC-binding"sites"located"in"promoter"region"of"HbCPT7."We"totally"identified"226"HbMYBs"and"19"HbMYCs"in"Hevea"by"using"a"genome-wide"scanning"approach."The"transcriptome"data"showed"that"HbMYB1，"HbMYB2，"HbMYC1，"HbMYC2，"HbMYC3，"HbMYC4"and"HbMYC5"were"highly"expressed"in"latex."HbMYB1，"HbMYB2，"HbMYC1，"HbMYC4"and"HbMYC5"were"successfully"cloned"from"the"latex"of"rubber"trees."Through"yeast"one-hybrid"assays，"it"was"discovered"that"HbMYC5"could"bind"to"the"promoter"regions"of"1–1000"bp"and"1501–1971"bp"upstream"of"the"start"codon"of"HbCPT7."The"results"would"provide"a"new"insight"into"the"molecular"mechanism"of"HbCPT7"in"regulating"natural"rubber"biosynthesis.

Keywords："rubber"tree;"HbCPT7;"HbMYC;"HbMYB

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.002

天然橡膠（順式-1，4-聚異戊二烯）是重要的工業(yè)原料，也是不可或缺的戰(zhàn)略資源，主要來(lái)自巴西橡膠樹(shù)（Hevea"brasiliensis），因其具有優(yōu)越的化學(xué)和物理特性，如良好的彈性、絕緣性、較強(qiáng)的抗撕裂、耐摩擦以及抗沖擊等性能，廣泛應(yīng)用于國(guó)防軍工、交通運(yùn)輸、機(jī)械制造以及醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域[1-3]。目前市場(chǎng)上以天然橡膠為原料的產(chǎn)品多達(dá)4萬(wàn)余種[4]，特別在軍用航空輪胎中，天然橡膠是不可替代的原材料。

天然橡膠的生物合成主要由4個(gè)階段組成：合成異戊烯基焦磷酸（isopentenyl"pyrophosphate，"IPP）及其同分異構(gòu)體（dimethylallyl"diphosphate，"DMAPP）、縮合IPP/DMAPP形成線性的類異戊二烯（geranyl"diphosphate，"GPP;"farnesyl"diphosphate，"FPP;"geranylgeranyl"diphosphate，"GGPP）、進(jìn)一步縮合IPP/DMAPP和線性的類異戊二烯形成聚異戊二烯鏈、修飾聚異戊二烯鏈[5]。IPP主要通過(guò)植物細(xì)胞質(zhì)中的甲羥基戊酸途徑（mevalonic"acid，"MVA）合成，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl"diphosphate"isomerase，"IPPI）催化IPP形成DMAPP，二者在香葉基二磷酸合酶（diphosphate"synthase，"GPS）、法尼基焦磷酸合酶（farnesyl"diphosphate"synthase，"FPS）和香葉基香葉基焦磷酸合酶（geranylgeranyl"pyrophosphate"synthase，"GGPS）的催化下產(chǎn)生天然橡膠的起始底物，即香葉基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP）和香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）[5]。橡膠粒子是天然橡膠合成和儲(chǔ)存的場(chǎng)所，其表面的順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（cis-prenyltransferase，"CPT）具有橡膠轉(zhuǎn)移酶的催化活性，能聚合IPP/DMAPP和GPP、FPP或GGPP形成天然橡膠的基本骨架，即順式-"1，4-聚異戊二烯[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，Hevea"brasiliensis"CPT7（HbCPT7）和CPT8（HbCPT8）在膠乳中特異高表達(dá)[9]，HbCPT7受割膠誘導(dǎo)表達(dá)[10]，HbCPT8的表達(dá)水平與天然橡膠產(chǎn)量顯著正相關(guān)[11]，說(shuō)明HbCPT7和HbCPT8與天然橡膠的生物合成密切相關(guān)。

AOKI等[12]分析了HRT1（HbCPT8）的啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)含有MYB和bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)該基因的表達(dá)水平可能受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。WANG等[13]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子HblMYB19和HblMYB44在橡膠樹(shù)乳管中高豐度表達(dá)，并能夠在酵母和煙草中激活HbCPT8的表達(dá)，認(rèn)為HblMYB19和HblMYB44可能是調(diào)控HbCPT8乳管特異表達(dá)的重要因子。然而，調(diào)控HbCPT7乳管特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子尚未鑒定。

