不同碳源、氮源對菠蘿果醋品質(zhì)及風(fēng)味的影響研究

摘""要：針對菠蘿果醋在液態(tài)發(fā)酵過程中底物利用率低，易失去典型風(fēng)味，且滋味寡淡等不足之處，本研究擬探究添加不同碳源（蔗糖、菊粉）、氮源（富鉻酵母、大豆蛋白）對菠蘿果醋發(fā)酵過程中理化指標(biāo)（總酸、還原糖、總多酚、總黃酮）、抗氧化性（DPPH自由基清除率及ABTS+清除率）以及揮發(fā)性成分的影響，以期提高菠蘿果醋發(fā)酵過程底物利用率和最終果醋品質(zhì)。結(jié)果表明：不同碳源、氮源均可顯著提高醋酸菌的產(chǎn)酸量，并且添加氮源促進(jìn)醋酸菌利用還原糖、產(chǎn)酸的能力優(yōu)于碳源。氮源對菠蘿果醋總多酚、總黃酮含量以及清除DPPH、ABTS自由基的能力均高于碳源。4組處理的菠蘿果醋中共檢出37種揮發(fā)性成分，主要為酯類、醇類、酸類、酚類、酮類等。添加氮源組的菠蘿果醋揮發(fā)性成分總濃度高于碳源組，其中，添加富鉻酵母的果醋中酯類、酸類化合物的質(zhì)量濃度最高，分別為3712.37、972.97"μg/L，分別是蔗糖組的6.39倍、8.76倍；與蔗糖處理相比，其他處理組的菠蘿果醋中各類揮發(fā)性成分總濃度增加了3.78～5.19倍。蔗糖處理組的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物有2種（癸酸乙酯、苯乙醇），菊粉處理組關(guān)鍵揮發(fā)性化合物有4種（己酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、苯乙醇），氮源處理組關(guān)鍵揮發(fā)性化合物有5種（乙酸異戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇）。適量添加有機(jī)氮源可促進(jìn)醋酸發(fā)酵過程，最大限度發(fā)揮醋酸桿菌的發(fā)酵潛力，增強(qiáng)菠蘿果醋的抗氧化性，提升總酚、總黃酮含量和菠蘿果醋風(fēng)味。

關(guān)鍵詞：菠蘿果醋；碳氮源；發(fā)酵；理化指標(biāo)；風(fēng)味物質(zhì)中圖分類號：TS275.4""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Effects"of"Different"Carbon"and"Nitrogen"Sources"on"Physicochemical"Properties"and"Volatile"Components"of"Pineapple"Vinegar

WANG"Xiaofang1，"HE"Jiayuan2，"GONG"Xiao1，"YUAN"Yuan1，"CHEN"Wuhai2，"LIU"Fei1，"ZHANG"Li1，"ZHOU"Wei1*

1."Agricultural"Products"Processing"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Zhanjiang，"Guangdong"524001，"China;"2."Laboratory"of"Agricultural"Products"Processing"Quality"and"Safety"Risk"Evaluation，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs，"Zhanjiang，"Guangdong"524001，"China

Abstract："Considering"the"deficiencies"such"as"low"substrate"utilization"rate，"prone"to"lose"typical"flavor，"and"weak"taste"in"liquid"fermentation"process"of"pineapple"vinegar，"the"paper"intended"to"explore"the"effects"of"different"carbon"sources"（sucrose，"inulin）"and"nitrogen"sources"（chromium-rich"yeast，"soybean"protein）"on"the"physicochemical"indexes"（total"acid，"reducing"sugar，"total"polyphenols"and"total"acid），"antioxidant"activity"（DPPH"free"radical"and"ABTS+"clearance"rate）"and"volatile"components"in"the"fermentation"process"of"pineapple"vinegar，"which"was"aimed"to"improve"substrate"utilization"and"vinegar"quality."The"results"showed"that"not"only"different"carbon"sources"and"but"also"nitrogen"sources"could"significantly"increase"the"acid"production"of"acetic"acid"bacteria，"and"the"abilities"of"nitrogen"sources"to"promote"the"utilization"of"reducing"sugar"and"acid"production"of"acetic"acid"bacteria"were"better"than"that"of"carbon"sources."The"nitrogen"source"had"higher"effects"on"the"contents"of"total"polyphenols，"total"flavonoids"and"the"ability"of"scavenging"DPPH"and"ABTS"free"radicals"than"carbon"source."Besides，"a"total"of"37"volatile"components"were"detected"in"pineapple"vinegar"under"four"treatments，"mainly"included"esters，"alcohols，"acids，"phenols，"ketones"and"so"on."The"total"concentration"of"volatile"components"of"pineapple"vinegar"in"nitrogen"source"treatments"was"higher"than"that"in"carbon"source"treatments."The"concentrations"of"esters"and"acids"were"the"highest"with"value"of"3712.37"μg/L"and"972.97"μg/L，"and"were"6.39"times"and"8.76"times"of"those"in"the"sucrose"treatment，"respectively."Compared"with"sucrose"treatment，"the"total"concentration"of"volatile"components"in"other"treatments"increased"by"3.78-5.19"times."There"were"two"key"volatile"compounds"in"the"sucrose"treatment"（ethyl"decanoate"and"phenylethanol），"ethyl"caproate，"isoamyl"acetate，"ethyl"decanoate"and"phenyl"ethyl）"were"key"volatile"compounds"in"the"inulin"treatment，"and"five"key"volatile"compounds"in"the"nitrogen"source"group"were"isoamyl"acetate，"ethyl"caproate，"ethyl"decanoate，"linalool"and"phenylethanol."Appropriate"addition"of"organic"nitrogen"source"could"promote"acetic"acid"fermentation"process，"maximize"the"fermentation"potential"of"acetobacter，"enhance"antioxidant"activity"of"pineapple"vinegar，"to"improve"the"content"of"total"phenol"and"total"flavone，"and"pineapple"vinegar"flavor.

