肼解法的改進及在測定多肽鏈碳末端氨基酸的應用

中圖分類號：Q517 文獻標志碼：A

Improvement of Hydrazinolysis Method and Its Application in Identification of Carbon-terminal Amino Acids of Polypeptide Chain

HAN Wenyu1， LI Kai² ，WEI Xu^?1 ， LI Baorui ³ ，WANG Yuanxiu1 （1.School of Biological Science and Technology，University of Jinan，Jinan 25oo22，Shandong，China; 2.Shandong Fupai Ejiao Co.，Ltd.，Jinan 25O4OO，Shandong，China； 3.Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 25O1oo，Shandong，China）

Abstract：Tosolvetheproblem that thecarbon-terminalaminoacidsweredificulttoseparateduringtheoperationof the traditionalhydrazinehydrolysismethod，animproved methodforthedeterminationof carbon-terminalaminoacids was proposed basedon the traditional hydrazine hydrolysis method.Hydrazine hydrazide hydrate was used to hydrolyze casein digests with diferent degrees of hydrolysis，and amino acid hydrazide was removed byusing heptanal and benzaldehyde， respectively，and carbon-terminal amino acidsobtainedbyboth methods were determinedbythin-layer chromatography and high-performance liquid chromatography with a t -test.The results show that the carbon-terminal amino acid solutions obtained by using heptanal and benzaldehyde to remove amino acid hydrazide contain lysine andornithine，and the amino acid content increases with the increase of hydrolysis degree，and there is no significant difference （ pgt;0.05 ）in the contentof lysineandornithineobtainedbythediferentmethods，verifyingthefeasibilityoftheimprovedhydrazide hydrolysis method，and determining the directionalenzymeenzymatic digestion of trypsinonargininesandlysines in tyrosine protein.

Keywords： hydrazolysis；casein； carbon-terminal amino acid；trypsin；directed enzymatic hydrolysis

食物蛋白是活性肽的主要來源，適宜的酶解條件可以有效地將其中的生物活性肽釋放出來。目前，人們從食品蛋白中發(fā)現(xiàn)了許多活性肽，如抗高血壓活性的血管緊張素轉化酶（ACE）抑制肽、免疫調節(jié)肽、抗氧化肽、降脂肽等[1]?；钚噪牡墓δ苋Q于其特殊的氨基酸以及排列順序，已有研究顯示，谷氨酸、脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸等都能增強活性多肽的抗氧化能力，同時還能促進多肽與脂類的結合，使其更容易到達靶細胞，從而起到抗炎和抗腫瘤作用[2-3]，因此，不同的氨基酸組成對活性肽發(fā)揮生物活性至關重要。由于末端氨基酸種類對生物活性肽功能產(chǎn)生影響，因此采用定向酶解蛋白質制備特定功能的生物活性肽是一種趨勢，一種可以幫助鑒定生物酶制劑定向酶解的方法有助于制備目標活性肽。

肼解法最初由Akabori4提出，廣泛地應用于測定蛋白質和肽鏈碳末端氨基酸，結果令人滿意。肼解法的原理為：當?shù)鞍踪|或肽在一定條件下用無水肼處理時，只有羧基末端氨基酸被釋放為游離氨基酸，其他氨基酸殘基則轉化為氨基酸酰腫。經(jīng)過苯甲醛處理后，氨基酸酰肼與苯甲醛發(fā)生縮合反應形成不溶于水的化合物，而末端氨基酸則留在溶液中[5]。由于肼解反應過程中采用的無水肼毒性較大且易爆炸[]，苯甲醛在去除氨基酸酰肼時形成不易去除的黏稠狀沉淀，影響測定結果，因此很多學者對該法進行了改進。Kusama[在胖解人、馬、羊、狗等動物的血清蛋白測定碳末端氨基酸時，采用無水肼駢解蛋白質，以正庚醛代替苯甲醛去除氨基酸酰腫，檢測出血清蛋白的碳末端氨基酸為亮氨酸、丙氨酸，但是實驗中采用了毒性較大的無水肼。Bradbury[8]采用苯甲醛與質量分數(shù)為 90% 的水合肼測定卵清蛋白碳末端氨基酸，當檢測到末端氨基酸出現(xiàn)脯氨酸時，通過將蛋白質和無水腫在干燥的情況下反應，排除了它是通過水解肽鏈形成的可能性，表明非碳端氨基酸是在胖解過程中產(chǎn)生的，該過程與肼中的水量無關，但此方法在去除氨基酸酰胖時使用了不易去除沉淀的苯甲醛

