粉紅掠鳥線粒體基因組測(cè)定及其系統(tǒng)發(fā)育分析

線粒體是生物體內(nèi)的一種半自主細(xì)胞器，參與能量轉(zhuǎn)換和細(xì)胞凋亡等重要生理過程[1-3]，作為分子標(biāo)記在動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育研究中被廣泛使用[4]鳥類的線粒體基因組與脊椎動(dòng)物相近，是閉合環(huán)型雙鏈DNA，主要由一重一輕兩條鏈構(gòu)成，結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，易于純化，對(duì)于探索DNA結(jié)構(gòu)及其基因表達(dá)的進(jìn)化較為理想[5-7]。線粒體基因組由編碼區(qū)和非編碼區(qū)構(gòu)成，鳥類線粒體基因組共編碼37個(gè)基因，其中包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因，非編碼區(qū)又稱取代環(huán)（displacementloop，D-loop），是線粒體基因組的控制區(qū)[8]。鳥類線粒體嚴(yán)格遵循母系遺傳，具有堿基突變率高及進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，從而使其在分子系統(tǒng)學(xué)及分子進(jìn)化研究領(lǐng)域占有一席之地[9-14]。

粉紅掠鳥（Pastorroseus）屬于雀形目，驚鳥科，粉紅掠鳥屬，是一種長(zhǎng)距離遷徙鳥類[15-18]。印度、斯里蘭卡是其越冬地，春季遷至中西亞、東歐等地繁殖[19]。鳥群于每年5月初遷徙至新疆繁殖，繁殖期間主要以蝗蟲為食[20-21]，8月下旬返回越冬地[22]。粉紅掠鳥的繁殖期與新疆草原蝗蟲發(fā)生同步，可大幅降低草原蝗蟲密度，通過人工招引粉紅椋鳥進(jìn)行生物防控蝗害不僅成本低廉，還可改善生態(tài)環(huán)境，因此對(duì)其全面深入研究對(duì)草原蝗蟲防治具有重要意義。

目前有關(guān)粉紅椋鳥的研究較少，國(guó)內(nèi)主要集中在生物學(xué)和治蝗效果等方面。利用人工筑建的石巢和磚巢招引粉紅椋鳥控制草原蝗蟲數(shù)量[20，23-25];揭示了部分地區(qū)粉紅椋鳥的繁殖規(guī)律[26-27]。國(guó)外集中于粉紅掠鳥的分布新記錄[28-30]以及遷徙過程的能量物質(zhì)代謝等生理變化研究[31]。目前對(duì)遷徙至新疆各地的粉紅掠鳥是否具有親緣關(guān)系還不清楚，且粉紅掠鳥的線粒體全基因組序列未見報(bào)道。本研究采用二代測(cè)序技術(shù)首次獲得并注釋了粉紅椋鳥線粒體基因組的完整序列，對(duì)其堿基組成、基因特征、密碼子使用情況，以及tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)合已發(fā)表的其他24種鳥類線粒體全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，旨在明確新疆地區(qū)粉紅椋鳥的線粒體基因組特征，為后續(xù)深入研究新疆粉紅掠鳥的親緣關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

于2022年5—7月在新疆維吾爾自治區(qū)哈密市伊州區(qū)馬場(chǎng)三連 （43^°24^′N，93^°31^′E） 采集12只粉紅椋鳥雛鳥的血樣。采用無菌注射器采集雛鳥翅下靜脈血，每只雛鳥采血 0.5mL ，隨后將血樣迅速移至帶有 1% 肝素鈉溶液的離心管中，移液器緩慢吹打使其充分混勻，于一 80^°C 保存，備用。

1.2方法

1.2.1總DNA的提取和線粒體基因組測(cè)序使用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒（B518253，上海生工）提取粉紅掠鳥總DNA。采用Nanodrop 2000 檢測(cè)DNA濃度及 OD_260/280 ，取1μL DNA模板進(jìn)行 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定DNA質(zhì)量，并將質(zhì)量合格的DNA樣品送至北京百邁客生物科技有限公司，采用IlluminaNo-vaSeq6OoO（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行二代測(cè)序和組裝。