Keywords："pineapple"vinegar;"carbon"and"nitrogen"sources;"ferment;"physicochemical"indicators;"flavor"substance

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.017

菠蘿是我國重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，口感酸甜適宜，含有豐富的維生素和可以分解蛋白質(zhì)的“菠蘿朊酶”，具有促進(jìn)消化等作用，深受消費者喜愛[1]。但成熟的菠蘿果實不耐貯存，目前我國菠蘿加工產(chǎn)品主要是果汁、果干、果醬及罐頭等，附加值較低，且加工率低，不足總產(chǎn)量的10%，產(chǎn)業(yè)發(fā)展不均衡[2]。用新鮮菠蘿經(jīng)微生物發(fā)酵制備果醋，是其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的可行之路。

關(guān)于果醋生產(chǎn)工藝與技術(shù)的研究是當(dāng)前的研究熱點。果醋的加工工藝主要有發(fā)酵法、蒸餾法和萃取法等，其中，發(fā)酵法因其能夠較好地保留水果的風(fēng)味和營養(yǎng)成分，被廣泛應(yīng)用于果醋生產(chǎn)[3]。果醋發(fā)酵是以果品為原料釀制果醋，發(fā)酵過程需經(jīng)過2個階段，即酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵[4]。目前普遍采用液態(tài)兩段發(fā)酵法，但尚無針對果醋的專門酵母菌。其中，酒精發(fā)酵多選用葡萄酒酵母，而醋酸發(fā)酵大多采用醋酸菌。氮源、糖度、溫度、接種量、初始pH及發(fā)酵時間等是影響酒精發(fā)酵的主要因素，而影響醋酸發(fā)酵的主控因子有溫度、接種量、初始酒精度、裝液量、通風(fēng)量、初始pH等[5]。若以果酒為原料，則只需進(jìn)行醋酸發(fā)酵。醋酸菌的生長代謝需要特定的環(huán)境，包含氮源、碳源、水、生長因子等底物成分。醋酸菌在不同生長時期，對底物成分的要求也有差異[6]。已有研究表明，醋酸發(fā)酵過程中，碳源的含量和種類與醋酸菌的生長、繁殖能力有極大關(guān)系，有機(jī)氮源是醋酸發(fā)酵的限制因素[7-8]。發(fā)酵液中添加不同碳源、氮源，可以直接影響發(fā)酵菌群動態(tài)，從而影響發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)[9]。

果醋風(fēng)味是衡量果醋品質(zhì)的重要指標(biāo)，其主要包含酯類、醇類、醛類、酚類、有機(jī)酸等，其中有機(jī)酸是主要呈酸物質(zhì)；酸類、酯類和芳香醇類是果醋的主要風(fēng)味物質(zhì)[10]。如何提高或保持果醋品質(zhì)及風(fēng)味是當(dāng)前果醋加工的研究熱點，發(fā)酵工藝技術(shù)或措施的優(yōu)化是提高或保持果醋品質(zhì)及風(fēng)味的有效途徑。目前，研究果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化主要選取2～3個變量，主要是酒精發(fā)酵階段的接種量、糖度、溫度和時間，以及醋酸發(fā)酵階段的接種量、酒精度、溫度和時間[11]。而關(guān)于發(fā)酵過程中營養(yǎng)源對果醋品質(zhì)及風(fēng)味影響的研究相對匱乏。菠蘿因自身香氣特點，導(dǎo)致菠蘿果醋發(fā)酵過程中的底物利用率低，且易失去典型香氣和風(fēng)味[12]。ANTIKA等[13]嘗試將菠蘿果肉、果皮和火龍果汁混合進(jìn)行表面培養(yǎng)發(fā)酵，以期提高菠蘿果醋品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)菠蘿果肉、果皮和火龍果汁混合發(fā)酵果醋的抗氧化活性最高，但其特征性香氣成分乙酸異丁酯和2，3-丁二醇含量不理想，且整個發(fā)酵周期長達(dá)20"d，不利于工業(yè)化生產(chǎn)[14]。鑒于此，本研究擬通過向菠蘿果醋發(fā)酵液中添加不同碳源（蔗糖、菊粉）、氮源（富鉻酵母、大豆蛋白），探究發(fā)酵過程中菠蘿果醋還原糖、總酸、總多酚、總黃酮和抗氧化性等的變化規(guī)律，及最終發(fā)酵液的風(fēng)味物質(zhì)成分含量特征，闡明不同碳源、氮源對菠蘿果醋最終品質(zhì)及風(fēng)味的影響，以期提高底物利用率，確定菠蘿果醋發(fā)酵的最佳工藝流程，進(jìn)一步提高菠蘿果醋的品質(zhì)和風(fēng)味，為菠蘿果醋產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試菌種""巴氏醋酸菌（Acetobacter"pasteurianus）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2""菠蘿果酒及碳氮源""菠蘿果酒由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供，酒精度為10%。富鉻酵母抽提物、菊粉、大豆蛋白均購自江蘇佰業(yè)生物科技有限公司；50%高粱酒購自云南易門大龍口酒業(yè)有限公司。