MYB是真核生物中一類高度保守的轉(zhuǎn)錄因子超家族，通過(guò)MYB保守結(jié)構(gòu)域結(jié)合下游基因的啟動(dòng)子區(qū)來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)水平[14]。MYB保守結(jié)構(gòu)域含有1～4個(gè)由52個(gè)氨基酸組成的重復(fù)序列（R），每一個(gè)R形成3個(gè)α螺旋，調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的識(shí)別[14]。根據(jù)R的數(shù)目，MYB轉(zhuǎn)錄因子可分為R2R3、1R、R1R2R3和4R四種類型[14]。MYC亦是真核生物中一類高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，其氮端和碳端分別含有1個(gè)HLH-MYC_N和bHLH（basic"helix-loop-"helix）保守結(jié)構(gòu)域[10]。本研究通過(guò)分析HbCPT7啟動(dòng)子序列的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)含有MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。為鑒定調(diào)控HbCPT7的MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子，利用生物信息學(xué)分析，從橡膠樹(shù)基因組中分別鑒定到226個(gè)HbMYBs和19個(gè)HbMYCs轉(zhuǎn)錄因子，其中HbMYB1、HbMYB2、HbMYC1、HbMYC2、HbMYC3、HbMYC4和HbMYC5在膠乳中特異表達(dá)；成功克隆了HbMYB1、HbMYB2、HbMYC1、HbMYC4和HbMYC5，并采用酵母單雜交的方法證實(shí)HbMYC5能夠結(jié)合HbCPT7起始密碼子上游1～1000"bp和1501～1971"bp的啟動(dòng)子區(qū)域。本研究結(jié)果為解析HbCPT7調(diào)控天然橡膠生物合成的分子機(jī)制提供新的線索。

1""材料與方法

1.1""HbCPT7基因啟動(dòng)子克隆和順式作用元件預(yù)測(cè)

采用CTAB法提取橡膠樹(shù)葉片的DNA并以其為模板，參考熱研7-33-97基因組中CPT7的序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），在PrimeSTAR?"HS"DNA"Polymerase（R010Q）DNA聚合酶的作用下克隆HbCPT7的啟動(dòng)子序列。將克隆的目的基因片段送至海南楠山生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序正確的片段即為HbCPT7的啟動(dòng)子序列。利用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb."ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件預(yù)測(cè)其順式作用元件。

1.2""橡膠樹(shù)膠乳高表達(dá)HbMYB和HbMYC基因的鑒定和克隆

橡膠樹(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子鑒定：分別以擬南芥R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子AtMYB3（At1g22640）、3R型MYB轉(zhuǎn)錄因子AtMYB3R3（At3g09370.3）、4R型MYB轉(zhuǎn)錄因子ATMYB4R1（At3g18100）以及MYB-related蛋白中CCA1-like亞類的LATE"ELONGATED"HYPOCOTYL（At1g01060）、CPC-like亞類的AtMYB-like"2（At1g71030.1）、I-box-binding-like亞類的AtRL6（At1g75250）和R-R-type亞類的AtMYBL（At1g49010）的氨基酸序列為query序列[15]，利用TBtools軟件，采用BLASTp的序列比對(duì)方法，從熱研7-33-97的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索同源序列（p-value"lt;E-20）[16]。橡膠樹(shù)MYC轉(zhuǎn)錄因子鑒定：以擬南芥MYC轉(zhuǎn)錄因子AtMYC2（At1g32640.1）的氨基酸序列為query序列，利用TBtools軟件，采用BLASTp的序列比對(duì)方法，從熱研7-33-97的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索同源序列。At1g22640、At3g09370.3、At3g18100、At1g01060、At1g71030.1、At1g75250、At1g49010和At1g32640.1的氨基酸序列下載自Tair（https：//"www.arabidopsis.org/）。利用課題組已發(fā)表的熱研7-33-97的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[9]和TBtools軟件分析HbMYBs和HbMYCs的表達(dá)水平。利用NCBI-Conserved"domain"database（https：//www."ncbi.nim.nih.gov/guide/domins-Structures/）在線工具分析HbMYBs和HbMYCs的保守結(jié)構(gòu)域。使用TRIzol（ThermoFisher）試劑提取橡膠樹(shù)膠乳的RNA，取1"μg總RNA，在Hiscript"1"st"Strand"cDNA"Synthesis"kit（+gDNA"wiper）（R312）試劑盒的作用下獲得膠乳cDNA，并以其為模板，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），利用PrimeSTAR?"HS"DNA"Polymerase（R010Q）"DNA聚合酶擴(kuò)增HbMYB1、HbMYB2、HbMYC1、HbMYC4和HbMYC5的編碼序列（coding"sequence，"CDS）。