1.2.2線粒體基因組注釋利用MITOSWeb-Server和ORF在線網(wǎng)站對(duì)拼接完成的線粒體基因組進(jìn)行注釋，tRNA、rRNA在基因組上的位置預(yù)測(cè)由RNAfold在線網(wǎng)站完成，若存在無法預(yù)測(cè)的基因，則通過MEGA6.0對(duì)近緣物種的tRNA、rRNA編碼基因進(jìn)行比對(duì)分析后完成注釋。使用MEGA6.0分析粉紅椋鳥線粒體基因組的堿基組成及密碼子使用情況，同時(shí)計(jì)算偏斜值 （AT-skew=[A-T]/[A+T] 、GC-skew [G-C]/[G+C]; 。tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過MITOS和tRNAscan-SE完成，與近源物種比對(duì)后，使用Adobeillustrator對(duì)所得二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建通過GenBank已公布的共3科12屬25種鳥類的完整線粒體基因組序列，以紅原雞（Galusgalus）作為外群，采用MEGA6.0進(jìn)行序列比對(duì)，分別選擇鄰接法（neighbor-joiningmethod，NJ）和最大似然法（maximumlikelihoodmethod，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以重復(fù)100o次的檢測(cè)（Bootstrap）計(jì)算置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1粉紅椋鳥線粒體基因組全序列分析

粉紅掠鳥線粒體基因組結(jié)構(gòu)如圖1所示，線粒體基因是典型的環(huán)狀雙鏈DNA，全長(zhǎng)16840bp（GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)：PP792558）;共編碼37個(gè)基因，其中包括22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因以及13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，此外還有1個(gè)非編碼控制區(qū)（D-loop區(qū)），詳細(xì)基因注釋見表1。

粉紅椋鳥完整線粒體基因組序列中的A、T、C和G堿基含量分別為 29.96%.22.79% 32.27% 和14. 98% ，其中 A+T 的含量為52.75% _C+G 的含量為 47.25% ，AT偏斜（ATskew =0 .14）為正值，GC偏斜（GCskew -0.37） 為負(fù)值，多數(shù)情況下不選擇G參與蛋白編碼，這種現(xiàn)象在脊椎動(dòng)物中普遍存在，說明堿基組成對(duì)A、T編碼具有一定的偏好。

2.2蛋白質(zhì)編碼基因特征及密碼子使用

粉紅椋鳥線粒體基因組中的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因全長(zhǎng) 11 395bp ，占整個(gè)線粒體基因組的67.67% ;其中序列最短的是 ATPamp; ，僅 168bp ；序列最長(zhǎng)的是ND5，為 1818bp 。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因在H鏈和L鏈上均有分布，僅ND6分布在L鏈上，其余的12個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因均分布于H鏈上。

如表2所示，13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的堿基組成比例為 C（33. 33%）gt;A（ 28. 15%）gt;T （2 ， A+T 的含量為51.85% ，呈現(xiàn)出一定的AT偏好性。此外，CO和ND6的 A+T 含量均低于 50% 。

在13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，主要的起始密碼子為ATG，僅 COI 的起始密碼子是GTG。終止密碼子以TAA為主，包括COⅡ .ATP8?ATP6 、ND3、ND4L和Cytb6個(gè)基因；其次是AGG，包括ND1和 COI 這兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因； ND5 基因和ND6基因的終止密碼子分別是AGA和TAG；此外，ND2、COI和ND4這3個(gè)基因的終止密碼子不完整。

粉紅掠鳥線粒體全基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因密碼子的相對(duì)同義密碼子使用度（relativesynonymouscodon usage，RSCU）如表3所示。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中共有3797個(gè)氨基酸編碼密碼子，密碼子的使用頻率不盡相同，最高為CUA（Leu），共使用355次，RSCU是3.21;最低是UAG和AGA（Arg），均使用1次，RSCU分別是0.03和0.08。

表3粉紅椋鳥線粒體基因組的編碼蛋白密碼子使用頻率

2.3粉紅椋鳥線粒體基因組的RNA編碼基因特征及二級(jí)結(jié)構(gòu)

粉紅椋鳥線粒體基因組上具有22個(gè)典型的tRNA編碼基因，其整體長(zhǎng)度為 1 543bp ，占線粒體基因組的 9.16% ，堿基長(zhǎng)度為 66～75bp ，相鄰tRNA之間存在重疊或間隔。A、T、C和G的堿基含量分別為 29.42%.27.74%.20.61% 和22.23% A+T 的含量為 57.16% 。