1.1.3""主要試劑""乳酸、酒石酸、抗壞血酸、蘋果酸、富馬酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸均為色譜純，購自上海阿拉丁生化科技股份公司；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液、過硫酸鉀均為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份公司；α-淀粉酶（食品級）購自上海源葉生物科技有限公司；2-辛醇（色譜純）購自美國Sigma公司；兒茶素、沒食子酸、福林酚、2，2￠-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、DPPH等購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.1.4""儀器與設(shè)備""ZQTY-50ES全溫震蕩培養(yǎng)箱（上海知楚生物科技有限公司）；DNM-9606酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；M8型紫外分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS-QP"2010"plus，AOC-5000頂空、固相微萃取頭，日本島津公司）；超高分辨四級桿組合靜電場軌道肼液質(zhì)聯(lián)用儀（QTOF-LC-"MS，Q"Exactive"Focus，賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2""方法

1.2.1""醋酸發(fā)酵""（1）發(fā)酵液制備。蔗糖發(fā)酵液：用蔗糖調(diào)節(jié)菠蘿果酒的含糖量為8%，用50%高粱酒調(diào)節(jié)酒精度為10%，備用。

菊粉發(fā)酵液：菊粉加熱糊化后添加α-淀粉酶酶解，添加至菠蘿果酒中，調(diào)節(jié)可溶性固形物含量為8%，酒精度為10%，備用。

富鉻酵母發(fā)酵液：在蔗糖發(fā)酵液中添加2%體積分?jǐn)?shù)富鉻酵母粉，備用。

大豆蛋白發(fā)酵液：在蔗糖發(fā)酵液中添加2%體積分?jǐn)?shù)大豆蛋白，備用。

（2）接種及發(fā)酵。將活化后的醋酸菌種按2%體積分?jǐn)?shù)接種至發(fā)酵液中，置于三角瓶中，于32"℃，200"r/min振蕩培養(yǎng)7"d，每隔24"h于超凈臺中取樣，置于–20"℃保存，備用。

1.2.2""理化指標(biāo)測定""總酸：采用GB"12456—2021中的酸堿指示劑滴定法測定總酸，以乙酸計。

酒精度：采用GB"5009.225—2023中的蒸餾比重法測酒精度。

還原糖：采用費林試劑法測定還原糖含量。

總酚：參照王華[14]的Folin-Ciocalteu法測定總酚含量。擬合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品含量（x，"mg）與765"nm波長處吸光度（y）的曲線為：y=0.0124x（R2=0.9992）。

總黃酮：參照杭書揚等[15]的方法，采用比色法測定總黃酮含量。兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品含量（x，"mg）與510"nm波長處吸光度（y）的曲線為：y="3.4367x+0.0315（R2=0.9974）。

1.2.3""揮發(fā)性物質(zhì)測定""參照CHEN等[16]的方法，略作修改，采用HS-SPME-GC-MS及2-辛醇內(nèi)標(biāo)法測定揮發(fā)性物質(zhì)含量。樣品前處理：取8.00"mL樣品置于15"mL頂空瓶中，加入10.00"μL濃度為0.16"g/L的2-辛醇溶液，置于進(jìn)樣器中檢測。注意內(nèi)標(biāo)隨加隨測，避免時間太久，內(nèi)標(biāo)物和樣品反應(yīng)。每組重復(fù)3次。頂空固相微萃取：于250"℃老化60"min，采用CAR/PDMS萃取纖維頭，于50"℃頂空吸附25"min，于250"℃解析3"min。GC-MS條件：柱箱溫度為45.0"℃，進(jìn)樣溫度為250.00"℃，進(jìn)樣時間為1.00"min，柱流量為1.08"mL/min，為不分流進(jìn)樣模式，離子源溫度為230.00"℃，色譜柱為AgilentHP-5MS。應(yīng)用GC-MS內(nèi)置的NIST11s.lib譜庫對檢測到的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，選取匹配度≥80%的數(shù)據(jù)，以2-辛醇（色譜純）為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)峰面積歸一法計算各揮發(fā)性成分的相對含量。

1.2.4""有機(jī)酸測定""樣品前處理：參照鄭海宏等[17]的方法，吸取1.00"mL發(fā)酵液，稀釋100倍，用0.45"μm水系針頭過濾器過濾后待檢測。