1.3""酵母誘餌菌株的自激活檢測(cè)

利用限制性內(nèi)切酶Sma"Ⅰ和Sal"Ⅰ線性化pAbAi載體，利用同源重組引物（表1）擴(kuò)增HbCPT7啟動(dòng)子目標(biāo)片段，采用ClonExpress"Ultra"One"Step"Cloning"Kit（C115-02，"Vazyme）試劑盒構(gòu)建pAbAi-pHbCPT7-1-500、pAbAi-pHbCPT7-"501-1000、pAbAi-pHbCPT7-1001-1500、pAbAi-"pHbCPT7-1501-1971載體。利用限制性內(nèi)切酶Bbs"I線性化pAbAi（空載體）、p53-AbAi（陽(yáng)性對(duì)照）、重組載體pAbAi-pHbCPT7-1-500、pAbAi-pHbCPT7-"501-1000、pAbAi-pHbCPT7-1001-1500和pAbAi-"pHbCPT7-1501-1971的質(zhì)粒，具體操作參照TaKaRa"Bio公司的Matchmaker?"GoldYeast"One-"Hybrid"Library"Screening"System"User"Manual說(shuō)明書(shū)手冊(cè)，隨后轉(zhuǎn)化Y1H酵母感受態(tài)細(xì)胞。取100"μL轉(zhuǎn)化后的酵母菌液涂布于SD/-Ura平板上，30"℃暗培養(yǎng)3～5"d，直至長(zhǎng)出菌斑。取適量酵母菌斑，加入配置好的酵母破壁酶（25"μL酵母破壁酶，470"μL山梨醇緩沖液，5"μL巰基還原劑），30"℃處理1～2"h。以處理后的菌液為模板進(jìn)行PCR，參考酵母基因組DNA提取試劑盒（DP307）說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)而檢測(cè)啟動(dòng)子片段是否整合至酵母基因組中。分別配制含有0、100、200、300、400、500、700、800"ng/mL金擔(dān)子素（aureobasidin"A，AbA）的SD/-Ura培養(yǎng)基。每個(gè)載體選取1個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行活化，將活化后的菌液（OD600=0.2）分別稀釋10、100、1000倍。分別取5"μL稀釋后的菌液滴至含有不同濃度AbA的SD/-Ura平板上，30"℃暗培養(yǎng)3～5"d，觀察長(zhǎng)斑情況。

1.4""酵母單雜交實(shí)驗(yàn)

從橡膠樹(shù)膠乳的cDNA中克隆HbMYB1、HbMYB2、HbMYC1、HbMYC4和HbMYC5目的基因片段，使用帶酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增插入的目的基因片段，酶切載體（載體為pGADT7，使用EcoR"Ⅰ和BamH"Ⅰ進(jìn)行雙酶切）后，利用ClonExpress"Ultra"One"Step"Cloning"Kit（C115-01）同源重組酶連接插入片段和酶切后的載體，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。一端使用載體引物，另一端使用插入片段引物對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選陽(yáng)性克隆送至海南楠山生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，選取序列正確的陽(yáng)性單克隆搖菌，提取重組質(zhì)粒AD-HbMYB1、AD-HbMYB2、AD-HbMYC1、AD-HbMYC4和AD-HbMYC5，同時(shí)，提取載體pGADT7的質(zhì)粒，具體操作參照TaKaRa"Bio公司的Matchmaker?"GoldYeast"One-"Hybrid"Library"Screening"System"User"Manual手冊(cè)。將pAbAi-pHbCPT7-1-500、pAbAi-"pHbCPT7-"501-1000、pAbAi-pHbCPT7-1501-1971分別轉(zhuǎn)化至酵母菌株中，將轉(zhuǎn)化后的酵母菌液點(diǎn)板至SD/-Leu和SD/-Leu/AbA（500"ng/mL）的平板上，30"℃暗培養(yǎng)3～5"d，觀察長(zhǎng)斑情況。

