兼養(yǎng)培養(yǎng)對淡水微藻胞內(nèi)活性物質(zhì)的影響

中圖分類號：S917.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Effects of Mixotrophy on Intracellular Metabolite of Microalgaes in Freshwater

FANG Xia ¹，2 ， XIA Wanyue ² ，SUN Lu ² ， PHUNG Nghi Van2，LI Chen ² ，DONG Bingzhe ² FAN Yong2，LI Qiang'，LI Fuli2

（1.School of Biological Science and Technology，Universityof Jinan，Jinan 25OO22，Shandong，China; 2.Qingdao Instituteof BioenergyandBioprocss Technology，Chinese Academyof Sciences，Qingdao ，Shandong，China）

Abstract：Toinvestigate thediferencesingrowthandintracelular metaboliteaccumulationofMychonastes@fer（M.afer） underariousconditions，theeconomicallyimportantalgal species Chlorellsorokiniana（C.sorokiniana）inaquaculture wasusedasacontrol，the growth，organiccarbon sources，pigmentcompositionand content，antioxidantcapacity，and fatyacid composition of thetwo microalgaes wereevaluated under both autotrophic and mixotrophicconditions.The results show that both M .afer and C .sorokiniana exhibit accelerated growth in mixotrophic conditions.M. afer demonstrates an elevated pigment content and antioxidant capacity，showing a 504% increase in chlorophyll a，a 149% increase inchlorophyll b ，and an 88% increase in carotenoid content compared to autotrophic conditions，while the pigment content and antioxidant capacity of C .sorokiniana decrease compared to autotrophic conditions. The proportion of saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids in M .afer also increase considerably，and the content of nervonic acid C24：1 increases by 145% . The two microalgaes exhibit significant differences in their synergistic metabolic mechanisms of light energyandorganic carbonsources.Under mixotrophicconditions，M.aferdemonstrates higher productionrates and greater contents of active substances.

Keywords：mixotrophy；Mychonastes afer；Chlorella sorokiniana；intracellular metabolite

微藻是水生環(huán)境中普遍存在的光合微生物，所有水生環(huán)境幾乎都有分布，包括淡水、海水以及潮濕的陸地棲息地。有研究表明，真核微藻和藍(lán)細(xì)菌等浮游植物約占全球海洋和淡水中總浮游生物產(chǎn)量的 90% ，占全球海洋和淡水中總生物量（葉綠素a）的 10% ，是水生生態(tài)系統(tǒng)中至關(guān)重要的初級生產(chǎn)者。微藻具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和適宜的細(xì)胞尺寸（直徑為 3～50μm ），是雙殼類、蝦類和魚類（尤其是在幼蟲和幼魚階段）不可缺少的食物來源[2]。與酵母和細(xì)菌等相比，作為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料，微藻富含蛋白質(zhì)、脂肪和平衡的氨基酸組成，無須額外補(bǔ)充必需氨基酸[2]。與高等植物相比，微藻細(xì)胞中不含木質(zhì)素，半纖維素含量低，消化率更高[3]。Kiron 等[4]用微藻Schizochytrium sp.替代魚油培養(yǎng)羅非魚幼魚，能夠促進(jìn)羅非魚的生長以及魚肉中多不飽和脂肪酸的積累。此外，微藻還含有多種具有抗氧化性能的色素，部分微藻細(xì)胞內(nèi)能夠產(chǎn)生豐富的維生素和免疫刺激劑，有助于水生生物的健康[5]。雨生紅球藻中的蝦青素及杜氏鹽藻中的 β -胡蘿卜素已經(jīng)廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。研究表明，類胡蘿卜素有利于水生生物的生長和免疫[6，提高存活率[7]，降低抗病原體感染[8]，改善皮膚色澤[9]

微藻麥可藻 Mychonastes afer HSO-3-1（M.afer）分離自我國東部的一個淡水池塘，其細(xì)胞直徑為 2～3μm ，油脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于 57% ，神經(jīng)酸在中性脂中占比大于 6% ，可成為天然神經(jīng)酸的可靠來源[10-1]。師曉藝等[12]在不同條件下培養(yǎng)麥可藻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兼養(yǎng)條件下麥可藻的生長速率、呼吸耗氧速率和葡萄糖消耗速率均得到顯著提升。麥可藻在富營養(yǎng)化淡水湖泊中占優(yōu)勢地位[13]，體積較小，可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中幼蟲、幼魚等的開口餌料。除了關(guān)注麥可藻的生物量與神經(jīng)酸產(chǎn)量，還須進(jìn)一步關(guān)注其他活性物質(zhì)的含量與變化，以便更好地運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