高效液質(zhì)聯(lián)用儀：色譜柱為ZORBAX"Eclipse"Plus"C18（150"mm×3.0"mm，"2.6"μm），流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈，流速為0.40"mL/min，柱溫為35"℃，進(jìn)樣量為5.00"μL，分析時間為15"min。梯度洗脫程序：0～2"min，2%～5%"B；2～"5"min，5%～20%"B；5～8"min，20%～80%"B；8～"9"min，80%～100%"B；9～13"min，100%"B；13～"14"min，100%～2%"B；14～15"min，2%"B。

在HESI源、負(fù)離子模式下分別進(jìn)行檢測。質(zhì)譜條件：離子源溫度為320"℃，傳輸金屬毛細(xì)管溫度為400"℃，S-lens"RF水平為50，噴霧電壓為3200"V，掃描范圍為50～400（m/z），一級質(zhì)譜全掃描分辨率為70"000，C-trap最大注入時間為200"ms。二級子離子全掃描（ddms2）分辨率為17"500，碰撞能（stepped"NCE）為80"V，C-trap最大容量（AGCtarget）為2×105，C-trap最大注入時間為60"ms，動態(tài)排除時間為8"s。

1.2.5""抗氧化活性測定""DPPH自由基（DPPH·）清除能力測定。參考王彥兵等[18]的方法測定DPPH·清除能力，略作改動。2.00"mL不同濃度的樣品溶液與2.00"mL"DPPH乙醇溶液（0.10"mmol/L）混合，室溫避光反應(yīng)30"min，在517"nm處測定樣品的吸光值（A）；空白組反應(yīng)體系為2.00"mL超純水與2.00"mL"DPPH溶液混合，室溫避光反應(yīng)30"min，測得其吸光值（A0）。按以下公式計算DPPH·清除能力：DPPH·清除率="（A0–A）/A0×100%。

ABTS+清除能力測定。將1.92"g"ABTS和0.33"g過硫酸鉀溶于水中，定容至500"mL，于黑暗中放置12～16"h，使二者充分反應(yīng)得到ABTS+母液（4"℃下可長期保存）。使用前將ABTS+母液稀釋至使其734"nm處的吸光值為0.70±0.05。測定時，將0.60"mL樣品與3.40"mL"ABTS+溶液混合，于25"℃條件下反應(yīng)6"min，在734"nm處測定其吸光值（A1），空白組反應(yīng)體系為0.60"mL超純水與3.40"mL"ABTS+溶液混合，相同條件下反應(yīng)后，測定其吸光值（A2）。按以下公式計算ABTS+的清除能力：ABTS+清除率=（A2–A1）/A2×100%。

1.3""數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft"Excel"2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，通過IBM"SPSS"Statistics"22.0軟件進(jìn)行顯著性分析（Plt;0.05）。利用Origin"2022軟件繪制柱狀圖和折線圖。試驗設(shè)置3次重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2""結(jié)果與分析

2.1""不同碳源、氮源對菠蘿果醋總酸、還原糖含量的影響

不同碳源（蔗糖、菊粉）、氮源（富鉻酵母、大豆蛋白）對菠蘿果醋總酸含量的影響如圖1所示。由圖1A、圖1B可知，隨著發(fā)酵時間的延長，菠蘿果醋的總酸含量逐漸增加。第7天發(fā)酵結(jié)束時，各處理組菠蘿果醋的總酸含量增加了23.4～35.5倍，表明在菠蘿發(fā)酵果醋過程中，添加不同碳源、氮源可顯著提高醋酸菌的產(chǎn)酸量。進(jìn)一步利用線性方程對菠蘿果醋總酸含量與發(fā)酵時間的關(guān)系進(jìn)行擬合，結(jié)果表明，添加蔗糖、菊粉、富鉻酵母、大豆蛋白后菠蘿果醋的總酸含量與發(fā)酵時間呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01）。由圖1A、圖1B中擬合的線性方程斜率可以看出，不同碳源、氮源促進(jìn)醋酸菌產(chǎn)酸的順序為大豆蛋白（1.01）gt;富鉻酵母（0.87）gt;蔗糖（0.83）gt;菊粉（0.67），表明在菠蘿果醋發(fā)酵過程中添加氮源促進(jìn)醋酸菌產(chǎn)酸的能力優(yōu)于碳源。這與前人的研究結(jié)果[11]一致。添加大豆蛋白的總酸含量高于富鉻酵母，這可能是由于大豆蛋白含有的氨基酸種類更豐富，更能滿足醋酸菌生長的需求，在發(fā)酵過程中促進(jìn)醋酸菌代謝效果更加明顯。

在發(fā)酵過程中，還原糖是微生物可利用的底物，測定發(fā)酵過程中的還原糖含量，即可表征發(fā)酵過程中菌群對底物的利用情況。如圖1、圖2所示，隨著發(fā)酵時間的延長，菠蘿果醋中的還原糖含量逐漸降低；至發(fā)酵結(jié)束，菠蘿果醋中的還原糖的含量為發(fā)酵初期的24.7%～38.9%，表明添加不同碳源、氮源可促進(jìn)醋酸菌對底物的利用。其中，添加不同碳源、氮源后，菠蘿發(fā)酵果醋中的還原糖含量存在顯著差異，即添加富鉻酵母和菊粉后菠蘿果醋中的還原糖含量顯著高于添加蔗糖和大豆蛋白。同時，利用線性方程擬合菠蘿果醋中的還原糖含量與發(fā)酵時間的關(guān)系，結(jié)果表明，添加蔗糖、菊粉、富鉻酵母、大豆蛋白后菠蘿果醋中的還原糖含量與發(fā)酵時間呈極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01）。由圖1C、圖1D線性方程斜率可以看出，不同碳源、氮源促進(jìn)醋酸菌利用還原糖的順序為菊粉（–0.74）gt;蔗糖（–0.82）gt;富鉻酵母（–0.85）gt;大豆蛋白（–0.85），表明在菠蘿發(fā)酵果醋過程中添加氮源后促進(jìn)醋酸菌利用還原糖的能力優(yōu)于碳源，這與前人的研究結(jié)果[19]一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在菠蘿果醋發(fā)酵過程中，總酸與還原糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01）。