2""結(jié)果與分析

2.1""HbCPT7啟動(dòng)子序列克隆和順式作用元件分析

以橡膠樹(shù)葉片DNA為模板，擴(kuò)增出HbCPT7基因起始密碼子上游1971"bp的啟動(dòng)子區(qū)（圖1A）。使用PlantCARE軟件預(yù)測(cè)該區(qū)域的順式作用元件發(fā)現(xiàn)，123個(gè)核心順式作用元件（TATA-box和CAAT-box）、6個(gè)光響應(yīng)元件（AE-box、chs-CMA2a、G-box、GT1-motif）、2個(gè)蛋白質(zhì)代謝調(diào)控元件（O2-site）、1個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)元件（MSA-like）、6個(gè)激素響應(yīng)相關(guān)元件（GARE-motif"、STRE、ABRE、ERE）、4個(gè)脅迫相關(guān)響應(yīng)元件（TC-rich、WUN-motif）、12個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)和5個(gè)MYC結(jié)合位點(diǎn)（圖1B）。

2.2""橡膠樹(shù)膠乳高表達(dá)HbMYBs基因的鑒定

從熱研7-33-97的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到258條含有MYB保守結(jié)構(gòu)域的序列，去除重復(fù)的和氨基酸數(shù)目小于100的序列，共得228個(gè)預(yù)測(cè)蛋白。通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)226個(gè)預(yù)測(cè)蛋白均具有MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域，將上述蛋白命名為HbMYB1～HbMYB226。

對(duì)226個(gè)HbMYB蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)橡膠樹(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子可分為3個(gè)亞家族，其中Group"1和Group"2中的MYB轉(zhuǎn)錄因子屬于1R類型，除HbMYB211和HbMYB225為R1R2R3型MYB以及HbMYB217為4R型MYB外，其余Group"3的HbMYBs均是R2R3型的MYB轉(zhuǎn)錄因子（圖2A）。利用熱研7-33-97樹(shù)皮、葉片和膠乳的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[9]，分析226個(gè)HbMYB基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)163個(gè)HbMYB基因在3個(gè)組織中的FPKM值均小于5。分析其余基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)HbMYB1（EVM0021518.1）和HbMYB2（EVM0023669.1）在膠乳中高表達(dá)（圖2B）。從橡膠樹(shù)膠乳的cDNA中成功克隆了HbMYB1和HbMYB2的編碼序列，長(zhǎng)度分別為995、1058"bp，與基因組注釋的編碼序列一致（圖2C）。

2.3""橡膠樹(shù)膠乳高表達(dá)HbMYCs基因的鑒定

從熱研7-33-97的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到19條編碼MYC蛋白的序列，通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)上述序列均含有bHLH-MYC_N和bHLH兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，將其分別命名為HbMYC1-"HbMYC19（圖3A）。對(duì)HbMYCs的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)HbMYC轉(zhuǎn)錄因子家族可分為3個(gè)亞家族。利用熱研7-33-97樹(shù)皮、葉片和膠乳的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[9]分析HbMYCs基因的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HbMYC1（EVM0032728.1）、HbMYC2（EVM0015982.1）、HbMYC3（EVM0021390.1）、HbMYC4（EVM0029927.1）及HbMYC5（EVM0033326.1）在膠乳中特異性高表達(dá)（圖3B）。隨后，從橡膠樹(shù)膠乳中成功克隆得到HbMYC1、HbMYC4和HbMYC5的編碼序列，長(zhǎng)度分別為1280、1314、1469"bp，均與基因組注釋的編碼序列長(zhǎng)度一致（圖3C）。

