荔枝霜疫霉自噬相關(guān)基因PlATG26的鑒定及表達分析

摘""要：Atg26（或Ugt51）是一種UDP-葡萄糖："甾醇葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其調(diào)控甾醇轉(zhuǎn)化成甾醇葡萄糖苷（SG）的生物過程，參與多種細胞自噬過程，在真菌生長發(fā)育及致病性方面具有重要作用。為探究Atg26對荔枝霜疫霉（Peronophythora"litchii）生長發(fā)育及毒性作用的影響，本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)在荔枝霜疫霉中鑒定到6個與釀酒酵母Atg26同源的蛋白。蛋白質(zhì)特性分析發(fā)現(xiàn)，其二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，且具有親水性?；蚪Y(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，除PlATG26a外，其余荔枝霜疫霉的ATG26同源基因均具有內(nèi)含子，且大多分布在基因末端；荔枝霜疫霉中Atg26同源蛋白均含有一個UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucosyl"transferase，UDPGT）的催化結(jié)構(gòu)域，無PH（pleckstrin同源）和GRAM（糖基轉(zhuǎn)移酶、GTPase激活劑和肌管蛋白）功能域。進一步對Atg26同源蛋白進行系統(tǒng)進化和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，荔枝霜疫霉中的Atg26同源蛋白之間存在多樣性，但不同物種中Atg26的CAT結(jié)構(gòu)域具有保守性。蛋白質(zhì)互作預(yù)測和蛋白質(zhì)分子對接分析發(fā)現(xiàn)，PlAtg26的互作蛋白多位于細胞質(zhì)或膜上，集中在細胞代謝過程中，具有催化活性、氧化還原活性或結(jié)合能力。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析發(fā)現(xiàn)，與菌絲階段表達相比，PlATG26b在荔枝霜疫霉游動孢子階段和侵染初期上調(diào)表達，在孢子囊階段和侵染后期無明顯差異，表明PlAtg26可能在荔枝霜疫霉的無性生殖和致病性中發(fā)揮重要作用。綜上所述，PlAtg26與其他真菌中Atg26同源蛋白在結(jié)構(gòu)上具有明顯差異，可能表現(xiàn)出與真菌不一樣的生物學(xué)功能。

關(guān)鍵詞：荔枝霜疫霉；細胞自噬；PlATG26；生物信息學(xué)；qRT-PCR中圖分類號：S667.1""""""文獻標志碼：A

Identification"and"Expression"Analysis"of"PlATG26"in"Peronophythora"litchii

WANG"Xuejian1，2，"YANG"Chengdong1，2，"YU"Ge1，2，"JI"Zhenxi1，2，"GUO"Hengyuan1，2，"YE"Linlin1，2，"CHEN"Qinghe1，2*

1."School"of"Breeding"and"Multiplication"（Sanya"Institute"of"Breeding"and"Multiplication），"Hainan"University"/"School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572025，"China;"2."Key"Laboratory"of"Green"Prevention"and"Control"of"Tropical"Plant"Diseases"and"Pests，"Ministry"of"Education，"Haikou，"Hainan"570228，"China