氨基酸測定法主要有氨基酸分析儀法[9]、液相色譜法[10]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[1]、毛細管電泳儀法[12]等。液相色譜法相對于其他儀器價格低廉，應用較多，在氨基酸分析領域占據(jù)了絕對優(yōu)勢[13]因此，本文中采用胰蛋白酶酶解酪蛋白所得的酶解液為原料，采用低濃度胖、替換苯甲醛等方式改進腫解法，通過薄層層析測定酪蛋白酶解液中肽鏈碳末端的氨基酸，通過高效液相2，4-二硝基氟苯柱前衍生法測定碳末端氨基酸的種類與含量，以確定定向酶解肽鏈的種類及酶解程度。胰蛋白酶的酶切位點為賴氨酸殘基和精氨酸殘基的羧基端肽鍵[14-15] O由于在肼解過程中，精氨酸脫去尿素轉變?yōu)轼B氨酸[6，因此本文中通過測定賴氨酸、鳥氨酸含量來確定胰蛋白酶對酪蛋白的肽鏈中精氨酸、賴氨酸的定向酶解，并對2種腫解法得到的氨基酸含量進行 χ_t 檢驗，從而驗證改進腫解法定向酶解的可行性。

材料與方法

1.1 生物材料及試劑

1. 1. 1 材料與試劑

實驗用材料與試劑包括：酪蛋白（精制級），薩恩化學技術（上海）有限公司；水合肼（純度為80% ，分析純），南京化學試劑股份有限公司；正庚醛、苯甲醛、2，4-二硝基氟苯（分析純），上海麥克林生化科技股份有限公司；胰蛋白酶（分析純），無錫市雪梅酶制劑科技有限公司；碳酸氫鈉、氫氧化鈉（分析純），天津市廣成化學試劑有限公司；賴氨酸、鳥氨酸（分析純），北京博奧拓達科技有限公司；水合芘三酮（分析純），天津永晟精細化工有限公司；正丁醇、冰醋酸、無水乙醇（分析純），天津市富宇精細化工有限公司；薄層層析硅膠板（分析純），青島海洋化工有限公司；磷酸二氫鉀（分析純），天津市化學試劑三廠；乙酸鈉（分析純），天津奧普生化工有限公司；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技公司。

1. 1.2 儀器與設備

Icen-24型高速離心機，杭州奧盛儀器有限公司；DK-8D型恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；直徑 0.3mm 點樣毛細管，華西醫(yī)科大學儀器廠；P-1型層析缸，上海江儀儀器有限公司；SPD-20A型真空旋蒸儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司；SZFD-200B型真空冷凍干燥機，上海舜制儀器制造有限公司。

1. 2 不同水解度酶解液的制備

精密稱取5份酪蛋白，每份 ，將其分別溶解于 50mL 蒸餾水中，以氫氧化鈉的濃度為 1mol/L 的溶液調節(jié) pH 至7.0，在 45^°C 的水浴鍋中加熱并攪拌使其充分溶解，溶解后按照加酶量為 3500U/g 加入胰蛋白酶，在 pH 為7.0、溫度為 45^°C 的條件下，分別酶解 1、2、3、4、5h^[17] ，酶解結束后，將酶解液置于沸水中滅酶 20min ，冷卻至室溫，以轉速7000r/min 離心 30min ，得上清液，用于定向酶解水平測定。

1.3 水解度（DH）測定

分別取不同酶解時間的上清液 0.5mL ，采用芘三酮比色法[18]測定其水解程度。

式中： η 為水解度； n 為蛋白質中被水解的肽鍵的物質的量； n_tot 為酪蛋白中肽鍵的物質的量。

1.4 碳末端氨基酸的測定

1.4.1 肼解法[19]