不同微藻的活性物質(zhì)受培養(yǎng)方式的影響不盡相同。有研究[14-15]表明，與自養(yǎng)條件相比，有機(jī)碳源的存在使微藻葉綠素和類胡蘿卜素的含量減少，但是在兼養(yǎng)條件下微藻的活性物質(zhì)增加。Menegol等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在以質(zhì)量濃度為 5g/L 的葡萄糖作為有機(jī)碳源的室外連續(xù)兼養(yǎng)培養(yǎng)中，微擬球藻Nannochloropsisgaditana的類胡蘿卜素總質(zhì)量較光自養(yǎng)時(shí)的增加 83% ，總脂肪酸含量提高了 34% ，其中二十碳五烯酸產(chǎn)量比光自養(yǎng)時(shí)的高2.2倍。Pribyl等[15]研究發(fā)現(xiàn)，黃絲藻Tribonemaaequale 混合營養(yǎng)培養(yǎng)模式的目標(biāo)化合物二十碳五烯酸產(chǎn)量顯著高于光合自養(yǎng)培養(yǎng)模式的。Sun等[17]通過在自養(yǎng)條件下通入高濃度二氧化碳 CO₂ 模擬異養(yǎng)條件，小球藻的脂肪酸含量顯著提高。Jiao等[18]研究發(fā)現(xiàn)，添加乙酸（體積分?jǐn)?shù)為 0.25% ）或甘油（體積分?jǐn)?shù)為 0.5% ）后，紫球藻Porphyridiumpurpureum花生四烯酸的產(chǎn)量較自養(yǎng)條件下的分別提高了 43% 和52% 。本文中主要研究麥可藻在兼養(yǎng)條件下各色素組分和脂肪酸的含量，并分析其抗氧化能力的變化。

1材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)藻種與培養(yǎng)

麥可藻M.aferHSO-3-1保藏于中國典型微生物保藏中心，藻種保藏號為CGMCCNo.4654；小球藻Chlorellasorokiniana-xzl分離自山東大沽河流域，中國科學(xué)院生物能源與過程研究所一碳生物技術(shù)研究中心保存。

2 種微藻均以改良BG-11培養(yǎng)基作為自養(yǎng)培養(yǎng)基，其中硝酸鈉 NaNO₃ 的質(zhì)量濃度為 2g/L ，磷酸二氫鉀 KH₂PO₄ 的質(zhì)量濃度為 0.4g/L ，硫酸鎂MgSO₄?7H₂0 的質(zhì)量濃度為 0.4g/L ，檸檬酸鈉C₆H₅Na₃O₇?2H₂O 的質(zhì)量濃度為 0.067g/L ，氯化鈣CaCl₂?2H₂O 的質(zhì)量濃度為 0.036g/L ，硫酸亞鐵FeSO₄?7H₂O 的質(zhì)量濃度為 5.3mg/L ，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）的質(zhì)量濃度為 2.1mg/L ，硼酸H₃BO₃ 的質(zhì)量濃度為 2.86mg/L ，氯化錳 MnCl₂ ：4H₂0 的質(zhì)量濃度為 1.81mg/L ，硫酸鋅 ZnSO₄ ：7H₂O 的質(zhì)量濃度為 0.222mg/L ，鉬酸鈉 Na₂MoO₄ ·2H₂O 的質(zhì)量濃度為 0.39mg/L ，硫酸銅 CuSO₄ ·2H₂O 的質(zhì)量濃度為 0.079mg/L ，硝酸鈷 ：6H₂O 的質(zhì)量濃度為 0.049mg/L 。在兼養(yǎng)條件下，麥可藻、小球藻分別以質(zhì)量濃度為3、 10g/L 的葡萄糖作為有機(jī)碳源。培養(yǎng)基均通過 115^°C 滅菌 30min 后使用。

細(xì)胞培養(yǎng)于直徑為 10.2cm 、高度為 18cm 的平行發(fā)酵罐中，培養(yǎng)體系體積為 600mL ，使用白色熒光燈進(jìn)行照明，光照度為 5000lx ，培養(yǎng)過程中 pH 控制在 6.5±0.1 ，全程光照并通人高濃度 CO₂ （體積分?jǐn)?shù)為 4% ）混合氣體，對2種微藻分別設(shè)置自養(yǎng)-CO₂ 、兼養(yǎng) -CO₂ 2個實(shí)驗(yàn)組。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞生長曲線與生物量測定