2.4""檢測(cè)誘餌菌株的自激活活性

為了鑒定調(diào)控HbCPT7膠乳特異表達(dá)的HbMYBs和HbMYCs轉(zhuǎn)錄因子，將克隆得到的HbCPT7的啟動(dòng)子序列分為4部分，即pHbCPT7-"1-500、pHbCPT7-501-1000、pHbCPT7-1001-1500和pHbCPT7-1501-1971（圖4A），分別構(gòu)建至pAbAi載體，獲得誘餌載體pAbAi-pHbCPT7-1-"500、pAbAi-pHbCPT7-501-1000、pAbAi-pHbCPT7-"1001-1500、pAbAi-pHbCPT7-1501-1971。使用限制性內(nèi)切酶Bbs"I線性化誘餌載體、陽(yáng)性對(duì)照（p53-AbAi）以及空載體（pAbAi）并轉(zhuǎn)化Y1H酵母感受態(tài)細(xì)胞。取SD/-Ura平板上的菌斑加入配置好的酵母破壁酶，30"℃處理1～2"h，以處理后的菌液為模板進(jìn)行PCR，提取轉(zhuǎn)化后的酵母菌液，利用酵母基因組DNA提取試劑盒檢測(cè)啟動(dòng)子片段是否整合至酵母基因組上，結(jié)果如圖4B所示，目的片段均整合至誘餌菌株的基因組上。

將誘餌菌液（OD600=0.2）分別稀釋10、100、1000倍，涂布至含有0、100、200、300、400、500、700和800"ng/mL"AbA的SD/-Ura的培養(yǎng)基上，檢測(cè)誘餌菌株的自激活活性。30"℃暗培養(yǎng)3"d后發(fā)現(xiàn)，pAbAi-pHbCPT7-1-500、pAbAi-pHbCPT7-"501-1000和pAbAi-pHbCPT7-1501-1971在含有400"ng/mL"AbA的SD/-Ura培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，說(shuō)明400"ng/mL的AbA能夠抑制pAbAi-pHbCPT7-"1-500、pAbAi-pHbCPT7-501-1000和pAbAi-"pHbCPT7-1501-1971的自激活活性（圖4C），pAbAi-pHbCPT7-1001-1500在AbA濃度為100、200、300、400、500、700、800"ng/L的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，說(shuō)明上述不同濃度梯度的AbA均不能抑制pAbAi-pHbCPT7-1001-1500的自激活活性。

2.5""誘餌菌株與prey載體的互作驗(yàn)證

利用同源重組技術(shù)將HbMYB1、HbMYB2、HbMYC1、HbMYC4和HbMYC5構(gòu)建至載體pGADT7上獲得prey載體，即AD-HbMYB1、AD-HbMYB2、AD-HbMYC1、AD-HbMYC4和AD-HbMYC5。采用酵母單雜交的方法檢測(cè)誘餌菌株pAbAi-pHbCPT7-1-500、pAbAi-pHbCPT7-"501-1000和pAbAi-pHbCPT7-1501-1971是否與prey載體互作。如圖5所示，AD-HbMYC5與pAbAi-pHbCPT7-1-500、pAbAi-pHbCPT7-501-"1000、pAbAi-pHbCPT7-1501-1971的組合均能在含有500"ng/mL"AbA的SD/-Ura平板上長(zhǎng)出菌斑，說(shuō)明HbMYC5能夠結(jié)合HbCPT7起始密碼子上游的1～1000"bp和1501～1971"bp的啟動(dòng)子區(qū)域。

3""討論

本研究從熱研7-33-97中鑒定到226個(gè)HbMYBs和19個(gè)HbMYCs轉(zhuǎn)錄因子，利用熱研7-33-97樹(shù)皮、葉片和膠乳的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析上述基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)HbMYB1、HbMYB2、HbMYC1、HbMYC2、HbMYC3、HbMYC4及HbMYC5在膠乳中高豐度表達(dá)。與已發(fā)表的結(jié)果相比，HbMYB1、HbMYB2與HbMYC1、HbMYC4分別是橡膠樹(shù)中新鑒定的MYB和MYC類轉(zhuǎn)錄因子。此外，HbMYC2（HblMYC2）、HbMYC3（HblMYC6）和HbMYC5（HblMYC3）的表達(dá)模式與ZHANG等[10]報(bào)道的結(jié)果一致。