綜上，菠蘿果醋發(fā)酵過程中添加碳源、氮源可以促進(jìn)醋酸菌對底物的利用進(jìn)而提高產(chǎn)酸量，并且氮源對醋酸菌的促進(jìn)作用優(yōu)于碳源，其中大豆蛋白對底物的利用率最高，產(chǎn)酸量最大，菊粉對底物的利用率最低，產(chǎn)酸量最小。

2.2""不同碳源、氮源對菠蘿果醋抗氧化活性的影響

不同碳源、氮源對菠蘿果醋的生物活性也會產(chǎn)生一定影響（圖3）。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，添加菊粉、大豆蛋白后菠蘿果醋DPPH自由基清除率呈逐漸上升的趨勢，并且大豆蛋白處理對DPPH自由基的清除率極顯著高于菊粉（Plt;0.01）；添加蔗糖、富鉻酵母后菠蘿果醋DPPH自由基清除率呈先升后降的趨勢，發(fā)酵至第6天時蔗糖處理對DPPH自由基的清除率顯著低于發(fā)酵第1天的（Plt;0.05）。與蔗糖處理相比，菊粉、大豆蛋白、富鉻酵母處理的菠蘿果醋DPPH自由基清除率提高了15.3%～41.6%。由此可知，不同碳源、氮源對菠蘿果醋清除DPPH自由基能力順序為：大豆蛋白gt;富鉻酵母gt;菊粉gt;蔗糖（Plt;0.01），同時也表明氮源對菠蘿果醋清除DPPH自由基的能力優(yōu)于碳源，其中添加大豆蛋白對菠蘿果醋DPPH自由基清除率最高。隨著發(fā)酵時間的延長，添加大豆蛋白后菠蘿果醋ABTS+清除率呈先升后降的趨勢，至發(fā)酵結(jié)束時大豆蛋白對ABTS+清除率在4個處理組中仍為最高；添加菊粉、富鉻酵母后菠蘿果醋ABTS+清除率呈持續(xù)上升的趨勢，并且富鉻酵母處理的ABTS+清除率高于菊粉；添加蔗糖后菠蘿果醋ABTS+清除率則呈持續(xù)下降的趨勢。至發(fā)酵結(jié)束時，蔗糖處理的ABTS+清除率降低了42.9%，而大豆蛋白、富鉻酵母、菊粉處理的ABTS+清除率提高了8.74%～39.8%。據(jù)此可知，不同碳源、氮源對菠蘿果醋清除ABTS自由基能力順序為：大豆蛋白gt;富鉻酵母gt;菊粉gt;蔗糖（Plt;0.01），這與不同處理后菠蘿果醋DPPH自由基清除率結(jié)果一致。與碳源（尤其是蔗糖）相比，添加氮源可持續(xù)穩(wěn)定地提高菠蘿果醋清除ABTS自由基的能力，工業(yè)生產(chǎn)菠蘿果醋時可將其作為優(yōu)質(zhì)的輔料添加到發(fā)酵液中以提高菠蘿果醋的品質(zhì)。

2.3""不同碳源、氮源對菠蘿果醋發(fā)酵過程中總酚、總黃酮的影響

由圖4A可知，添加碳源后，隨著發(fā)酵時間的延長，菠蘿果醋的總酚含量呈先增后降的趨勢，發(fā)酵至第3、4天時其含量達(dá)最大值，其中，添加菊粉的總酚含量為179.65"mg/L，添加蔗糖的總酚含量為160.66"mg/L；而添加氮源富鉻酵母和大豆蛋白后，菠蘿果醋的總酚含量呈持續(xù)增加的趨勢，至發(fā)酵結(jié)束時其含量達(dá)最大值，添加富鉻酵母的總酚含量為203.68"mg/L，添加大豆蛋白的總酚含量為236"mg/L。就總黃酮含量而言（圖4B），隨

著發(fā)酵時間的延長，添加不同碳源、氮源后其濃度變化波動較大，除蔗糖處理組以外，其他處理的總黃酮含量總體均呈逐漸增加趨勢。至發(fā)酵結(jié)束時，蔗糖、菊粉、富鉻酵母、大豆蛋白處理的菠蘿果醋總黃酮含量分別增加了-8.78%、2.93%、32.5%、21.3%。添加不同碳源、氮源的菠蘿果醋最終發(fā)酵液中總酚、總黃酮含量順序為：大豆蛋白gt;富鉻酵母gt;菊粉gt;蔗糖。由此表明，菠蘿果醋的總酚、總黃酮含量與DPPH自由基、ABTS+清除率均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01），這與WANG等[20]的研究結(jié)果一致。