每隔 24h 分別取麥可藻的自養(yǎng) -CO₂ 組、兼養(yǎng)-CO₂ 組，小球藻的自養(yǎng) -CO₂ 組、兼養(yǎng) -CO₂ 組的藻液各 1mL ，純水稀釋，使稀釋后的藻液在波長為750nm 時(shí)的吸光度為 0.2～0.8 ，將藻液加入九十六孔板，使用酶標(biāo)儀（SynergyTMHT型，美國BioTek儀器有限公式）測定藻液在波長為 750nm 時(shí)的光密度 D（750） 表征細(xì)胞密度，繪制藻細(xì)胞生長曲線。

分別取麥可藻的自養(yǎng) -CO₂ 組、兼養(yǎng) -CO₂ 組，小球藻的自養(yǎng) -CO₂ 組、兼養(yǎng) -CO₂ 組的藻液各 10mL 分別于轉(zhuǎn)速為 4000r/min 離心分離 10min ，去除上清液，并用純水清洗，離心收集沉淀，置于冷凍干燥機(jī)凍干，使用分析天平測定藻細(xì)胞干質(zhì)量，計(jì)算培養(yǎng)體系生物量。

1.2.2 體系葡萄糖含量測定

在培養(yǎng)第3、6、8天，分別取麥可藻的自養(yǎng)一CO₂ 組、兼養(yǎng)- ?CO₂ 組，小球藻的自養(yǎng) -CO₂ 組、兼養(yǎng)-CO₂ 組的藻液各 1mL ，分別在轉(zhuǎn)速為 10 000r/min 離心分離 10min ，取上清液，用純水稀釋，使最終測定的葡萄糖質(zhì)量濃度為 0.2～0.8g/L ，使用生物傳感分析儀（SBA-40D型，山東省科學(xué)院）對樣品進(jìn)行測定。培養(yǎng)體系實(shí)際葡萄糖剩余量為含量測定值與稀釋倍數(shù)的乘積，當(dāng)培養(yǎng)體系內(nèi)葡萄糖的質(zhì)量濃度小于 1g/L 時(shí)，向培養(yǎng)體系補(bǔ)充無菌的葡萄糖母液（質(zhì)量濃度為 500g/L ）。參照師曉藝等[12]的研究補(bǔ)充葡萄糖至初始水平，麥可藻、小球藻培養(yǎng)體系葡萄糖的質(zhì)量濃度分別補(bǔ)充至3、 10g/L 0

1.2.3 細(xì)胞色素測定

在培養(yǎng)過程中取 1mL 藻液于轉(zhuǎn)速為 8000r/min 離心分離 15min ，棄上清液，使用超純水清洗收集沉淀。加人 1mL 體積分?jǐn)?shù)為 90% 的丙酮，吹打混勻，黑暗中放置 ¹h ；然后在轉(zhuǎn)速為 10 000r/min 離心分離 10min ，取上清液置于透明九十六孔板中。分別在波長665、652、470nm 時(shí)測定吸光度A665、A₆₅₂?A₄₇₀ 。根據(jù)公式分別計(jì)算葉綠素a（Chl-a）、葉綠素 和類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度 a）、ρ（Chl-b）和ρ（Car）[19]

1.2.4 細(xì)胞抗氧化性測定

分別稱取 1g 麥可藻、小球藻樣品（培養(yǎng)至第8天收集，冷凍干燥），加入體積分?jǐn)?shù)為 80% 的乙醇溶液 30mL ，超聲浸提3次，在轉(zhuǎn)速為 4800r/min 離心分離 10min ，取上清液作為樣品提取液，在 4^°C 下保存?zhèn)溆谩?/p>

1）1，1-二苯基 -2- 苦基腫（DPPH）自由基清除能力的測定。配置DPPH的濃度為 0.2mmol/L 的乙醇溶液。分別取 2mL 麥可藻、小球藻提取液（質(zhì)量濃度為 5mg/L 加入到 2mL DPPH的乙醇溶液，避光反應(yīng) 30min ，使用紫外分光光度計(jì)（Ultrospec2100pro 型，英國Amersham生物科學(xué)公司）于波長517nm 時(shí)測定吸光度，記為 A₁ （樣品組），樣品溶液加入到 2mL 純水中測定吸光度，記為 A₂ （樣品對照組），將 2mL DPPH的乙醇溶液加入到 2mL 純水中測定吸光度，記為 A₀ （空白對照組）。所有測定均重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率 η_?1