H鏈上的tRNA基因有14個(gè)，分別是 tR NAPhe、 tRNA^Val 、tRNALeu 2、 tRNA^Ile 、 tRNA^Met （2號(hào)tRNA^Trp 、 tRNA^Asp 、 tRNA^Lys 、 tRNA^Gly 、tR-NA^Arg ） tRNA^His 、tRNASer1、tRNALeu1和 tR NA^Thr 。L鏈上的 tRNA基因有8個(gè)，包括 tR NA^Gln ！ tRNA^Ala 、 tRNA^Asn 、 tRNA^cys 、 tRNA^Tyr ，tRNA^serZ，tRNA^Pro 和 tRNA^Glu ;其中 tRNA^Leu2 基因的序列最長(zhǎng)，是 tRNA^serI 基因的序列最短，是 66bp 。

對(duì)22個(gè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，所有基因均可通過折疊形成完整的三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2），但存在36處堿基錯(cuò)配，在氨基酸接受臂上堿基錯(cuò)配出現(xiàn)較多。36處堿基錯(cuò)配中多數(shù)為常見的G-U錯(cuò)配，有29處；有2處A-A錯(cuò)配分別位于 tRNA^Trp 的DHU臂和 tRNA^Asp 的 TΨC 臂；有2處U-U錯(cuò)配分別位于 tRNA^Met 的 TΨC 臂和 tRNA^Gly 的反密碼子臂；有2處C-C錯(cuò)配分別位于 tRNA^Leu2 的氨基酸接受臂和 tRNA^Gly 的反密碼子臂;僅有1處A-C錯(cuò)配位于 tRNA^His 的氨基酸接受臂。

粉紅掠鳥線粒體基因組包括2個(gè)rRNA編碼基因，其位置順序?yàn)? ；其中 的長(zhǎng)度為 的長(zhǎng)度為 1 600bp 。A、T、C和G的堿基含量分別為 32.45%.20.71% 、26.02% 和 20.82% ， A+T 的含量為 53.16% 。

2.4粉紅椋鳥基因序列的重疊和間隔

粉紅掠鳥的線粒體基因組存在基因重疊現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)有6處基因重疊，范圍從 1bp～10bp ，共計(jì) 29bp;ATP8 和 ∣ATP6 基因之間的重疊區(qū)域最大，為 10bp ;最小重疊區(qū)域分別發(fā)生在 tRNA^Gln （204號(hào)和 tRNA^Met 、 tRNA^cys 和 ） tRNA^ser1 和tRNA^LeuI 之間，均為 1bp 。

基因間隔區(qū)有17處，范圍從 1bp～20bp ，共計(jì) 95bp 手 tRNA^Pro 和ND6之間的基因間隔區(qū)最大，為 ；基因間隔區(qū)最小的有6處，分別為tRNA^Trp 和 tRNA^Ala 、 .tRNA^Tyr 和COI、COⅡ和tRNA^Lys 、 tRNA^Lys 和 ATPamp; 、ND3和 tRNA^Arg （20號(hào)以及 tRNA^Arg 和 ND4L 之間，均為 1bp 。

粉紅掠鳥線粒體基因組的D-loop區(qū)處于tRNA^Glu 和 tRNA^Phe 之間，全長(zhǎng) 1257bp，A+T 堿基含量為 55.21% 。

2.5粉紅椋鳥的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究利用粉紅椋鳥線粒體全基因組數(shù)據(jù)和GenBank數(shù)據(jù)庫公布的其他24種鳥類線粒體全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，詳細(xì)序列信息見表4。

用25個(gè)物種的線粒體全基因組序列構(gòu)建NJ樹和ML樹，2種方法構(gòu)建的發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)結(jié)果一致，且大多數(shù)分支置信度均較高（圖3，圖4）。

25個(gè)物種從基部分為兩大支，其中雀形目的24個(gè)物種分為一大支，紅原雞作為外群分成另一支。掠鳥科的10個(gè)物種聚為一支，燕科的14個(gè)物種聚為另外一支。在掠鳥科中，粉紅椋鳥與黑領(lǐng)椋鳥（Sturnusnigricollis）聚為姊妹類群；同屬的物種基本分布在一起，符合傳統(tǒng)分類，牛椋鳥屬（Buphagus）和鷦哥屬（Gracula）聚為一支，再與驚鳥屬（Sturnus）、八哥屬（Acridotheres）和長(zhǎng)冠八哥屬（Leucopsar）聚為一個(gè)支序。椋鳥屬內(nèi)的種間關(guān)系顯示，絲光椋鳥（Sturnussericeus）和灰掠鳥（Sturnuscineraceus）聚為姊妹類群，姊妹類群間親緣關(guān)系較近。在燕科中，崖燕屬（Progne）與樹燕屬（Tachycineta）聚為姊妹類群；斑燕屬