Abstract："Atg26"（or"Ugt51）"is"a"UDP-glucose："sterol"glucosyltransferase，"which"regulates"the"biological"process"of"sterol"conversion"to"sterol"glucoside"（SG），"participates"in"various"cellular"autophagy"processes，"and"plays"an"important"role"in"fungal"growth，"development"and"pathogenicity."In"order"to"investigate"the"role"of"Atg26"in"the"growth，"development"and"virulence"of"Peronophythora"litchii，"six"Atg26"homologous"proteins"were"identified"through"bioinformatics."The"analysis"of"protein"properties"showed"that"the"secondary"structure"of"the"protein"was"mainly"random"curling"and"had"hydrophilic"properties."The"results"of"gene"and"protein"structure"analysis"showed"that"except"PlATG26a，"the"other"ATG26"homologous"genes"of"P."litchii"had"introns，"which"were"mostly"distributed"at"the"end"of"the"gene."All"Atg26"homologous"proteins"contained"the"CAT"catalytic"domain，"but"did"not"have"the"PH"（pleckstrin"homology）"and"GRAM"（glucosyltransferase，"Rab-like"GTPase"activators，"and"myotubularins）"domains"that"make"up"the"PBD"（phosphoinositide"binding"domain）."Further"phylogenetic"and"conserved"motif"analysis"of"Atg26"homologous"proteins"found"that"diversity"existed"among"the"Atg26"homologous"proteins"in"P."litchii，"but"the"CAT"domain"of"Atg26"was"conserved"in"different"species."Protein"interaction"prediction"and"protein"molecular"docking"analysis"showed"that"the"interacting"proteins"of"PlAtg26"were"mostly"located"in"the"cytoplasm"or"membrane，"concentrated"in"the"process"of"cell"metabolism，"and"had"catalytic"activity，"REDOX"activity"or"binding"ability，"which"also"indicated"that"PlAtg26"may"not"require"the"binding"ability"of"GRAM"domain"for"localization."Quantitative"real-time"PCR"（qRT-PCR）"analysis"showed"that"PlATG26b"was"up-regulated"in"zoospore"stage"and"early"infection，"but"had"no"significant"difference"in"sporangium"stage"and"late"infection."This"result"also"indicated"that"Atg26"played"an"important"role"in"the"asexual"reproduction"and"infection"of"P."litchii."In"conclusion，"PlAtg26"and"Atg26"homologues"in"fungi"have"significant"structural"differences"and"may"show"different"biological"functions"from"fungi.

Keywords："Peronophythora"litchii;"autophagy;"PlATG26;"bioinformatics;"qRT-PCR

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.021

中國大陸是全球最大規(guī)模的荔枝（Litchi"chinensis"Sonn.）生產(chǎn)區(qū)，2022年中國大陸荔枝種植面積約52.61萬hm2，基本保持穩(wěn)定；荔枝產(chǎn)量約222.27萬t[1]。由荔枝霜疫霉（Peronophythora"litchii"Chen"ex"Ko"et"al.）侵染引起的荔枝霜疫病嚴重影響荔枝的生長發(fā)育，是影響我國荔枝產(chǎn)量及產(chǎn)后最為嚴重的病害[2]。荔枝霜疫霉主要為害荔枝的果實，也會影響花穗和葉片，為害嚴重時，損失率可達30%～60%[3-5]。荔枝霜疫霉首次在中國臺灣荔枝病果上發(fā)現(xiàn)，其孢囊梗為多級有限生長，形態(tài)與霜霉菌相似，但其他特性及基因組的序列特征與疫霉菌相似，將其歸于霜疫霉屬[6]。

自噬（autophagy）是真核生物體內(nèi)一種進化保守的生物學(xué)過程，是指細胞受到自噬起始信號后，形成雙膜囊泡，即自噬體，隔離細胞器、蛋白質(zhì)或細胞質(zhì)的一部分，以便輸送到溶酶體，進而將其降解的過程[7]。自噬過程受到多個自噬相關(guān)基因（ATG）的調(diào)控，1997年，YOSHINORI"OHSUMI發(fā)現(xiàn)并克隆到酵母中第一個自噬相關(guān)基因ATG1，目前在酵母中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了45個自噬相關(guān)基因[8-9]。