將1.3節(jié)剩余的上清液凍干，得到不同水解度的凍干粉，用于肼解反應。取10只干燥的具塞試管，分成2組，分別編號： 1、2、…5 號試管中分別加入酶解 1～5h 的凍干粉 70mg ，進行經(jīng)典肼解法實驗; 6、7、…10 號試管中分別加入酶解 1～5h 的凍干粉 70mg ，進行改進肼解法實驗。再向10只試管中分別加人質量分數(shù)為 80% 的水合肼 3.5mL ，沸水浴反應 10h ，旋蒸去除反應剩余肼。采用經(jīng)典腫解法的各管中分別加入 1.5mL 苯甲醛振蕩反應^1h ，離心取上清液得到碳末端氨基酸溶液。采用改進腫解法的各管中分別加入 1.5mL 庚醛振蕩反應0.5h ，靜置取下層溶液得到碳末端氨基酸溶液。將制備得到的碳末端氨基酸溶液按照 1、2、…5 號試管 ，6、7、…10 號試管的順序進行薄層層析測定和高效液相色譜測定。

1.4.2 碳末端氨基鑒定

取正丁醇、冰醋酸、體積分數(shù)為 95% 的乙醇、蒸餾水按體積比為 4：1：1：1 混合，向混合均勻的溶液中加人 7mg 水合節(jié)三酮使其充分溶解，配得層析液，將層析液加入層析杠中。用蒸餾水分別配制質量濃度為 1g/L 的鳥氨酸、賴氨酸標準溶液，分別用干凈的毛細管吸取上述 1、2、…5 號試管，6、7、….10 號試管中碳末端氨基酸溶液和標準溶液，分別點在薄層層析硅膠板的點樣位置上，將點樣好的薄層板斜立于層析缸中進行層析，層析結束后吹干顯色[20]，觀察顏色變化和水解度的關系。

1.4.3 碳末端氨基酸含量測定

1）氨基酸的衍生。用蒸餾水配制賴氨酸、鳥氨酸的質量濃度為 1g/L 混合標準溶液。精密量取標準溶液和1.4.1節(jié)中 1，2，…，5 號試管， 6、7、… 10號試管中的碳末端氨基酸溶液各 5mL ，分別置于 25mL 容量瓶中，加人 5mL 碳酸氫鈉的濃度為0.5mol/L 的溶液、 5mL 體積分數(shù) 0.8% 的2， ^4- 二硝基氟苯溶液，搖勻，置 80^°C 水浴中加熱 30min ，冷卻至室溫，加人 pH 為7.0的磷酸鹽緩沖液定容[10]用于高效液相色譜。

2）標準曲線制作。精密吸取上述標準混合溶液 0.01，0.02，0.04，0.05，0.10mL ，分別置于 10mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，按上述衍生方法對不同濃度的標準溶液進行衍生化處理。分別取衍生后不同濃度的混合標準溶液 20μL ，以濃度為0.3mol/L 的乙酸鹽緩沖液-甲醇（體積比為40：60）為流動相，在體積流量為 1.0mL/min 、柱溫為 30^c 、檢測波長為 360nm 的色譜條件下測定，以溶液質量濃度為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標，制作標準曲線

3）樣品的測定。取衍生后的碳末端氨基酸溶液各 20μL ，以濃度為 0.3mol/L 的乙酸鹽緩沖液-甲醇（體積比為 40：60 ）為流動相，在體積流量為1.0mL/min 、柱溫為 30% 、檢測波長為 360nm 的色譜條件下測定，記錄色譜圖。

2 結果與分析

2.1 不同水解度酶解液的制備

酶解時間對酪蛋白水解度的影響如圖1所示。由圖可知，在胰蛋白酶酶解酪蛋白的過程中，由于水解時間不同，酪蛋白的水解度也不同，因此可獲得酪蛋白水解度不同的酶解液。胰蛋白酶的酶切位點為賴氨酸殘基和精氨酸殘基的羧基端肽鍵，采用胰蛋白酶酶解酪蛋白時，獲得碳末端為精氨酸、賴氨酸的肽鏈，當酪蛋白水解度不同時，酶解液中肽鏈數(shù)量也不同。隨著水解時間的延長，酪蛋白的水解度逐漸增大，當酶解時間增加到一定程度，酶切位點減少導致酪蛋白的水解度趨于平緩。