2）鐵離子還原能力（FRAP）的測定。分別配制濃度為 300mmol/L 的乙酸鈉緩沖液（ pH=3.6 ）、濃度為 0.02mol/L 的氯化鐵溶液。以濃度為 40mmol/L 的鹽酸溶液作為溶劑，配制濃度為 0.01mol/L 的三吡啶基三嗪（TPTZ）溶液。使用前將乙酸鈉緩沖液、TPTZ溶液、氯化鐵溶液以體積比 10：1：1 充分混合制成FRAP試劑避光保存（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

測量樣品時(shí)，取 4mL FRAP試劑與 1mL 樣品溶液（待測樣品的質(zhì)量濃度為 5g/L ）混勻，避光置于 37^°C 的水浴鍋中反應(yīng) 10min ，使用紫外分光光度計(jì)測試波長 593nm 處的吸光度。所有測定均重復(fù)3次。吸光度值即表示樣品的FRAP。

3）羥基自由基清除能力的測定。分別配制濃度為 6mmol/L 的 FeSO₄ 溶液、 6mmol/L 的水楊酸C₇H₆O₃ 溶液，取 250μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 30% 的過氧化氫H₂O₂ 溶液，加入到 750μL 純水中混合均勻成為H₂O₂ 的濃度為 2.4mol/L 的溶液，取 100μL 上述H₂O₂ 溶液定容至 100mL ，配制成 H₂O₂ 的濃度為2.4mmol/L 的溶液。將上述溶液按一定體積混合于37^°C 下避光反應(yīng) 30min ，采用紫外分光光度計(jì)于波長 510nm 處分別測定 溶液 -250μL C₇H₆O₃ 溶液 -2.25mL 純水 -250μLH₂O₂ 溶液（空白對照組）的吸光度 A_b 、 250μLFeSO₄ 溶液 -250μL C₇H₆O₃ 溶液 -250μL 樣品提取液 -2mL 純水 -250μL H₂O₂ 溶液（樣品組）的吸光度 A_s 及 溶液 -250μLC₇H₆O₃ 溶液 -250μL 樣品提取液-2.25mL 純水（樣品對照組）的吸光度 A₀ 。所有測定均重復(fù)3次，然后計(jì)算羥基自由基清除率 η₂ ，

4）超氧陰離子自由基清除能力的測定。分別配制濃度為 50mmol/L 的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 緩沖溶液（ pH=8.2 ）、 7mmol 的鄰苯三酚溶液、 的鹽酸溶液。將上述溶液按一定體積混合反應(yīng)，待反應(yīng)終止后，使用紫外分光光度計(jì)于波長 325nm 處分別測定 750μL 樣品提取液（待測樣品的質(zhì)量濃度為 10g/L）-750μL Tris-HCI緩沖液（反應(yīng)溫度為 25^°C ，反應(yīng)時(shí)間為 30min ，以下同） -750μL 鄰苯三酚（ 25^°C，10min）-750μL 鹽酸溶液（樣品組）的吸光度 A_s^′ ！ 750μL 樣品提取液（質(zhì)量濃度為 10g/L ） -750μL Tris-HCl 緩沖液 純水 鹽酸溶液（樣品對照組）吸光度 A₀^′ ！ 750μL 純水-750μL Tris-HCl緩沖液 25^°C，10min）-750μL" 鄰苯三酚 鹽酸溶液（空白對照組）的吸光度 A_b^′ 。所有測定均重復(fù)3次，然后計(jì)算超氧陰離子自由基清除率η3，

1. 2.5 色素的薄層色譜（TLC）分析

分別取不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至第8天的麥可藻、小球藻各 1mL ，在轉(zhuǎn)速為 8000r/min 離心分離 15min ，棄上清液，使用超純水清洗后收集沉淀。使用無水乙醇吹打混勻，置于 30% 金屬浴下振蕩萃取 ^1h 后離心分離，取上清液，使用硅膠板（60F254，MerckKGaA）進(jìn)行點(diǎn)樣，靜置晾干，將硅膠板緩慢放置于盛有展層液（正己烷與丙酮的體積比為6：4）的層析缸中，分離 15min 結(jié)束后取出、晾干并記錄狀態(tài)。