根據(jù)細胞內(nèi)容物進入溶酶體的不同方式，細胞自噬被分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，而自噬根據(jù)底物的不同還可分為非選擇性自噬（nonselective"autophagy）和選擇性自噬（selective"autophagy）[10-11]。在畢赤酵母中，Atg26（Ugt51）是一種UDP-葡萄糖："甾醇葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，合成一種較小的膜脂質(zhì)甾醇葡糖苷（SG）。該酶含有1個磷酸肌醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PBD）和1個含有UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucosyl"transferase，UDPGT）的催化結(jié)構(gòu)域（catalytic，CAT）[12-13]。其中，PBD結(jié)構(gòu)域包括1個截斷的GRAM（糖基轉(zhuǎn)移酶、GTPase激活劑和肌管蛋白）-PH（pleckstrin同源）[trGRAM-pH]結(jié)構(gòu)域和1個GRAM結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏tg26在自噬體前結(jié)構(gòu)（preauto phagosomal"structure，PAS）的定位至關(guān)重要[12-13]。Atg26在多種絲狀真菌中被鑒定，其功能已被證明與真菌的生長發(fā)育、自噬及毒力相關(guān)。在米曲霉（Aspergillus"oryzae）中，Atg26不僅調(diào)控其過氧化物酶體自噬，還參與其線粒體自噬和細胞自噬，且該基因的缺失會影響米曲霉氣生菌絲和分生孢子的形成[13]。在瓜類炭疽菌（Colletotrichum"orbiculare）中，Atg26調(diào)控其過氧化物酶體自噬但不參與巨自噬，并且通過影響其附著胞內(nèi)部壓力，從而導(dǎo)致致病性的減弱[14]，這些研究結(jié)果表明Atg26在病原真菌生長發(fā)育、細胞自噬和植物致病中發(fā)揮重要作用。但是Atg26在包括荔枝霜疫霉在內(nèi)的植物病原卵菌生長發(fā)育及致病過程中的功能尚未報道。

前期的研究表明，荔枝霜疫霉中已鑒定到多個Atg蛋白，其中PlAtg2、PlAtg3、PlAtg8、PlAtg12對荔枝霜疫霉的生長發(fā)育、致病性以及細胞自噬具有重要作用，但Atg26還未得到鑒定[15-19]。本研究通過同源比對及pfam查找鑒定荔枝霜疫霉中的Atg26同源蛋白，利用生物信息學(xué)對其進一步分析，并通過qRT-PCR探究其在荔枝霜疫霉生長發(fā)育和侵染過程中的表達規(guī)律。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試菌株""荔枝霜疫霉（P."litchii）菌株SHS3為實驗室長期保存。

1.1.2""供試植物""荔枝品種為妃子笑。

1.2""方法

1.2.1""荔枝霜疫霉Atg26的鑒定""荔枝霜疫霉SHS3基因組為實驗室轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，為了鑒定荔枝霜疫霉的Atg26，在文獻中查找真菌中已報道的Atg26同源蛋白，畢赤酵母（Pichia"pastoris）PpAtg26、釀酒酵母（Saccharomyces"cerevisiae）ScAtg26、米曲霉（A."oryzae）AoAtg26、稻瘟菌（Magnaporthe"oryzae）MoAtg26、禾谷鐮刀菌（Fusarium"graminearum）FgAtg26，并從GenBank獲得其氨基酸序列[13，"20-22]。利用NCBI本地blast工具建立荔枝霜疫霉本地數(shù)據(jù)庫，通過Blastp的方法分別將以上Atg26序列在本地數(shù)據(jù)庫中查找，設(shè)置目標功能域的E-value閾值為1e-5。通過pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）搜索PpAtg26的功能域（PF03033、PF00169、PF06722、PF02893），并利用TBtools[23]工具在荔枝霜疫霉數(shù)據(jù)庫中進行hmmsearch，與Blastp查找結(jié)果取交集以獲得候選蛋白。在NCBI"Batch"CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）（Elt;1e-5）上對候選蛋白及已知蛋白進行功能域預(yù)測，并進一步對比。

1.2.2""PlAtg26蛋白理化特性及基因結(jié)構(gòu)分析""利用Expasy-ProtParam（http：//web.expasy.org/"protparam/）對PlAtg26蛋白親水性、等電點及分子式量進行分析；利用PlAtg26及已知蛋白的DNA序列和CDS序列，在TBtools上對其基因結(jié)構(gòu)進行可視化；通過CELLO（http：//cello.life.nctu."edu.tw/）對PlAtg26進行亞細胞定位預(yù)測；利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）預(yù)測分析PlAtg26及其同源序列的保守基序（motif），motif數(shù)量為10，長度為10～60"aa。