2.2 碳末端游離氨基酸種類及含量的測定

2.2.1 薄層層析

不同腫解法獲得的碳末端氨基酸溶液的層析圖譜如圖2所示。由圖可知，采用經(jīng)典腫解法與改進肼解法得到的碳末端氨基酸溶液中氨基酸的種類無差別，不同水解度的凍干粉采用經(jīng)典腫解法與改進腫解法所得的碳末端氨基酸溶液中均含有鳥氨酸、賴氨酸，且隨著水解度的增加氨基酸顯色加深。

1、2、…、5—1、2、…、5號試管中的碳末端氨基酸溶液;a—鳥氨酸標準溶液；b—賴氨酸標準溶液。

6、7、….10-6、7、….10 號試管中的碳末端氨基酸溶液;a—鳥氨酸標準溶液；b—賴氨酸標準溶液。（b）改進肼解法

胰蛋白酶酶解酪蛋白產(chǎn)生碳末端為精氨酸、賴氨酸的肽鏈，薄層層析圖譜中均有賴氨酸、鳥氨酸斑點，說明此酶解液是胰蛋白酶酶解酪蛋白的產(chǎn)物，改進腫解法與經(jīng)典肼解法均能制備得到碳末端氨基酸。隨著酪蛋白水解度的增加，層析圖譜中各氨基酸的顯色加深，說明隨著酶解程度增加，酶解產(chǎn)物中碳末端氨基酸為精氨酸、賴氨酸的肽鏈的數(shù)量增加，表明胰蛋白酶對酪蛋白中精氨酸、賴氨酸具有定向酶解作用，且改進腫解法與經(jīng)典腫解法均能檢測胰蛋白酶的定向酶解作用。

2.2.2 高效液相色譜鑒定氨基酸含量

鳥氨酸、賴氨酸溶液的標準曲線如圖3所示。回歸方程分別為 ， y= 4.93697×10⁸x+131131 ，且回歸方程的相關系數(shù)的平方 R² 分別為 0.9997.0.9998 ，說明線性關系良好。

按1.4.3節(jié)中的樣品測定方法對碳末端氨基酸進行測定，結果如圖4所示。由圖可知，采用經(jīng)典腫解法與改進肼解法制備得到的碳末端氨基酸溶液中均含有賴氨酸、鳥氨酸。

不同水解度的酪蛋白凍干粉所得的碳末端氨基酸溶液中鳥氨酸、賴氨酸的含量如表1所示。由表可知，采用經(jīng)典腫解法與改進肼解法制備的碳末端氨基酸溶液中鳥氨酸、賴氨酸的含量隨著酪蛋白水解度的增大而增加，且采用2種腫解法得到的碳末端氨基酸溶液中鳥氨酸、賴氨酸的含量相近。隨著酪蛋白水解度的增加，2種肼解法制備的碳末端氨基酸溶液中賴氨酸、鳥氨酸含量均增加，表明隨著酪蛋白水解度的提高，酪蛋白的胰蛋白酶酶解液中碳末端氨基酸為精氨酸、賴氨酸的肽鏈數(shù)量增多，說明胰蛋白酶對精氨酸、賴氨酸具有定向酶解的作用。對2種腫解法得到的碳末端氨基酸溶液中的鳥氨酸、賴氨酸含量進行 χ_t 檢驗，經(jīng)計算，鳥氨酸含量的 p 值分別為 0.49，0.12，0.20，0.26，0.66 ，均大于0.05，賴氨酸含量的 p 值分別為0.25、0.09、0.13、0.30、0.72，均大于0.05，表明采用經(jīng)典肼解法獲得的碳末端氨基酸含量與改進腫解法獲得的碳末端氨基酸含量無顯著性差異，說明采用操作簡單、安全的改進肼解法測定胰蛋白酶的定向酶解是可行的。