2.4""不同碳源、氮源對菠蘿果醋揮發(fā)性物質(zhì)的影響

采用固相微萃取技術(shù)提取進(jìn)樣后，經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜（SPME-GC-MS/MS）分析，對添加不同碳源、氮源處理的4種菠蘿果醋的揮發(fā)性物質(zhì)與NIST14s.lib譜庫進(jìn)行比較，相似度高于80%予以保留，鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)種類的數(shù)量、質(zhì)量濃度以及相關(guān)閾值結(jié)果見表1。表中相關(guān)化合物閾值參考《化合物香味閾值匯編》[21]。

由表1、圖5可知，在4種處理的菠蘿果醋最終發(fā)酵液中共檢測出37種揮發(fā)性化合物，在蔗糖、菊粉、富鉻酵母、大豆蛋白處理的菠蘿果醋中分別檢出33、29、30、30種揮發(fā)性成分，主要是醇類、酯類、酸類、酚類、酮類。其中酯類的數(shù)量極顯著高于其他揮發(fā)性組分（Plt;0.01），是重要的揮發(fā)性物質(zhì)。碳源處理的菠蘿果醋中酯類的數(shù)量高于氮源處理，但是碳源處理的酯類成分總濃度低于氮源組。OAV值為感官閾值與揮發(fā)性組分濃度的比值。由于化合物含量的多少并不能代表其對整體香氣貢獻(xiàn)，通過OAV值能更準(zhǔn)確地判斷物質(zhì)的貢獻(xiàn)大小，一般認(rèn)為OAV≥1的化合物對整體風(fēng)味具有貢獻(xiàn)，定為關(guān)鍵化合物；0.1≤OAVlt;1，說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味有修飾作用[22]。蔗糖處理中OAVgt;1的關(guān)鍵化合物有2種，為癸酸乙酯和苯乙醇；菊粉處理的的關(guān)鍵化合物有4種，為己酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、苯乙醇；氮源處理的關(guān)鍵化合物有5種，為己酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇。

由圖5可知，添加富鉻酵母的發(fā)酵液酯類、酸類化合物的質(zhì)量濃度最高，分別為（3712.37±"128.43）、（972.97±46.57）μg/L，分別是添加蔗糖發(fā)酵液的6.39倍、8.76倍。與蔗糖處理相比，其他處理的菠蘿果醋中各類揮發(fā)性成分總濃度增加了3.78～5.19倍。

成熟的菠蘿果實中主要特征揮發(fā)性化合物為己酸甲酯、己酸乙酯、3-甲基硫丙酸乙酯和1-（E，Z）-3，5-十一丁烯[23]。在本研究的4種處理菠蘿果醋中未檢測出己酸甲酯和1-（E，Z）-3，5-十一丁烯，3-甲基硫丙酸乙酯在碳源處理中OAVlt;0.1，氮源處理中OAVgt;0.1，遠(yuǎn)低于鮮果中的含量。推測可能是由于己酸甲酯、1-（E，Z）-3，5-十一丁烯類化合物較活潑，在發(fā)酵過程中易散失，從而使菠蘿果醋易失去典型風(fēng)味。

由表1、圖5可知，4種處理的菠蘿果醋主要揮發(fā)性物質(zhì)為酯類、高級醇類。氮源處理的乙酸酯類和乙酯類成分含量較高，是重要的呈味揮發(fā)性物質(zhì)。乙酸異戊酯和己酸乙酯呈現(xiàn)典型的香蕉、梨風(fēng)味，癸酸乙酯具有花香、水果香[24]，這些物質(zhì)共同賦予菠蘿果醋柔和的花、果香。研究認(rèn)為乙酯類物質(zhì)和脂肪酸（異戊酸、己酸、辛酸）是由發(fā)酵過程中酶促產(chǎn)生的[25]，但是4種處理的菠蘿果醋中脂肪酸含量遠(yuǎn)低于其氣味閾值，因此不同處理可能對感官特征無影響。苯乙醇由發(fā)酵過程中產(chǎn)生的支醇和芳香化合物反應(yīng)生成，具有花香和甜香的味道，對菠蘿果醋風(fēng)味具有積極貢獻(xiàn)[26]。已有研究表明，成熟的菠蘿鮮果中含有少量芳樟醇[27]，但是釀酒酵母等微生物也可以代謝生成芳樟醇[28]。菠蘿果醋中的芳樟醇是來源于果實、釀酒酵母還是巴氏醋酸菌？還需進(jìn)一步從起始的菠蘿果酒發(fā)酵過程中跟蹤觀測。

結(jié)合2.1中的總酸含量結(jié)果，可以確定菠蘿果醋中的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為乙酸、乙酸異戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇。也表明在菠蘿發(fā)酵果醋過程中適量添加富鉻酵母、大豆蛋白等有機(jī)氮源，可以增加發(fā)酵液中的酯類物質(zhì)含量。