3討論

粉紅椋鳥的線粒體基因組序列全長(zhǎng)16840bp，共編碼37個(gè)基因，其中包括 22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因以及13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，此外還有1個(gè)非編碼控制區(qū)，其序列長(zhǎng)度及各部分DNA分子結(jié)構(gòu)和已發(fā)表的掠鳥科物種線粒體全基因組相似，如家八哥（Acridotherestris-tis）[32]和絲光椋鳥[33]。但也存在不一致的地方，如粉紅椋鳥線粒體蛋白質(zhì)編碼基因中 COI 的起始密碼子是GTG，而黑領(lǐng)掠鳥為ATG;粉紅椋鳥NDI的終止密碼子是AGG，而鷦哥（Graculare-ligiosa）為TAG。雖然線粒體具備其特有的遺傳密碼子，但不同物種之間也有區(qū)別，這在鳥類中屬于正?，F(xiàn)象[34]。

Fig.3NJ tree constructed based on complete mitochondrial genome sequence of 25 bird species

粉紅掠鳥線粒體全基因組序列的堿基含量為A（29.96%） 、 T（22. 79%） 、 C（32.27% 和G（14.98% ），其中 A+T 的含量為 52.75% ，AT偏斜為0.14，說明其偏好AT 編碼[35]。密碼子使用偏好在不同物種甚至同一物種的不同基因中均具有特異性，物種在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中突變、選擇和漂變的綜合作用造成了這種偏好性[36-37]。密碼子使用偏好與基因表達(dá)密切相關(guān)，高表達(dá)的基因由于需要提高翻譯準(zhǔn)確性和效率而傾向于使用最優(yōu)密碼子，因此表現(xiàn)出高的密碼子使用偏好性[38]。本研究中粉紅椋鳥ND3基因的第174位沒有額外插入C堿基，與白眉姬（Ficedulazanthopy-gia）等物種的結(jié)果一致，這可能與鳥類快速輻射進(jìn)化有關(guān)[39]，也可能是自然選擇的結(jié)果[40]，但鴻雁[41]（Anser cygnoides）ND3 基因的第174 位存在插入C堿基的情況，所以不能用此方法鑒別鳥類。

在13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，主要的起始密碼子為ATG，使用頻率最高的終止密碼子是TAA，這同大山雀[42]（Parusmajor）、灰頭麥雞[43]（Vanellus cinereus）、丘鷸[43]（Scolopax rustico-la）、白腰草鷸[43]（Tringaochropus）、針尾沙錐[43]（Gallinago stenura）、灰胸竹雞[44]（Bambu-sicolathoracica）和棕胸竹雞[44]（Bambusicolafytchii）等鳥類的密碼子使用情況相似。此外，ND2、COⅢ和ND4這3個(gè)基因的終止密碼子不完整，這是鳥類的一種常見現(xiàn)象[45]。通常情況下，不完整的終止密碼子與相鄰的tRNA之間存在重疊序列，該終止密碼子能夠利用轉(zhuǎn)錄后加工過程將其補(bǔ)充為完整的TAA，在此過程中起主要作用的是 tRNA^[46-47] ?？聴畹萚48]研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)鳥類在COⅢ基因上普遍以T作為不完整的終止密碼子，這與本研究結(jié)果相符，多項(xiàng)研究表明這種不完全密碼子現(xiàn)象常見于后生動(dòng)物線粒體基因組中[49-50]，推測(cè)這是鳥類線粒體基因組的密碼子在進(jìn)化過程中的普遍現(xiàn)象。

粉紅掠鳥線粒體基因組tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)不存在DHU臂缺失現(xiàn)象，但李雪娟等[51]則發(fā)現(xiàn)山鷓鴣屬（Arborophila）的 tRNA^Ser 缺少DHU臂，這種現(xiàn)象常見于脊椎動(dòng)物[52]，導(dǎo)致結(jié)果不一致的原因可能與tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。雖然山鷦鴣屬的 tRNA^ser 不包含完整的DHU臂，但由于協(xié)同臂之間存在互補(bǔ)作用，所以該異常結(jié)構(gòu)也可以正常發(fā)揮其功能[53]。粉紅椋鳥的tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中除典型的堿基配對(duì)外，也存在一定的錯(cuò)配現(xiàn)象，其中包括G-U，A-A，U-U，C-C以及A-C錯(cuò)配，這種非典型的配對(duì)方式符合G-U擺動(dòng)配對(duì)原則[54]。