3結論

本文中以胰蛋白酶酶解酪蛋白得到的肽鏈為例，分別采用改進腫解法與經(jīng)典腫解法對肽鏈進行肼解，以此獲得碳末端氨基酸溶液，并分析得到的碳末端氨基酸的含量。通過薄層層析可知，胰蛋白酶酶解酪蛋白所得的酶解液中肽鏈的碳末端氨基酸中有精氨酸、賴氨酸，且隨著酪蛋白水解度的增加，氨基酸顯色加深。采用高效液相色譜測定賴氨酸、鳥氨基酸的含量，2種氨基酸的含量都隨酪蛋白水解程度的增加而增加。上述2種測定方法驗證了胰蛋白酶酶解產(chǎn)物與其水解程度的關系，確定了胰蛋白酶對精氨酸、賴氨酸的定向酶解作用。經(jīng)過對2種肼解法所得的碳末端氨基酸鳥氨酸、賴氨酸的含量進行 Ψ_t 檢驗，表明2種肼解法獲得的氨基酸含量無顯著性差異，說明改進腫解法測定胰蛋白酶的定向酶解是可行的。

改進腫解法直接使用質量分數(shù)為 80% 的水合肼進行肼解反應，免去用水合肼制備無水肼的步驟，使實驗過程更加安全，同時采用易去除氨基酸酰肼的庚醛代替苯甲醛，且庚醛去除氨基酸酰肼時，耗時短，操作簡便，實驗結果與經(jīng)典腫解法一致。碳末端氨基酸測定方法與氮末端氨基酸測定方法相結合，通過控制酶解過程中的因素，測定末端氨基酸的種類與含量，確定不同條件下生物酶制劑對酶切位點的定向識別程度，可以制備含有某種末端氨基酸的活性肽，并控制酶解條件以制備目標活性肽，為定向制備活性肽提供了理論依據(jù)。

參考文獻：

[1] 朱夢媛，李沖偉．植物源功能肽的制備、生理活性與應用研究進展[J]．食品科學，2021，42（17）：364.

[2] DAROITDJ，BRNDELLI A.Invivobioactivitiesoffood protein-derivedpeptides：acurrentreview[J].CurrentOpinioninFoodScience，2021，39：120.

[3] 于弋涵，杜偉寧，胡秋輝，等．酶法水解猴頭菇多肽的生物活性[J]．食品科學，2021，42（21）：122.

[4] AKABORI S，OHNOK，NARITAK.On the hydrazinolysisofproteins and peptides：a method for the characterization ofcarboxyl-terminal amino acids in proteins[J]. Bulletin of the ChemicalSocietyofJapan，1952，25（3）：214.

[5]] OHNO K. On the structure of Lysozyme. II： on the carboxy-terminalpetide[J].TheJournal ofBiochemistry，1955，42（6）：615.

[6]NAKAKITA S， SUMIYOSHIW，MIYANISHIN， et al. A practicalapproach to N-glycan production by hydrazinolysis using hydrazinemonohydrate[J].Biochemical andBiophysicalResearchCommu-nications，2007，362（3）：640.

[7] KUSAMAK.On the species difference in carboxy-terminal aminoacidsofserumalbuminsfromvariousanimals[J].The JournalofBiochemistry，1957，44（6）：375.

[8] BRADBURYJ.The hydrazinolysis ofinsulin，lysozyme，woolproteins and wool[J]. Biochemical Journal，1958，68（3）：482.

[9] 周佳，朱書強，李雁，等．酸水解法-全自動氨基酸分析儀測定不同種類蜂蜜中氨基酸含量及其分析［J]．中國蜂業(yè)，2023，74（5） ： 45.

[10] 段姍姍，董志.HPLC測定門冬氨酸鳥氨酸注射液的含量[J]．華西藥學雜志，2014，29（4）：480.

[11] 孫慧娟，王瑞，宋芊芊，等．基于超快速液相色譜-質譜聯(lián)用技術檢測藥食兩用薄荷中氨基酸和核苷類成分[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（8）：261.

[12] 朱靜怡，范春婷，陸慧媛，等．毛細管電泳在蛋白質及其水解產(chǎn)物分析中的應用及進展[J].食品安全質量檢測學報，2022，13（18）：5855.

［13］苗會娟，徐艷梅，郝麗娟，等．柱前衍生-高效液相色譜法測