1.2.6 色素的鑒定分析

取 微藻樣品（經(jīng)冷凍干燥），加入 30mL 無水乙醇，置于 30^°C 金屬浴下萃取 ^1h ，在轉(zhuǎn)速為10 000r/min 離心分離 10min ，取上清液，濃縮至1mL ，并點(diǎn)樣至制備層析板，置于盛有展層液的層析缸中，離心分離 15min ，裁剪下目標(biāo)條帶，使用500μL 無水乙醇溶解，然后過濾。使用超快速液相色譜儀（VanquishCore 型，美國Thermo Fisher科技公司）進(jìn)行測試并純化，色譜柱為XTerraprepRP18（粒徑為 10μm ，內(nèi)徑為 7.8mm ，長度為 150mm^? ），流動相為體積分?jǐn)?shù)為 95% 的乙腈溶液，柱溫為室溫，檢測波長為 450nm ，體積流量為 2mL/min 。對純化后的樣品分別進(jìn)行質(zhì)譜分析及核磁共振（NMR）分析。

1）質(zhì)譜分析。使用離子阱質(zhì)譜儀（LTQXL型，美國ThermoFisher科技公司），采用直接進(jìn)樣法，使用大氣壓化學(xué)電離（APCI）離子源，以正離子模式采集，霧化氣體和干燥氣體為氮?dú)?，質(zhì)量掃描范圍為 0～1 000m/z （質(zhì)荷比， Ω_m 為離子質(zhì)量， z 為離子所帶電荷），毛細(xì)管電壓為 3.0kV ，霧化壓力為0.2bar（ 1bar=100kPa， ，干燥氣體體積流量為 3.5L/min ，溫度為 200^°C 。

2）核磁共振（NMR）分析。將純化的樣品置于離心濃縮儀（CVE-2100型，東京理化器械株式會社），在 37^°C 時(shí)真空抽干 ¹h ，使用氘代丙酮溶解樣品并移入潔凈的核磁管內(nèi)進(jìn)行NMR檢測。使用核磁共振波譜儀（AVANCE-IIIHD型，德國Bruker公司）進(jìn)行一維 ¹H -NMR檢測，測定頻率 600MHz 。

1.2.7 脂肪酸組分測定

將 30mg 經(jīng)冷凍干燥后的微藻樣品與 5mL 的氯仿與甲醇的體積比為2：1的溶液混合，在 37^°C 下振蕩 ^3h 。在樣品中加入 2mL 氯化鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9% 的溶液混合，在轉(zhuǎn)速為 4000r/min 離心分離5min ，將底層的有機(jī)相轉(zhuǎn)移到玻璃管中，氮吹揮發(fā)掉有機(jī)溶劑后（時(shí)間約 30min ）獲得總脂肪酸。在總脂肪酸中加入 1mL 正己烷和 3mL 硫酸的體積分?jǐn)?shù)為 2% 的甲醇溶液并充分混合，置于 85^°C 下甲酯化 ¹h 。隨后，將樣品取出并置于冰上冷卻。樣品中加人 500μL 的C26烴類內(nèi)標(biāo)溶液和 2mL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.9% 的氯化鉀溶液，充分混合。將混合物在轉(zhuǎn)速為 4000r/min 離心分離 5min ，隨后將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)移到氣相瓶中進(jìn)行氣相檢測。使用氣相色譜（7890A型，美國Agilent科技公司）測試脂質(zhì)成分含量。選擇INNOWAX作為色譜柱（長度為 30m ，內(nèi)徑為 320μm ，液膜厚度為 0.25μm ），使用氮?dú)庾鳛檩d氣，體積流量為 28.5mL/min 。氣相色譜的溫度程序如下： 100^°C 保持 5min ，以升溫速率 10^°C/min 的加熱 14min ; 240^°C 保持 11min 。載氣與樣品的體積分流比為 10：1 。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphpadPrism、MestReNova軟件進(jìn)行整理及繪制，數(shù)據(jù)顯著性分析采用單因素分析法進(jìn)行， ?p 值小于0.05代表數(shù)據(jù)差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對細(xì)胞生長的影響

麥可藻和小球藻在不同培養(yǎng)條件下的生長狀況和葡萄糖消耗量見圖1。從圖中藻類生長曲線及葡萄糖消耗量來看：生長第8天時(shí)，兼養(yǎng)條件（兼養(yǎng)-CO₂ ）下，麥可藻的 D（750） 為8.4，最終生物量達(dá)7.1g/L ；而自養(yǎng)條件（自養(yǎng)- -CO₂ ）下，麥可藻的 D（750） 僅為4.1，最終生物量為 3.0g/L 。與自養(yǎng)條件相比，兼養(yǎng)條件下麥可藻的最終 D（750） 與生物量分別增加 105% 、 137% ，而小球藻的 D（750） 為16.1，較自養(yǎng)條件 D（750） 為6.2]增加 160% 。2種微藻在兼養(yǎng)高濃度 CO₂ 條件下均能快速生長，但是2種微藻對葡萄糖在兼養(yǎng)條件下利用能力存在差異，小球藻的葡萄糖利用速率更快，培養(yǎng)第8天時(shí)，麥可藻的葡萄糖消耗量為 5.3g/L ，而小球藻的葡萄糖消耗量為 13.1g/L O

