蘭州百合種內(nèi)自然雜交 F₁ 群體的遺傳變異

蘭州百合（Liliumdavidiivar.unicolor）是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）野生川百合（L.dauidii）的變種，是中國(guó)唯一的食用甜百合，其風(fēng)味獨(dú)特，且有保健功效，是甘肅省地理標(biāo)志產(chǎn)品。由于長(zhǎng)期無(wú)性繁殖，在自然選擇和人為選擇的共同作用下，蘭州百合遺傳基礎(chǔ)逐漸狹窄，一些稀有基因資源正在面臨丟失[1-2]。

目前，蘭州百合育種尚處于起步階段，僅有的3個(gè)品種（‘蘭百1號(hào)蘭百2號(hào)'和‘中百1號(hào)）均是從栽培群體中選擇自然變異單株選育而成。作為野生百合資源之一，蘭州百合由于食用性好、花形優(yōu)美，且抗旱、耐寒、高抗鐮刀菌[3]，在百合雜交育種中常用作親本創(chuàng)制賞食兼用百合新種質(zhì)或品種[4-5]。已報(bào)道蘭州百合與卷瓣組內(nèi)的大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowiczii Bak-er）[6]、山丹（Lilium pumilum Redoute）[7]、垂花百合（Lilium cernuum Kom.）[8]、卷丹（LiliumlancifoliumThunb.）9雜交親和，與百合組的岷江百合（Lilium regale Wilson）[1o]、麝香百合（Lilium longiflorum Thunb.）[11-12]和龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）[i3-14]，以及輪葉組的青島百合（LiliumtsingtauenseGilg.）[8和亞洲百合雜種系內(nèi)的大多數(shù)品種[5，15-16]遠(yuǎn)緣雜交親和。

已有研究發(fā)現(xiàn)，蘭州百合作為親本對(duì)雜種后代的花色、品質(zhì)有影響：蘭州百合與亞洲百合雜交F₁ 群體花色、花朵數(shù)量、葉片寬等表型性狀變異廣泛，表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)和趨中變異[5，15]，而且可溶性糖含量和淀粉含量明顯優(yōu)于親本亞洲百合[5]；龍牙百合與蘭州百合雜交 F₁ 代幼苗氣孔密度、葉綠素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量和淀粉含量與親本存在較大差異，其中可溶性糖含量顯著高于龍牙百合，表現(xiàn)出顯著的雜交優(yōu)勢(shì)[14]。

蘭州百合自交不親和，群體內(nèi)異株異花授粉可結(jié)實(shí)[8，17-19]。據(jù)筆者統(tǒng)計(jì)，蘭州百合自然雜交坐果率僅為 7.15% ，單個(gè)蒴果平均自然結(jié)種數(shù)為211.6粒，其中有胚種子平均為95.3粒，占45.03% 。作為食藥同源植物，從維系其道地性和遺傳資源的純正性出發(fā)，開(kāi)展種內(nèi)雜交可以在保持其道地性的基礎(chǔ)上豐富遺傳基礎(chǔ)、進(jìn)行種質(zhì)復(fù)壯和創(chuàng)新，為種質(zhì)資源的恢復(fù)和保護(hù)提供技術(shù)保障，亦可為其他百合野生資源的保護(hù)提供理論依據(jù)和方法借鑒。蘭州百合種內(nèi)雜交后代的遺傳分化方面鮮有報(bào)道。

ISSR標(biāo)記無(wú)需事先了解生物體的基因組序列，是一種可以在不同物種間通用、穩(wěn)定、多態(tài)性高的顯性標(biāo)記，在基因組巨大且還未完成全基因組測(cè)序的百合多樣性研究中應(yīng)用廣泛[20-23]。為了深入了解蘭州百合種內(nèi)雜交 F₁ 群體的遺傳分化特點(diǎn)，本研究開(kāi)展DNA水平的遺傳多樣性分析，以期評(píng)估利用種內(nèi)雜交育種技術(shù)進(jìn)行蘭州百合新品種選育和種質(zhì)創(chuàng)新的有效性，同時(shí)為蘭州百合種內(nèi)雜交子代性狀預(yù)測(cè)及育種策略提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)田位于蘭州市西固區(qū)金溝鄉(xiāng)馬家山村（東經(jīng) 103^°40^′ ，北緯 36^°01^′ ，海拔 2 179m ；2021年蘭州百合種植田中進(jìn)行自然雜交坐果率統(tǒng)計(jì)，并采集自然雜交蒴果，以蒴果為單位統(tǒng)計(jì)雜交群體。