天然橡膠存在于橡膠樹(shù)韌皮部的乳管細(xì)胞中，通過(guò)割開(kāi)樹(shù)皮（割膠）來(lái)收集膠乳。已有研究報(bào)道，開(kāi)割樹(shù)中的茉莉酸含量顯著高于未開(kāi)割樹(shù)的，說(shuō)明割膠促進(jìn)內(nèi)源茉莉酸含量的積累。DENG等[17]發(fā)現(xiàn)HbCPT7在開(kāi)割樹(shù)中的表達(dá)水平顯著高于未開(kāi)割樹(shù)，并且HbCPT7在茉莉酸處理后顯著上調(diào)表達(dá)，表明HbCPT7響應(yīng)茉莉酸信號(hào)，也說(shuō)明HbCPT7在膠乳中特異高表達(dá)可能是由于茉莉酸的誘導(dǎo)。MYC轉(zhuǎn)錄因子可以與E3泛素連接酶CORONATINE"INSENSITIVE1（COI1）、茉莉酸ZIM結(jié)構(gòu)域抑制因子Jasmonate-ZIM（JAZ）形成COI1/JAZ/MYC復(fù)合體，參與茉莉酸信號(hào)途徑。當(dāng)植物體內(nèi)的茉莉酸積累時(shí)，茉莉酸活性物質(zhì)（JA-Ile）結(jié)合JAZ-COI1復(fù)合體使JAZ被泛素化和解離，進(jìn)而被26S蛋白酶體降解，最終釋放出MYC，隨后MYC在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控響應(yīng)茉莉酸信號(hào)的基因，因此MYC是調(diào)節(jié)茉莉酸信號(hào)的重要蛋白[16]。ZHANG等[10]用茉莉酸替代物（冠菌素，Coronatine）處理橡膠樹(shù)0.5～4"h[18-20]，顯著提高了形成層中HblMYC3（HbMYC5）的表達(dá)水平，說(shuō)明HblMYC3（HbMYC5）能夠響應(yīng)茉莉酸信號(hào)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)HbMYC5在酵母中能夠與HbCPT7的啟動(dòng)子序列結(jié)合，進(jìn)而推測(cè)橡膠樹(shù)割膠后，內(nèi)源茉莉酸可能通過(guò)誘導(dǎo)HbMYC5的表達(dá)調(diào)控膠乳中HbCPT7的表達(dá)水平。此外，HbMYC2[18]和HbMYC2b[21]分別顯著促進(jìn)HbFPS和小橡膠粒子基因（Hevea"brasiliensis"small"rubber"particle"protein，"HbSRPP）的表達(dá)，其中HbSRPP是膠乳中豐度最高的蛋白，在抑制膠乳凝固及維持橡膠粒子的穩(wěn)定性等方面發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步說(shuō)明MYC是調(diào)控橡膠樹(shù)產(chǎn)膠相關(guān)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。

AOKI等[12]分析了橡膠樹(shù)乳管特異表達(dá)基因HbREF1、HbSRPP1和HRT1"（HbCPT8）的啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)含有MYB和bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)上述基因的表達(dá)水平可能受MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。HbWRKY1、HbWRKY3、HbWRKY14、HbWRKY55、HblMYB19、HblMYB44、HbMYC2b以及HbMADS4等轉(zhuǎn)錄因子均能與HbSRPP1的啟動(dòng)子序列結(jié)合，促進(jìn)或抑制HbSRPP1的表達(dá)，表明上述轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控HbSRPP在膠乳中高豐度表達(dá)[8]。本研究利用酵母單雜交的方法，未發(fā)現(xiàn)HbMYB1、HbMYB2與HbCPT7啟動(dòng)子直接結(jié)合，表明在天然橡膠的合成過(guò)程中HbMYB1和HbMYB2可能不參與調(diào)控HbCPT7的表達(dá)。綜上所述，本研究克隆分析了HbCPT7的啟動(dòng)子序列，鑒定了在橡膠樹(shù)膠乳中高豐度表達(dá)的MYB和MYC類轉(zhuǎn)錄因子，并發(fā)現(xiàn)HbMYC5能與HbCPT7的啟動(dòng)子序列結(jié)合，研究結(jié)果為解析HbCPT7調(diào)控天然橡膠合成的分子機(jī)理提供新的思路。

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