本研究首次進(jìn)行了粉紅掠鳥的線粒體全基因組序列測(cè)定及分析，并與24種鳥類的線粒體全基因組共同構(gòu)建NJ樹和ML樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致且各分支置信度均較高，其中粉紅椋鳥與9種椋鳥科鳥類聚為一支，其余14種燕科鳥類聚為一支，且都與外群分開。結(jié)果表明，粉紅椋鳥與黑領(lǐng)掠鳥的親緣關(guān)系最近；同屬的物種分布范圍較近，符合傳統(tǒng)分類。

4結(jié)論

采用二代測(cè)序技術(shù)首次獲得并注釋了粉紅掠鳥的線粒體基因組完整序列，其序列特征與其他掠鳥科物種相似，利用NJ法與ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育分析支持粉紅掠鳥與黑領(lǐng)掠鳥的親緣關(guān)系最近。

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Mitochondrial GenomeDetermination and Phylogenetic Analysis of Pastor roseus

WANG Xiaojie1，SUN Xixiu1，YANG Kun2，SONG Yanwen3 ZHANG Minqian4，JI Rong1 ，LIN Jun2 and YE Xiaofang

（1.CollegeofifeScience，XijangNormalUniversityInternationalCenterfortheCollaborativeManagementofossborderPest in CentralAsia，Biology LaboratoryforConservationand Regulationof Species in Special Environments in Xinjiang，KeyLaboratoryof SpecialEnvironment BiodiversityApplicationandRegulationinXinjiang，Urumqi830017， China;2.Grassand Biological Disaster Control Center of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi830oo1，China; 3.HamiStation for Prediction，F(xiàn)orecast and Control of Locust and Rodent Pests，Hami Xinjiang839oo，China; ili XiangfengAgriculture，F(xiàn)orestryandAnimalHusbandryEcologicalDevelopmentCo.，td.，Yining Xinjiang835oo，China）

Abstract This study aims to elucidate the complete mitochondrial genome sequence of Pastor roseus and to assess its phylogenetic status. The mitochondrial genome was sequenced using second-generation sequencing technology，followed by a detailed annotation and characterization analysis. Phylogenetic relationships were investigated through the adjacency method and maximum likelihood method. The results showed that the mitochondrial genome of P . roseus was a typical circular double-stranded DNA molecule （GenBank accession No.PP792558），with a total length of 16 840 bp and an AT bias of （204 52.75% . This complete mitochondrial genome of P . roseus contained 37 coding genes，comprising 22 tRNA genes，2 rRNA genes，13 protein-coding genes，and 1 non-coding control region. The start codon of the 13 protein-coding genes was predominantly ATG，while TAA was the prevalent stop codon. All 22 tRNAs exhibited complete cloverleaf structures.Phylogenetic trees constructed from both methods shared identical topological structure，clustering P .roseus with nine other bird species within the Sturnidae family. The mitochondrial genome sequence of P . roseus was closely related to that of other Sturnidae species，with phylogenetic analysis indicating that P . roseus was most closely related to Sturnus nigricollis.These findings not only enhance the genomic resources available for avian species but also provide a scientific foundation for understanding the kinship among various P . roseus populations that migrate across borders into Xinjiang.

Key wordsPastor roseus ；Mitochondrial genome; Sequence characteristics；Neighbor-joining meth od；Maximum likelihood method

Received2024-07-26 Returned 2024-10-31

Foundation item Tianshan Young Talent Project for Outstanding Young Scholars of Xinjiang Uygur Autonomous Region（No. 20243123638）; Tianshan Innovative Research Team of Xinjiang Uygur Autonomous Region（No.2024Dl4006）； Tianshan Leading Talent Project （No. TSYCLJ0016）；2022 Youth Top Talent Project of Xinjiang Normal University （No. XJNUQB2022-30）.

First author WANG Xiaojie，female，master student.Research area：animal developmental biology.Email：1085824478@qq.com

Corresponding authorYE Xiaofang，female，Ph.D，professor. Research area：animal developmental biology. E-mail ：44894047@qq. com

LIN Jun，male，agricultural extension research felow. Research area： pest control. E-mail： xjcy2009@163.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）