1.2 F₁ 代實(shí)生苗無(wú)菌培養(yǎng)

收集膨大蒴果，挑選有胚種子進(jìn)行消毒處理：流水沖洗 30min，70%（V/V） 乙醇浸泡 45s，2% （V/V）NaClO 溶液浸泡 （期間不斷晃動(dòng)），無(wú)菌水清洗3次，無(wú)菌濾紙吸干水分，接種到1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng) （23^°C～25^°C ），待胚萌發(fā)時(shí)轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度： 100μmol?m^-2 （20·s^-1 ，培養(yǎng)溫度為 25^°C±1^°C ，光周期為 ^16h 光/ ^′₈h 暗）。

1.3 引物合成及基因組DNA提取

ISSR引物合成：利用加拿大哥倫比亞大學(xué)（UniversityofBritishColumbia，UBC）設(shè)計(jì)的引物[24]，選取實(shí)驗(yàn)室前期篩選的在蘭州百合中有穩(wěn)定擴(kuò)增產(chǎn)物的20條ISSR引物[25]，由上海生工合成。以C6群體中12個(gè)單株基因組DNA為模版共篩選出9條在 F₁ 群體中有多態(tài)性的ISSR引物（表1）。

基因組DNA的提取與檢測(cè)：采用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，Cat.No.DP305）提取葉片總DNA，使用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop分光光度計(jì)分別檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，并稀釋至 ，備用。

1.4ISSR體系優(yōu)化及擴(kuò)增反應(yīng)

取6個(gè)在同一試驗(yàn)田采集的自然雜交蒴果，以蒴果為單位分別進(jìn)行種子無(wú)菌培養(yǎng)，同一蒴果內(nèi)種子無(wú)菌培養(yǎng)獲得的 F₁ 代實(shí)生苗為同一自然雜交群體，編號(hào)分別為 C1～C6 ；以C6母本的鱗片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得的再生苗群體作為對(duì)照，編號(hào)為C7。 C1～C7 群體分別隨機(jī)取12個(gè)單株提取基因組DNA，并作為模板，以合成的ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：總體積 20μL ，含 50ng DNA，2.0 mmol·L^-1 MgCl₂ ，0.4 mmol· ，1 U TakaraTaq^TM，0.5μmol?L^-1 ISSR primer。梯度 PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C 預(yù)變性 變性 45s 退火 45s，72^°C 延伸 1min，35 個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物在 2.0% 的瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldview染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

1.5 數(shù)據(jù)分析

凝膠上的帶型，以列為株系，行為擴(kuò)增片段，每個(gè)條帶代表一個(gè)基因位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)清晰可辨、可重復(fù)的條帶。在相同遷移位置，有帶記為1，無(wú)帶記為O，建立ISSR數(shù)據(jù)矩陣。

按NTsys2.10e軟件格式要求輸入賦值，采用NTsys 2.10e 軟件中進(jìn)行遺傳一致度和遺傳距離計(jì)算，并用UPGMA程序構(gòu)建聚類圖。利用PopGene32軟件分析不同蘭州百合種內(nèi)自然雜交 F₁ 群體多態(tài)性位點(diǎn)百分率、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei's指數(shù)（H）和Shannon's指數(shù)（I）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 F₁ 群體內(nèi)部的遺傳變異

9條引物在72份樣品中擴(kuò)增的條帶大小介于 200～1200bp ，電泳圖中各列之間擴(kuò)增條帶遷移位置分布的不同代表不同的電泳譜帶類型，同一群體中12個(gè)單株電泳譜帶類型的數(shù)量反映了該群體遺傳多樣性程度。

6個(gè)實(shí)生苗群體中C5群體平均譜帶類型數(shù)量最多，為7.8，C2群體最少，為6.0，6個(gè)群體平均為6.75，顯著大于組織培養(yǎng)群體C7的平均值1.7（表2，圖1），說(shuō)明種內(nèi)雜交 F₁ 代群體內(nèi)部在DNA水平上具有較高的遺傳多樣性，即蘭州百合自然雜交 F₁ 代群體內(nèi)個(gè)體間在DNA水平上存在較高的遺傳分離。