1.2.3""PlAtg26蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析""通過SOPMA預(yù)測PlAtg26蛋白二級結(jié)構(gòu)；利用在線工具SWISS-MODEL[24]（https：//swissmodel."expasy.org/）預(yù)測PlAtg26蛋白的三級結(jié)構(gòu)，并進行可視化。

1.2.4""系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建""在GenBank下載大豆疫霉（Phytophthora"sojae）、擬南芥（Arabidopsis"thaliana）、家鼠（Mus"musculus）的基因組數(shù)據(jù)，通過已知的PpAtg26、ScAtg26、AoAtg26和FgAtg26使用Blastp法查找其Atg26同源序列。通過PhyloSuite[25]中的IQ-TREE插件構(gòu)建荔枝霜疫霉、釀酒酵母、畢赤酵母、致病疫霉、大豆疫霉、稻瘟菌、家鼠及擬南芥的Atg26蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。采用maximum"likelihood（ML）法，并設(shè)置ultrafast"bootstrap參數(shù)為1000進行構(gòu)建，其他參數(shù)采用默認值。

1.2.5""蛋白互作分析方法""通過STRING網(wǎng)絡(luò)對PlAtg26蛋白在線分析，發(fā)現(xiàn)PlAtg26在惡疫霉（P."cactorum）中存在對應(yīng)蛋白。利用STRING[26]（https：//cn.string-db.org/）對惡疫霉中對應(yīng)蛋白的互作關(guān)系進行分析，參數(shù)設(shè)置：最低要求交互分數(shù)，中等置信度（0.4000），顯示最大交互數(shù)量不超過10個。

1.2.6""分子對接方法""通過SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對相關(guān)蛋白進行同源建模；利用GRAMM[27]進行分子對接；在PDBePISA（https：//www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/"pistart.html）上分析分子對接結(jié)果，并使用Pymol軟件進行可視化。

1.2.7""PlAtg26b基因克隆及磷酸化位點、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測""將荔枝霜疫霉接種在V8液體培養(yǎng)基（取新鮮V8蔬菜汁過濾100"mL，加超純水定容至1"L）中，25"℃，120"r/min培養(yǎng)2"d，用ddH2O清洗之后收集菌絲提取DNA。引物序列：PlAtg26b-F，5￠-ATGGAGGCCACACAGACG-"3￠；PlAtg26b-R，5￠-TTAAAGAGCAACTGACG"ATG-3￠。PCR反應(yīng)體系：2×Phanta"Max"Master"Mix"（Dye"Plus）"25"μL，Primer"F"/"Primer"R各2"μL，DNA"1"μL，ddH2O"20"μL。通過在線工具NetPhos-3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/ser vices/NetPhos-3.1/）、SignalP-4.1（https：//services."healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和TMHMM-"2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TM HMM-2.0/）預(yù)測PlAtg26b的磷酸化位點、信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.8""荔枝霜疫霉不同時期樣品制備""參考王榮波等[15]的方法收集試驗樣品。將荔枝霜疫霉在V8固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2"d，隨后切割邊緣新鮮菌絲在V8液體培養(yǎng)基中，25"℃，120"r/min培養(yǎng)2"d，用ddH2O清洗之后收集，獲得荔枝霜疫霉?fàn)I養(yǎng)菌絲（MY）；將荔枝霜疫霉在V8固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5"d后，用ddH2O刮洗菌面，用濾紙過濾后，4000"r/min離心10"min后，棄上清后獲得游動孢子囊（SP）樣品；將上述SP樣品在12"℃低溫處理1"h后，轉(zhuǎn)移到25"℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1"h，3800"r/min離心10"min后棄上清液獲得游動孢子（ZO）。不同侵染時期樣品獲得：荔枝霜疫霉在V8液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2"d后，接種在新鮮荔枝嫩葉正面，吸去多余水分后，再蓋上一片嫩葉，放于25"℃黑暗培養(yǎng)。分別于12、24、36、48、60"h收集，其中12"h只收集菌絲，其余時期收集菌絲和葉片，液氮冷凍后，置于–80"℃保存，用于RNA提取。