2.2 不同培養(yǎng)條件對細(xì)胞色素含量的影響

圖2所示為不同培養(yǎng)條件下麥可藻和小球藻色素含量變化。由圖2（a）可知，麥可藻在兼養(yǎng)條件下的葉綠素a含量顯著高于自養(yǎng)條件下的，在培養(yǎng)第4—8天，麥可藻的葉綠素a含量分別較自養(yǎng)條件下的提高 268% 、 207% 人 237% 、 394% ！ 504% （ p 值小于0.05）。由圖2（b）、（c）可知，在兼養(yǎng)條件下，麥可藻的葉綠素 b 、類胡蘿卜素的含量均高于自養(yǎng)條件下的。

對于小球藻而言，在兼養(yǎng)條件下小球藻的葉綠素a含量顯著下降，在培養(yǎng)第4—8天，小球藻的葉綠素a含量較自養(yǎng)分別下降 297% ！ 385% ！ 492% ）581% 一 588% （ p 值小于0.05）。其葉綠素 b 、類胡蘿卜素含量也較自養(yǎng)條件下的低，與麥可藻形成鮮明的對比。

比較不同培養(yǎng)時(shí)間色素各組分含量變化發(fā)現(xiàn)，在自養(yǎng)條件下，麥可藻與小球藻色素變化并不顯著，但在兼養(yǎng)條件下，麥可藻色素各組分在培養(yǎng)第4—7天時(shí)均呈現(xiàn)增大趨勢，在第8天開始略微下降，而小球藻色素各組分在第4—8天呈現(xiàn)下降趨勢，表明小球藻的生長更多地依靠有機(jī)碳源的消耗，而麥可藻的生長則依靠有機(jī)碳源消耗與光合協(xié)同作用。

2.3 不同培養(yǎng)條件對細(xì)胞抗氧化性的影響

不同培養(yǎng)條件下麥可藻和小球藻抗氧化能力測試結(jié)果見圖3。由圖可見：在兼養(yǎng)條件下麥可藻的DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率及超氧陰離子自由基清除率分別為 47% ！ 64% 、 17% ，較自養(yǎng)條件下的分別提高 17% ！ 45% ！ 7% （ p 值小于0.05）?？傮w而言，麥可藻在兼養(yǎng)條件下的抗氧化能力較自養(yǎng)條件下的強(qiáng)。相比而言，在兼養(yǎng)條件下小球藻的DPPH自由基清除率為 32% ，較自養(yǎng)條件下的高 3% ，F(xiàn)RAP、羥基自由基清除率分別為 23% 、30% ，較自養(yǎng)條件下的分別下降 28% ！ 21% （ p 值小于0.05）?？傮w而言，小球藻在兼養(yǎng)條件下的抗氧化能力較自養(yǎng)條件下的弱。

分別比較自養(yǎng)、兼養(yǎng)條件下麥可藻與小球藻的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)：麥可藻的DPPH自由基清除率分別較小球藻的高 55% ！ 45% （ p 值小于0.05）；麥可藻在自養(yǎng)條件下的FRAP與小球藻的無顯著差異，在兼養(yǎng)條件下的FRAP較小球藻的高 28% （ p 值小于0.05）；麥可藻的羥基自由基清除率分別較小球藻的高 113% ！ 28% （ p 值小于0.05）；麥可藻的超氧陰離子自由基清除率分別較小球藻的高 24% ）8%（p 值小于0.05）。

綜上所述，與自養(yǎng)條件相比，在兼養(yǎng)條件下，麥可藻的抗氧化能力更強(qiáng)，小球藻的抗氧化能力較弱。比較麥可藻和小球藻的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)條件下，麥可藻的抗氧化能力較小球藻的強(qiáng)