綜上，就菠蘿果醋中酯類的數(shù)量而言，碳源處理顯著高于氮源處理；但就果醋中酯類、酸類的含量而言，其他處理高于蔗糖處理。從OAV值分析來看，適當(dāng)添加其他碳源或者有機(jī)氮源，可有效增加菠蘿果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。

2.5""不同碳源、氮源對菠蘿果醋有機(jī)酸含量的影響

有機(jī)酸類是評價發(fā)酵果醋品質(zhì)的重要指標(biāo)。4種處理菠蘿果醋中，琥珀酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸是有機(jī)酸的主要成分（占比為90.2%～"94.2%），含量最高可達(dá)4.35"g/L；并且碳源處理菠蘿果醋中的有機(jī)酸總含量（11.8～14.9"g/L）高于氮源處理（8.15～8.19"g/L，圖6）。單因素方差分析結(jié)果表明，添加蔗糖、菊粉、大豆蛋白、富鉻酵母后菠蘿果醋中的8種有機(jī)酸含量均存在極顯著差異（Plt;0.01）。不同處理菠蘿果醋的乳酸含量順序為富鉻酵母gt;蔗糖gt;菊粉gt;大豆蛋白，而其他7種有機(jī)酸含量在菠蘿果醋中均表現(xiàn)為碳源gt;氮源。這與總酸含量的變化趨勢相反，其原因可能是添加氮源后提高了菠蘿果醋的酸類含量，并進(jìn)一步促進(jìn)有機(jī)酸與醇類反應(yīng)進(jìn)而增加酯類的含量，其他處理的菠蘿果醋中酯類和酸類含量高于蔗糖處理，而醇類含量低于蔗糖處理佐證了上述推論。為進(jìn)一步證實上述差異的原因，后期應(yīng)動態(tài)監(jiān)測菠蘿果醋發(fā)酵過程中的有機(jī)酸的日變化特征。

3""討論

果醋因其具有抗氧化、抗疲勞、提高免疫力、促進(jìn)消化等功能，越來越受到人們的關(guān)注[29]，菠蘿在加工、發(fā)酵過程中會損失部分風(fēng)味物質(zhì)，導(dǎo)致菠蘿果醋滋味寡淡[30]。風(fēng)味成分是評價菠蘿果醋品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，也是當(dāng)前的研究熱點[31]。為了提升菠蘿果醋的風(fēng)味，顏韶波等[32]采用菠蘿和菠蘿蜜復(fù)合發(fā)酵。為了提高醋酸菌的發(fā)酵效率，張曉輝等[33]在發(fā)酵過程中添加營養(yǎng)鹽，但是添加營養(yǎng)鹽不僅成本高，而且不能滿足市場需求。本研究通過改變發(fā)酵液的營養(yǎng)源種類，添加不同的且易于獲得的有機(jī)碳源、氮源以促進(jìn)醋酸菌生長代謝，提升底物利用率，從而提升菠蘿果醋的品質(zhì)與風(fēng)味。結(jié)果表明，在菠蘿果醋發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長（0～7"d），添加不同碳源（蔗糖、菊粉）、氮源（富鉻酵母、大豆蛋白）后菠蘿果醋的總酸含量逐漸上升，而還原糖含量則逐漸降低。HU等[34]研究表明，菠蘿果醋發(fā)酵過程中，總酸含量在發(fā)酵初期（0～4"d）快速增加，之后增加速度逐漸減緩。還原糖含量降低的原因可能是還原糖是發(fā)酵的主要底物，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醋酸菌將大部分還原糖轉(zhuǎn)化為酒精，因此還原糖的含量會逐漸減少[4]。