1.2.9""qRT-PCR分析""內(nèi)參基因actin引物序列：PlAct-F，5￠-TCACGCTATTGTTCGTCTGG-3￠；PlAct-R，5￠-TCATCTCCTGGTCGAAGTCC-3￠；qp-PlAtg26b引物序列：qp-PlAtg26b-F，5￠-CGCA"CGAAATGAAGCTGTCT-3￠，qp-PlAtg26b-R，5￠-GGAGTACTTGAGCGGCTTGT-3￠。在AriaMx"Real-Time"PCR反應(yīng)儀上進行qRT-PCR分析，反應(yīng)體系：2×Q3"SYBR"qPCR"Master"Mix"（Universal）"10"μL，Primer"F"/"Primer"R各0.4"μL，cDNA"2"μL，ddH2O"7.2"μL。反應(yīng)程序：95"℃預(yù)變性30"s；95"℃變性10"s，60"℃退火30"s，循環(huán)40次。以菌絲階段基因表達水平為1，采用比較Ct值法（2–ΔΔCt法）分析PlATG26b在不同時期的相對表達量。每組樣品進行3次重復(fù)。

2""結(jié)果與分析

2.1""荔枝霜疫霉中Atg26同源蛋白的鑒定

為了鑒定荔枝霜疫霉中的Atg26同源蛋白，利用已報道的Atg26蛋白氨基酸序列，通過Blastp方法和HMM方法在荔枝霜疫霉數(shù)據(jù)庫中查找，將其結(jié)果取交集分析，最終確定6個Atg26同源蛋白。

通過pfam網(wǎng)站共獲得酵母Atg26蛋白的4個功能域（PF03033、PF00169、PF06722、PF02893），其中PF00169和PF02893組成PBD結(jié)構(gòu)域，PF03033和PF06722組成CAT結(jié)構(gòu)域。將4個功能域通過hmmsearch的結(jié)果取交集分析，并未在荔枝霜疫霉中發(fā)現(xiàn)同時具有4個功能域的蛋白，且Blastp結(jié)果中的6個蛋白均含有CAT結(jié)構(gòu)域中的PF03033和PF06722，而無PBD結(jié)構(gòu)域中的功能域（圖1）。有趣的是，在荔枝霜疫霉中未發(fā)現(xiàn)同時含PBD中PF00169和PF02893的蛋白，且含CAT結(jié)構(gòu)域中任一功能域的蛋白均不含PF00169和PF02893（圖1）。這一結(jié)果表明，荔枝霜疫霉Atg26與真菌中的同源蛋白在結(jié)構(gòu)域上差異極大。

通過在線工具ProtParam對6個候選蛋白進行理化性質(zhì)分析表明，6個候選蛋白的氨基酸數(shù)目在707～1503"aa之間，多數(shù)蛋白在1200"aa以上，其分子量（molecular"weight，"Mw）在96.66～167.14"kDa之間，等電點（isoelectric"point，"IP）在6.39～8.59之間，脂溶指數(shù)（aliphatic"index，"AI）在80.11～90.53之間，親水性平均值（GRAVY）均為負數(shù)，具有親水性（表1）。通過在線工具SOPMA預(yù)測PlAtg26的二級結(jié)構(gòu)，其二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，6個同源蛋白均不含β-折疊（表2）。在CELLO上預(yù)測候選蛋白的亞細胞定位情況，6個候選蛋白分別定位在不同的細胞位置（表2）。由此可以看出荔枝霜疫霉中的Atg26具有多樣性，其可能參與多個細胞過程。

2.2""荔枝霜疫霉中Atg26結(jié)構(gòu)分析

通過分析荔枝霜疫霉及已知ATG26基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)FgATG26、AoATG26均具有3個內(nèi)含子，且其內(nèi)含子的分布也有一定規(guī)律。在荔枝霜疫霉中，除PlATG26a外，其余同源基因均含有1個或2個內(nèi)含子，且其內(nèi)含子分布差異極大，但大多位于5￠或3￠末端（圖2A）。