利用POPGENE32軟件從多態(tài)位點(diǎn)百分率、觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s多樣性指數(shù)和Shannon's指數(shù)5個(gè)指標(biāo)綜合分析各種內(nèi)雜交 F₁ 群體內(nèi)部遺傳多樣性：C5群體內(nèi)部多態(tài)位點(diǎn)百分率最高，為 84.91% ，C2和C4群體最低，為 69.81% ，平均 75.79% ，是組培苗群體C7（30.19%） 的2.5倍。群體內(nèi)有效等位基因數(shù)、Nei's指數(shù)和Shannon's指數(shù)同樣以C5群體最高，C2最低，均高于C7（表3）。以上從等位基因數(shù)、基因多樣性和豐富度方面說(shuō)明各種內(nèi)雜交F₁ 群體內(nèi)部具有較高的遺傳多樣性，與譜帶類型數(shù)量分析結(jié)果相一致。

表2各群體擴(kuò)增的電泳譜帶類型數(shù)量

2.2 F₁ 群體之間的遺傳多樣性

從表4可以看出，6個(gè) F₁ 群體之間遺傳一致度為 0.8051～0.9336 ，其中C1與C2、C3與C4、C4與C5之間的遺傳一致度均高于0.9000，C4與C6之間的遺傳一致度最低，亦高達(dá)0.8051，說(shuō)明不同 F₁ 群體之間遺傳相似性高，多樣性低。

2.3不同 F₁ 群體的聚類分析

利用NTSYS2.1O軟件，計(jì)算群體的遺傳相似系數(shù)，根據(jù)遺傳相似系數(shù)值按以不加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均法（UPGMA）構(gòu)建6個(gè) F₁ 群體的72個(gè)單株的親緣關(guān)系聚類圖（圖2）。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.672時(shí)，6個(gè) F₁ 群體的72個(gè)單株被分為6個(gè)類群：C6群體的63（類群I）和61（類群ⅡI）、C3群體的28和29（類群Ⅱ）、C5群體的56（類群V、C6群體的64和66（類群V）、剩余均屬于類群V。類群VI包含C1、C2和C4群體的全部單株，以及C3、C5和C6群體 83.3%.91.7% 和66.7% 的單株。表明不同雜交組合的 F₁ 群體的大多數(shù)單株間遺傳相似性高，具有很近的親緣關(guān)系，個(gè)別單株產(chǎn)生了遺傳重組，具有明顯的遺傳分化。聚類圖中，C1、C2和C4群體的全部單株都在同一類群，C3和C5群體被分為2個(gè)類群，C6被分為4個(gè)類群，說(shuō)明C6群體內(nèi)比其他群體有更高的遺傳分化。

對(duì)6個(gè) F₁ 群體的72株實(shí)生苗進(jìn)行主成分分析（圖3），主成分1、2的貢獻(xiàn)率分別為 10.41% 和7.20% 。從6個(gè)組的單株在主成分坐標(biāo)圖的分布位置來(lái)看，C1和C2群體大部分單株主要分布在散點(diǎn)圖的第2象限，C3主要分布在第4象限，C4和C5的主要分布在第3象限，C6主要分布在第1象限。從圖中可以看出，C1與C2、C4與C5、C2與C4和C5、C3與C4和C5分布區(qū)域有重疊，表明這幾個(gè) F₁ 群體的后代之間遺傳相似性高，C6與其他組重疊最少，表明其與其他組的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與聚類分析的結(jié)果基本一致。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，蘭州百合種內(nèi)雜交 F₁ 代群體內(nèi)具有較高的遺傳多樣性（相對(duì)多態(tài)位點(diǎn)百分率平均為 75.79% ，Shannon’s指數(shù)為 0. 3978～ 0.5118），而 F₁ 群體間遺傳多樣性低（遺傳一致度為 0.8051～0.9336） ，與李謀強(qiáng)等26報(bào)道的蘭州百合栽培群體遺傳變異主要存在于栽培居群內(nèi)，各栽培居群間的變異小的結(jié)論一致，多樣性略低于喇叭百合自交群體（相對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)百分率為 88.46% ，Shannon's指數(shù)為 0.62±0.08^[19]） 這與蘭州百合的繁殖方式和繁育系統(tǒng)相關(guān)。蘭州百合繁育系統(tǒng)屬于專性異交、部分自交親和、需要傳粉者[18，27]。雖然花粉和柱頭都具有活力，但自交不親和，異交親和性很低[18，27]，自然坐果率僅為 7.15% （筆者統(tǒng)計(jì)）。長(zhǎng)期無(wú)性繁殖，加之在生長(zhǎng)期實(shí)行“掐花\"管理，一方面導(dǎo)致栽培居群內(nèi)個(gè)體基因型高度雜合，個(gè)體間無(wú)基因交流現(xiàn)象，另一方面導(dǎo)致栽培居群遺傳組成由若干個(gè)無(wú)性系組成，群體中存在基因型完全一致的個(gè)體，因而產(chǎn)生種內(nèi)雜交 F_i 代群體內(nèi)遺傳多樣性高、而群體間遺傳多樣性低的特點(diǎn)。