2.4麥可藻類胡蘿卜素條帶分析

類胡蘿卜素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，通過比較麥可藻與小球藻類胡蘿卜素的含量發(fā)現(xiàn)，在兼養(yǎng)條件下，麥可藻的類胡蘿卜素含量最高，而小球藻的類胡蘿卜素含量很低。在兼養(yǎng)條件下培養(yǎng)第8天時(shí)，麥可藻的類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度為 5.9mg/L ，小球藻類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度僅為 0.6mg/L ，但是，在自養(yǎng)條件下，麥可藻的類胡蘿卜素質(zhì)量濃度為3.2mg/L ，小球藻的類胡蘿卜素質(zhì)量濃度為 3.4mg/L 差異并不顯著。根據(jù)抗氧化數(shù)據(jù)可知，相同培養(yǎng)條件下麥可藻的抗氧化能力較強(qiáng)，說明類胡蘿卜素的含量是麥可藻抗氧化能力強(qiáng)的因素之一。

對2種微藻的色素進(jìn)行薄層色譜分析，結(jié)果見圖4（a）。從圖中可看出，麥可藻除含有 β- 胡蘿卜素之外，還含有其他類胡蘿卜素，將框出的色素暫命名為類胡蘿卜素-1，對類胡蘿卜素-1進(jìn)行分離純化并進(jìn)行質(zhì)譜和NMR分析，結(jié)果如圖4（b）所示。由圖可見，類胡蘿卜素-1有3個信號較強(qiáng)的質(zhì)譜峰，分別位于 m/z 為579.33、618.83、663.8處，與空白質(zhì)譜圖[見圖4（c）]對比發(fā)現(xiàn)，空白質(zhì)譜圖中 m/z 為579.33、663.8的質(zhì)譜峰同樣存在，因此，推測類胡蘿卜素-1的 m/z 為618.83。類胡蘿卜素的抗氧化性與其基團(tuán)緊密相關(guān)。通過分析類胡蘿卜素-1的NMR的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與 β- 胡蘿卜素相比，除具有碳碳雙鍵之外，該類胡蘿卜素還存在活性羥基[見圖4（d）]。類胡蘿卜素-1的完整結(jié)構(gòu)還須進(jìn)一步結(jié)合碳譜及紅外分析等確定。

2.5 不同培養(yǎng)條件對細(xì)胞脂肪酸組分的影響

收集不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至第8天的麥可藻進(jìn)行脂肪酸組分分析，結(jié)果見圖5。從圖中可以看出，與自養(yǎng)條件相比，在兼養(yǎng)條件下麥可藻的飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸含量增加，但多不飽和脂肪酸含量均降低。不同培養(yǎng)條件的麥可藻的脂肪酸構(gòu)成如表1所示。由表可見，與自養(yǎng)條件相比，在兼養(yǎng)條件下麥可藻的飽和脂肪酸 C16：0 、C24：0、 C26：0 在脂肪酸中的占比分別提高 26% 、 80% 、 69% ，單不飽和脂肪酸C16：1、C18：1、C24：1在脂肪酸中的占比分別提高 18% 、 18% 、 145% ，但多不飽和脂肪酸C16：2、C18：2、C18：3在脂肪酸中的占比分別下降79% 、 37% 、 152% 。由于麥可藻是天然神經(jīng)酸的可靠來源；因此，在兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下，麥可藻不僅可以獲得更高的生物量，而且其脂肪酸中神經(jīng)酸的含量也顯著提高，為后續(xù)麥可藻的培養(yǎng)與生產(chǎn)提供了一種思路。

3討論與結(jié)論

3.1 討論

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展，水產(chǎn)飼料銷量也*—C26烷內(nèi)標(biāo)。圖中脂肪酸命名規(guī)則如下： Cx：y-C 為碳原子， _，x 為脂肪酸中的碳原子總數(shù)，y 為雙鍵數(shù)目（0為飽和脂肪酸，1為單不飽和脂肪酸， ?2 為多不飽和脂肪酸）。

注： ①Cl6：0 中C為碳原子，16為脂肪酸中的碳原子總數(shù)，0為雙鍵數(shù)目（0為飽和脂肪酸，1為單不飽和脂肪酸， ?2 為多不飽和脂肪酸）。照此類推。