其他真菌中已知Atg26的PBD結(jié)構(gòu)域分布在N端，而CAT結(jié)構(gòu)域則在蛋白質(zhì)的C端。通過NCBI"Batch"CD-Search對荔枝霜疫霉和已知Atg26的保守功能域進行分析，發(fā)現(xiàn)與hmmsearch結(jié)果一致，與其他已知Atg26不同，在荔枝霜疫霉中Atg26只含有CAT結(jié)構(gòu)域而無PBD結(jié)構(gòu)域。在荔枝霜疫霉中，CAT結(jié)構(gòu)域均分布在Atg26蛋白的N端，但除PlAtg26a和PlAtg26f外，不同的同源蛋白的C端功能域具有顯著差異，多數(shù)是含有不同糖基轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和保守功能域的分析結(jié)果，荔枝霜疫霉的Atg26與其他真菌具有顯著差異，且其同源蛋白之間也具有多樣性，但是不同物種間Atg26中CAT結(jié)

構(gòu)域是保守的（圖2B）。

2.3""荔枝霜疫霉中Atg26的系統(tǒng)發(fā)育及保守基序分析

為了探究Atg26蛋白的進化特征，通過不同物種的Atg26同源蛋白建立系統(tǒng)發(fā)育樹做進化分析。進化關(guān)系分析表明，荔枝霜疫霉與大豆疫霉中的Atg26較為接近，二者存在對應(yīng)關(guān)系。擬南芥中的同源蛋白較多且都源自同一分支。真菌的Atg26與家鼠中的同源蛋白似乎來自于同一個祖先，而與擬南芥和卵菌都不同。有趣的是，PlAtg26與大豆疫霉中的Atg26同源蛋白親緣關(guān)系更近（圖3）。

通過MEME對荔枝霜疫霉中Atg26及其他物種中的同源蛋白的保守基序進行分析，發(fā)現(xiàn)卵菌中的同源蛋白都含有兩組保守基序，且其分布具有一定規(guī)律；而在真菌中，其保守基序多分布在蛋白質(zhì)的C端，N端含有少量保守基序，這一結(jié)果也與NCBI"Batch"CD-Search保守功能域的分析結(jié)果相似。擬南芥中的Atg26同源蛋白只含有一組保守基序，且多數(shù)分布規(guī)律一樣，與真菌同源蛋白的C端及卵菌同源蛋白的N端的保守基序具有相似的分布特征，該部分可能是UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶domain的編碼氨基酸序列。而在家鼠的同源蛋白中僅有個別保守基序（圖3）。綜上表明，荔枝霜疫霉中的Atg26同源蛋白之間具有多樣性，且不同物種中Atg26的CAT結(jié)構(gòu)域具有保守性，但PBD結(jié)構(gòu)域似乎是真菌中所特有的。

2.4""荔枝霜疫霉中Atg26蛋白互作預(yù)測分析

為了進一步分析荔枝霜疫霉中Atg26的功能，通過在線工具STRING預(yù)測惡疫霉（P."cactorum）中同源蛋白（表3）的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)。通過STRING預(yù)測，發(fā)現(xiàn)惡疫霉中與PlAtg26同源蛋白具有強相互作用的蛋白質(zhì)基本一致（圖4）。根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白位于細胞質(zhì)或膜上，集中在細胞代謝過程中，也有少部分參與生物合成過程，具有催化活性、氧化還原活性或結(jié)合能力。