李斐斐分別對(duì)2個(gè)不同居群的山丹與蘭州百合雜交后代進(jìn)行聚類分析時(shí)，當(dāng)遺傳相似系數(shù)分別為0.53和0.614時(shí)雜交后代對(duì)應(yīng)可分為4大類群和7大類群，本研究中蘭州百合種內(nèi)雜交后代當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.614時(shí)可分為2大類群，0.672時(shí)可分為6大類群，說(shuō)明蘭州百合與山丹組內(nèi)雜交后代群體的遺傳多樣性大于蘭州百合種內(nèi)自然雜交后代群體，這是由于蘭州百合與山丹組間遺傳距離大于蘭州百合種內(nèi)產(chǎn)生的。

蘭州百合是食藥同源植物，種內(nèi)雜交不僅可以保持其道地性，而且可以拓寬遺傳基礎(chǔ)，有利于群體的提純復(fù)壯，在道地藥材種質(zhì)資源保護(hù)和恢復(fù)方面具有重要意義。種質(zhì)資源多樣性研究是育種工作的基礎(chǔ)，目前蘭州百合育種工作因遺傳基礎(chǔ)狹窄已進(jìn)入瓶頸，從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度來(lái)講，如果不改變這種局面，種質(zhì)資源中一些稀有基因資源將面臨丟失[1-2]。種內(nèi)雜交，一方面可以通過(guò)挑選優(yōu)良單株進(jìn)行系統(tǒng)育種，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)蘭州百合新品種；另一方面可以培育純合自交系，用于雜種優(yōu)勢(shì)利用和遺傳規(guī)律研究。本研究結(jié)果表明，在蘭州百合育種中，在 F₁"群體中進(jìn)行優(yōu)良單株選擇是有效的，但由于不同 F₁"群體間遺傳相似性高，該群體在拓寬蘭州百合遺傳基礎(chǔ)、進(jìn)行遺傳改良和新品種選育方面的作用是有限的，在后續(xù)通過(guò)種內(nèi)雜交進(jìn)行純系和新品系培育中，為了節(jié)約資源，雜交群體和單株選擇數(shù)量都不宜過(guò)多。

Fig. 2 UPGMAclusteringgraphof72seedlingsderived from populationsofL.davidiivar.unicol

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Genetic Variation in F₁ Hybrid Population of Lilium davidii var.unicolor

LI Shujie，CHEN Chen，GAO Hongjuan，ZHANG Minmin， WANG Liguang，HOU Yiqing and PEI Huaidi （Institute of Biotechnology，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 73oo7o，China）

AbstractThis study used the F₁ progeny seedlings from the intraspecific natural hybridization of L dauidii var. unicolor as the experimental material to reveal the genetic variation characteristics through genetic diversity at the DNA level. ISSR analysis showed that the number of electrophoresis profile types in the 6F₁ populations ranged from 6.O to 7.8，with the percentage of polymorphic loci and Shannon's index ranging from 69.81% to 84.91% and from 0.397 8 to 0.511 8，respectively. The genetic consistency among populations ranged from 0.805 1 to 0.933 6，indicating high internal genetic diversity within the populations and high consistency among them；cluster analysis showed that allindividuals from 3F₁ populations and 66.7%-91.7% of the individuals from the other 3F₁ populations clustered into the same group，indicating close genetic relationships and high genetic similarity among the F₁ populations; the PCA scatter plot further confirmed the results of the cluster analysis.

Key words L.davidii var.unicolor；Natural hybridization; F₁ progeny seedlings;Genetic diversity

Received2024-05-30 Returned 2024-07-25

Foundation itemNational Natural Science Foundation of China （No.3196o599）；Research and Development Program of Gansu Province （No.23YFNAOo23）； Project of China Modern Agriculture Industry Technology System（No. CARS-21）； Science and Technology Innovation Project of Gansu Academy of Agricultural Sciences （No. 2022GAAS02）.

First authorLI Shujie，female，Ph.D，associate research felow.Research area：lily genetics and breeding. E-mail： sjli2005@gsagr. ac.cn

Corresponding authorPEI Huaidi，female，master，associate research fellow.Research area： seedling rapid propagation and culture.E-mail： phdfeixiang@163.com

（責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor：PAN Xueyan）