在不斷增長。目前主要用于魚飼料的魚粉、魚油和植物性補(bǔ)充劑等均存在利用率低、營養(yǎng)價(jià)值低和成本高等問題[20]。微藻具有均衡的蛋白質(zhì)、維生素、類脂、類胡蘿卜素、碳水化合物和礦物質(zhì)，是水產(chǎn)飼料的來源成分[21]。目前螺旋藻、小球藻、柵藻、杜氏鹽藻和微擬球藻常被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料，用作魚和對蝦幼體、甲殼類和軟體動物的飼料添加劑;但微藻培養(yǎng)成本高，因此限制了其在飼料行業(yè)的規(guī)模利用，亟須開發(fā)經(jīng)濟(jì)、高效的微藻養(yǎng)殖技術(shù)。兼養(yǎng)培養(yǎng)兼具自養(yǎng)和異養(yǎng)兩者的優(yōu)勢，在兼養(yǎng)體系中可通過2種培養(yǎng)模式的交替和混合等方式，提高微藻的生長速率和生物量。研究22」發(fā)現(xiàn)，在兼養(yǎng)條件下微藻的最終生物量大于自養(yǎng)與異養(yǎng)生物量的總和。兼養(yǎng)培養(yǎng)不僅能充分利用環(huán)境中的資源，而且能提高微藻的培養(yǎng)密度，消除光抑制，同時(shí)還能保留微藻的光合固碳優(yōu)勢，是一種具有發(fā)展前景的培養(yǎng)方式。在兼養(yǎng)過程中，不同藻種的兼養(yǎng)機(jī)制存在差異。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在兼養(yǎng)條件下光合系統(tǒng)與呼吸系統(tǒng)的協(xié)同互作有助于提高微藻細(xì)胞的光合能力和能量代謝效率。當(dāng)細(xì)胞更多地將有機(jī)碳源用于自身生長時(shí)，有機(jī)碳源的存在導(dǎo)致光合活性降低。Roth等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在佐夫色綠藻Chromochloriszofingiensis加人有機(jī)碳源培養(yǎng)后，呼吸作用迅速增強(qiáng)，但單位細(xì)胞體積的葉綠素含量減少，且葉綠素降解基因表達(dá)增加，使得光系統(tǒng)ⅡI的最大光合效率迅速降低。Xiang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中加入葡萄糖后，共生藻Symbiodinium編碼光合蛋白的質(zhì)體轉(zhuǎn)錄本水平顯著降低，細(xì)胞類囊體膜表現(xiàn)出喪失及碎片化，藻細(xì)胞出現(xiàn)漂白現(xiàn)象。

3.2 結(jié)論

本文中主要探究了兼養(yǎng)及自養(yǎng)條件下，麥可藻色素含量與抗氧化能力變化，并與模式生物小球藻相比較，得到以下結(jié)論：

1）與自養(yǎng)條件相比，在兼養(yǎng)條件下麥可藻各色素組分含量均增加，但小球藻各色素組分含量均減少。推測其原因是：麥可藻傾向于光能與有機(jī)碳源代謝能量協(xié)同利用，光合作用得到促進(jìn)，色素含量提高，而小球藻更傾向于利用有機(jī)碳源，光合作用受到抑制，色素含量減少

2）類胡蘿卜素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可以作為抗氧化劑[26]，因此，在兼養(yǎng)條件下麥可藻具備更強(qiáng)的抗氧化能力，而小球藻抗氧化能力較弱。通過比較麥可藻和小球藻的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素含量是影響微藻抗氧化能力的重要因素之一，除含量之外，類胡蘿卜素的種類與結(jié)構(gòu)也是影響微藻抗氧化能力的重要因素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，除 β- 胡蘿卜素外，麥可藻還存在其他類胡蘿卜素的色素條帶，該類胡蘿卜素具有碳碳雙鍵及抗氧化性基團(tuán)一OH，具有較強(qiáng)的抗氧化性

3）進(jìn)一步論證了麥可藻具有區(qū)別于其他藻種的特點(diǎn)，其在 CO₂ 與有機(jī)碳源同時(shí)存在的培養(yǎng)模式下，能夠快速積累生物量，提高細(xì)胞色素含量、抗氧化能力及神經(jīng)酸產(chǎn)量。此外，麥可藻在該條件下獲得高生物量的同時(shí)還能夠有效固定 CO₂ ，使其在具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的同時(shí)還具有一定的生態(tài)功能，為微藻工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供一種新的思路。

微藻作為應(yīng)用廣泛的水產(chǎn)飼料，有助于提高水產(chǎn)品的品質(zhì)，促進(jìn)農(nóng)業(yè)及食品系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展。發(fā)展遺傳和代謝工程進(jìn)一步提高微藻生物量、高附加產(chǎn)品積累，以及開發(fā)低成本的收獲過程，可高效推動食品和飼料工業(yè)中藻類的生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：于海琴）