2.5""荔枝霜疫霉中Atg26蛋白分子對接分析

為了進一步確定荔枝霜疫霉中Atg26的蛋白功能，對惡疫霉中的分析結(jié)果在荔枝霜疫霉中進行分子對接分析。通過Blastp在荔枝霜疫霉數(shù)據(jù)庫中查找10個互作蛋白的同源蛋白，只有PC110_g10050、PC110_g2990、PC110_g5868和PC110_g8861具有對應(yīng)蛋白（Pl_g7383.t1、Pl_g9795.t1、Pl_g4663.t2、Pl_g8511.t1）。通過在線工具SWISS-MODEL對荔枝霜疫霉中的Atg26蛋白和上述4個蛋白進行同源建模。選擇其中模板覆蓋率較高的晶體結(jié)構(gòu)（圖5），通過GRAMM對其進行分子對接，在PDBePISA上分析分子對接結(jié)果，并通過PyMOL對其進行可視化（圖6）。

PDBePISA結(jié)果顯示，PlAtg26a與Pl_g7383之間自由能為–2.4"kcal/mol，PlAtg26f與Pl_g9795之間自由能為–15.2"kcal/mol，2個蛋白之間通過多個氫鍵和鹽橋作用進行連接，并通過PyMOL"對氫鍵作用進行可視化。PyMOL結(jié)果還顯示，2個蛋白之間具有多個相互作用的氨基酸殘基位點。這一結(jié)果表明，荔枝霜疫霉中Atg26蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)可參考惡疫霉中的分析結(jié)果，由此推斷，荔枝霜疫霉中Atg26可能參與其細胞代謝過程，并具有催化活性。

2.6""PlATG26b基因克隆及磷酸化位點、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

由于PlAtg26缺乏GRAM功能域（該結(jié)構(gòu)域在酵母中負責(zé)PAS定位），我們推測其可能通過其他途徑實現(xiàn)定位。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，PlAtg26b/"c/d這三個亞型具有潛在的Atg8相互作用基序（Atg8-interacting"motif，"AIM），這可能是PlAtg26實現(xiàn)功能替代的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[28]。因此，該試驗以PlAtg26b為例，進一步分析PlAtg26的功能。以荔枝霜疫霉菌絲DNA為模板，PlATG26b-F/R為引物對PlAtg26b編碼區(qū)進行擴增，擴增產(chǎn)物共4857"bp，與之前轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致（圖7）。對其蛋白質(zhì)序列進一步分析發(fā)現(xiàn)，PlAtg26b蛋白不含信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域，但具有多個磷酸化位點，其中以絲氨酸和蘇氨酸為主（圖8）。PlAtg26b可能通過蛋白質(zhì)磷酸化-去磷酸化反應(yīng)進行信號傳導(dǎo)，調(diào)控自噬的發(fā)生。

2.7""PlATG26b基因在荔枝霜疫霉不同階段的表達水平分析

為進一步分析Atg26在荔枝霜疫霉中不同時期的作用，以荔枝霜疫霉菌絲（MY）階段的樣本作為對照，通過qRT-PCR分析PlATG26b在孢子囊（SP）、游動孢子（ZO）及侵染12、24、48、60"h的表達量發(fā)現(xiàn)，在游動孢子時期和侵染初期（12"h），PlATG26b表達量上調(diào)，而在孢子囊時期和侵染后期，PlATG26b的表達量并無明顯變化（圖9）。這一結(jié)果也說明Atg26在荔枝霜疫霉的無性繁殖及侵染階段發(fā)揮重要作用。

3""討論

細胞自噬是真核生物體內(nèi)一種自我降解的過程，對于在發(fā)育的關(guān)鍵時期平衡能量來源和應(yīng)對營養(yǎng)應(yīng)激非常重要[29-30]。甾醇苷（sterol"glycosides）廣泛存在于細菌、真菌、植物和動物中，并參與許多基本的細胞功能[31-32]。Atg26（Ugt51）作為一種甾醇葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒛承╃薮嫁D(zhuǎn)化成甾醇葡萄糖苷（SG）[12]。在畢赤酵母（P."pastoris）中，冗余的過氧化物酶體會通過巨自噬和微自噬2種方式降解。在過氧化物酶體微自噬過程中，冗余的過氧化物酶體會被液泡隔離膜（vacuolar"sequestering"membranes，VSMs）吞沒，而VSMs的形成需要微噬膜裝置（micropexophagic"membrane"apparatus，MIPA）的輔助[33-34]。SG的合成可以促進PAS的成熟及MIPA位點的形成，并增強過氧化物酶體的選擇性降解[35-37]。