就菠蘿果醋抗氧化活性而言，添加菊粉、大豆蛋白后菠蘿果醋的DPPH自由基清除率呈上升趨勢，而添加蔗糖、富鉻酵母后菠蘿果醋的DPPH自由基清除率則呈先升后降的趨勢；添加菊粉、富鉻酵母后菠蘿果醋ABTS+清除率呈持續(xù)上升的趨勢，而添加蔗糖后菠蘿果醋ABTS+清除率則持續(xù)下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，添加碳源后，菠蘿果醋的總酚含量呈先增加后降低的趨勢，發(fā)酵3～4"d時其含量到達(dá)最高；添加氮源后，菠蘿果醋的總酚含量呈持續(xù)增加的趨勢。添加不同碳源、氮源后總黃酮含量的變化波動較大，除蔗糖處理外，其他處理的總黃酮含量總體均呈增加的趨勢；碳源處理后菠蘿果醋的有機(jī)酸總含量高于氮源處理。HU等[34]研究表明，在菠蘿果醋發(fā)酵的初期（0～4"d），抗氧化活性顯著增強(qiáng)；并且在發(fā)酵后期，菠蘿果醋的抗氧化活性繼續(xù)緩慢上升。這主要歸功于總酚、總黃酮含量的上升，這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠有效清除DPPH自由基和ABTS+[35]。并且總酚含量與果醋的抗氧化能力呈正相關(guān)關(guān)系。在菠蘿果醋的發(fā)酵過程中，總酚含量的變化直接影響果醋的抗氧化活性[36]。其次，有機(jī)酸（特別是乙酸）也能顯著影響果醋的抗氧化活性，在菠蘿果醋發(fā)酵過程中，乙酸含量的上升有助于提高果醋的抗氧化能力[34]。此外，乙基-"2-甲基丁酸酯的OAV值顯著增加，為菠蘿果醋帶來甜味同時也增強(qiáng)其抗氧化活性。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不同碳源、氮源均可顯著提高醋酸菌的產(chǎn)酸量，降低還原糖含量。不同碳源、氮源促進(jìn)醋酸菌產(chǎn)酸的順序為大豆蛋白gt;富鉻酵母gt;蔗糖gt;菊粉，表明菠蘿果醋中添加氮源能促進(jìn)醋酸菌利用還原糖，其產(chǎn)酸能力優(yōu)于碳源；添加有機(jī)氮源可以提高醋酸菌底物利用率，促進(jìn)總酸生成。菠蘿果醋發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量變化與DPPH、ABTS自由基清除率的變化趨勢一致，碳源處理的總酚、總黃酮含量、DPPH、ABTS自由基清除率在發(fā)酵第4天均達(dá)到最大值，之后逐漸降低。氮源處理的總酚、總黃酮含量、DPPH、ABTS自由基清除率持續(xù)升高。氮源處理的總酚、總黃酮含量以及對菠蘿果醋清除DPPH、ABTS自由基的能力優(yōu)于碳源組，其中添加大豆蛋白的菠蘿果醋生物活性最優(yōu)。而菠蘿果醋中有機(jī)酸含量與總酸含量的變化趨勢相反，琥珀酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸是果醋中有機(jī)酸的主要成分。碳源處理的菠蘿果醋有機(jī)酸含量總體高于氮源處理，但富鉻酵母處理的菠蘿果醋蘋果酸和乳酸含量高于蔗糖處理，蘋果酸和乳酸使果醋口感更加柔和，有利于減少乙酸刺激性，說明添加富鉻酵母氮源后，有助于提升菠蘿果醋口感。與發(fā)酵初始階段相比，菠蘿果醋酸味明顯，同時伴有咸味和鮮味，且后味、苦味和澀味較弱。在發(fā)酵過程中，菠蘿果醋的苦味降低，而酸度和收斂性增加[34]。

果醋含有豐富的有機(jī)酸、醋酸、糖、各類氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)等[3]。在4種不同處理菠蘿果醋最終發(fā)酵液中共檢測出37種揮發(fā)性化合物，主要是醇類、酯類、酸類、酚類、酮類。碳源處理的菠蘿果醋中揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量高于氮源處理，但其濃度低于氮源處理。前人研究表明，在發(fā)酵的前4"d，菠蘿果醋的揮發(fā)性化合物特征發(fā)生了明顯變化，而后趨于穩(wěn)定[34]。蔗糖處理的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物有2種（癸酸乙酯，苯乙醇），菊粉處理的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物有4種（己酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、苯乙醇），氮源處理的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物有5種（乙酸異戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇）。由此可知菠蘿果醋中對風(fēng)味有影響的揮發(fā)性物質(zhì)為乙酸異戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇。在添加菊粉等碳源，或者在蔗糖碳源基礎(chǔ)上適量添加有機(jī)氮源，有利于菠蘿果醋中酸類、醇類濃度的增加，從而有利于醋酸菌酶促反應(yīng)，提升酯類物質(zhì)的積累。而前人研究進(jìn)一步揭示了菠蘿果醋發(fā)酵過程中風(fēng)味的變化特征[34]。就香氣而言，在發(fā)酵初期（0～4"d），菠蘿果醋的風(fēng)味變化顯著。作為發(fā)酵原材料的菠蘿果酒花香逐漸消失，被乙酸和乙基-2-甲基丁酸酯的豐富脂肪和水果香氣所取代。隨著發(fā)酵時間的增加，酒精的相對含量逐漸降低，而萜烯類、芳香類化合物的相對含量顯著增加，這表明在發(fā)酵過程中，酒精被消耗的同時產(chǎn)生了各種風(fēng)味物質(zhì)。在醋酸發(fā)酵過程中，菠蘿果醋中的酯類化合物含量顯著降低，大部分酯類化合物的OAV值呈下降趨勢，而有機(jī)酸的OAV值則顯著增加。如乙基-2-甲基丁酸酯的OAV值顯著增加，給菠蘿果醋帶來了甜味，醇類化合物如乙醇、丙醇等的OAV值較高，對菠蘿果醋的香氣有重要貢獻(xiàn)。

綜上所述，適量添加菊粉、富鉻酵母、大豆蛋白等有機(jī)碳源、氮源，可以促進(jìn)菠蘿果醋的發(fā)酵進(jìn)程，增加總酚、總黃酮類物質(zhì)含量，提升抗氧化活性以及揮發(fā)性成分含量，而且添加有機(jī)氮源對整體提升菠蘿果醋品質(zhì)的效果優(yōu)于添加碳源。本研究結(jié)果闡明了菠蘿果醋發(fā)酵液的風(fēng)味物質(zhì)成分含量特征，揭示了不同碳源、氮源對菠蘿果醋品質(zhì)及風(fēng)味的影響，對進(jìn)一步提高菠蘿果醋的品質(zhì)和風(fēng)味，為菠蘿果醋工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

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