荔枝霜疫霉屬于卵菌門（Oomycetes），在系統(tǒng)發(fā)育上與真菌差異極大。在畢赤酵母中，PBD結(jié)構(gòu)域和CAT結(jié)構(gòu)域都是Atg26介導(dǎo)過氧化物酶體自噬所必需的[35]。但是在荔枝霜疫霉數(shù)據(jù)庫中，并未發(fā)現(xiàn)同時含有PBD結(jié)構(gòu)域和CAT結(jié)構(gòu)域的蛋白，通過Blastp得到的同源蛋白只含有CAT結(jié)構(gòu)域。在進一步對Atg26同源蛋白的保守基序分析時發(fā)現(xiàn)，除真菌外，大豆疫霉、擬南芥以及家鼠中也未發(fā)現(xiàn)含有PBD結(jié)構(gòu)域的Atg26同源蛋白。在畢赤酵母中，Atg26通過其PBD結(jié)構(gòu)域中的GRAM功能域與磷脂酰肌醇4’-磷酸（Phosphatidylinositol"4’-phosphate，"PI4P）結(jié)合，從而定位于MIPA，并通過其催化結(jié)構(gòu)域調(diào)控SG合成[35-36]。與大豆疫霉、致病疫霉和擬南芥相同，荔枝霜疫霉中的Atg26存在多個同源蛋白且無GRAM結(jié)構(gòu)域，但通過PlAtg26的亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，其同源蛋白分布在細胞的多個位置，我們推測在這些物種中Atg26可能通過其他未知的方式進行定位。在釀酒酵母中，Atg26具有與PpAtg26序列相似的3個相同功能域（PH、GRAM和UDPGT），但是ScAtg26的缺失并未影響其prApe1的成熟、巨自噬以及過氧化物酶體自噬，這也表明了不同生物體之間同源基因功能的差異性[20]。

PlAtg26互作蛋白預(yù)測結(jié)果顯示，其相互作用蛋白集中在細胞代謝過程，且具有催化活性及結(jié)合能力，此外，PlAtg26b/c/d具有潛在的AIM基序，也暗示著PlAtg26可能通過其互作蛋白來替代GRAM功能域的結(jié)合能力。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（post"translational"modifications，PTMs）參與多種細胞活動，磷酸化途徑是研究最廣泛的PTMs之一，其中，AMPK（AMP"activated"protein"kinase）是自噬信號傳導(dǎo)的重要因子[38-40]。通過生物信息學(xué)分析，在PlAtg26b蛋白中含有多個磷酸化位點，其可能通過磷酸化-去磷酸化反應(yīng)進行自噬信號傳導(dǎo)，調(diào)控荔枝霜疫霉的細胞活動。據(jù)報道，荔枝霜疫霉中的自噬相關(guān)蛋白大多數(shù)在游動孢子時期顯著上調(diào)表達[15]。在本研究中，與菌絲相比，PlATG26b在游動孢子時期和侵染12"h上調(diào)表達，但是在孢子囊時期及侵染24～60"h的各階段其表達量未明顯提高。這也說明在荔枝霜疫霉中，Atg26對其生長發(fā)育及致病力具有重要影響。

本研究通過生物信息學(xué)鑒定了荔枝霜疫霉中的Atg26同源蛋白，并發(fā)現(xiàn)該蛋白與其他真菌中Atg26同源蛋白在結(jié)構(gòu)上具有明顯差異，暗示了Atg26在不同物種中的功能差異性。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，PlATG26b在荔枝霜疫霉的無性繁殖階段及侵染初期具有重要作用。后續(xù)將進一步研究該基因功能，以便對荔枝霜疫霉病的發(fā)生和傳播進行有效的預(yù)防和控制。

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