脂氧合酶編碼基因LOX3克隆及其在鮮切芋頭褐變中的作用

鮮切果蔬具有方便快捷、干凈衛(wèi)生、可食率高、營養(yǎng)新鮮等優(yōu)點(diǎn)，深受消費(fèi)者青睞[1-2]。外表皮是果蔬的天然保護(hù)組織，可使果蔬免受病原菌和環(huán)境因子對其生理生化造成的不利影響。但對鮮切果蔬產(chǎn)品而言，采后經(jīng)清洗、去皮和切分等加工處理后，鮮切產(chǎn)品失去了外表皮的保護(hù)[3]。鮮切加工還擾亂了果蔬正常的生理代謝活動，導(dǎo)致其呼吸作用加強(qiáng)，乙烯釋放量增加，抗病性降低，極易被環(huán)境中的病原菌侵染[4]。因此，鮮切果蔬在貯藏期間更容易腐爛變質(zhì)，保持鮮切產(chǎn)品商品性一直是食品加工領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其中，切面褐變是影響鮮切果蔬商品性的關(guān)鍵因素之—[5-6] 0關(guān)于鮮切果蔬褐變的發(fā)生原因，目前比較認(rèn)可兩種理論：一種是切分處理通過苯丙烷途徑誘導(dǎo)黃酮類物質(zhì)的合成積累，在產(chǎn)品切面形成黃褐色的褐斑[7-8]；另一種是切分處理破壞了細(xì)胞區(qū)室化作用，使得酚酶與底物直接接觸反應(yīng)生成黃褐色的醌類物質(zhì)，是造成大部分果蔬褐變的主要原因[9-10]。

近幾年的研究表明，細(xì)胞膜脂過氧化與鮮切果蔬褐變密切相關(guān)[11]。細(xì)胞膜脂過氧化會造成細(xì)胞膜的流動性和完整性降低，增加底物與酶直接接觸的幾率，加速酶促褐變反應(yīng)[12]。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）是一類含非血紅素鐵的雙加氧酶，能催化多不飽和脂肪酸形成含有共軛雙鍵的氫過氧化物，是催化多不飽和脂肪酸氧化的主要酶[13-15]。植物L(fēng)OX能以細(xì)胞膜脂中的亞油酸和亞麻酸為底物發(fā)生加氧反應(yīng)，導(dǎo)致膜脂過氧化[16]。不同品種的梨鮮切后，LOX活性高的品種更容易褐變，而不飽和脂肪酸含量高的品種則不易褐變[1]。硫化氫處理可能通過抑制鮮切梨LOX活性，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，從而緩解其褐變[17]。這些研究結(jié)果暗示，LOX介導(dǎo)的膜脂過氧化是加速鮮切果蔬褐變的重要原因。但植物L(fēng)OX一般是多基因家族，哪些LOX基因與鮮切果蔬褐變密切相關(guān)，目前的研究報(bào)道十分有限。

芋頭[Colocasiaesculenta（L.）Schott]是天南星科多年生塊莖植物，球莖中富含淀粉，是熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛栽種的根菜類蔬菜[18]。中國是除非洲外的最大芋頭生產(chǎn)國和消費(fèi)市場，由于兼具營養(yǎng)和食療價(jià)值，芋頭在中國消費(fèi)量逐年增加[19]。但芋頭中的草酸鈣含量很高，消費(fèi)者在去皮切分時(shí)極易產(chǎn)生皮膚過敏癥狀，不利于擴(kuò)大芋頭消費(fèi)[20]。在產(chǎn)地或加工中心鮮切包裝后再銷售，可避免皮膚過敏問題，能促進(jìn)芋頭的產(chǎn)業(yè)升級和消費(fèi)擴(kuò)大[21]。與鮮切馬鈴薯、山藥、蓮藕等淀粉含量高的根莖類蔬菜相似，切面褐變嚴(yán)重影響鮮切芋頭的商品性和貨架期[22]。但LOX介導(dǎo)的膜脂過氧化是否與鮮切芋頭褐變有關(guān)，仍未見相關(guān)報(bào)道。

本研究比較貯藏溫度對鮮切芋頭褐變的影響，并基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析LOX家族基因在鮮切芋頭褐變過程中的表達(dá)模式。在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的基礎(chǔ)上克隆LOX3基因，并分析序列特性及其在褐變過程中的表達(dá)情況，以期探究LOX3表達(dá)在鮮切芋頭褐變的作用，為新型鮮切芋頭褐變防控技術(shù)的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

1.1.1試驗(yàn)材料供試芋頭購自農(nóng)貿(mào)市場，挑選無機(jī)械傷和病蟲害的芋頭作為試驗(yàn)材料。自來水清洗干凈表面的泥沙后，用去皮刀去掉外表皮，然后將去皮芋頭橫切成約 1cm 厚度，待用。

1.1.2試驗(yàn)處理不同溫度貯藏試驗(yàn)：將芋頭片隨機(jī)分成2組，盛裝在一次性塑料托盤。一組貯藏在 ，另一組貯藏在 4^°C 。每組含30片，3個(gè)重復(fù)（每重復(fù)10片），用普通家用保鮮袋密封包裝。

抗褐變劑處理試驗(yàn)：將芋頭片隨機(jī)分成3等份，每份30片。對照（CK）組用自來水浸泡處理30min ，另2組分別用 0.1g/L 的肉桂酸（cin-namicacid，CA）和香草酸（vanillicacid，VA）溶液浸泡處理 30min 。處理完后室溫瀝干表面水分，用保鮮袋密封包裝，貯藏于 4^°C 恒溫培養(yǎng)箱。每隔2d測定色度、拍照和取樣，樣品用液氮速凍貯藏于一 80^°C 冰箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色度測定使用美能達(dá)CR-400型色差儀測定色差值 （L^?，a^?，b^?） ，分別在每片芋頭的

3個(gè)不同部位測定1次，3次測定結(jié)果的平均值代表該片芋頭的色度。褐變癥狀由數(shù)碼相機(jī)拍照固定，褐變指數(shù)（browningindex，BI）計(jì)算公式如下[23]：

其中

1.2.2芋頭 LOX3 基因全長克隆總RNA提取和cDNA合成的方法參照文獻(xiàn)［24]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序組裝的編碼序列（codingsequence，CDS）設(shè)計(jì)克隆引物，以芋頭cDNA為模板，使用生工生物工程有限公司的Super-FidelityDNAPolymerase試劑盒（產(chǎn)品編號：B639292-0005），通過RT-PCR法擴(kuò)增LOX3基因的全長序列。在PCR反應(yīng)33個(gè)循環(huán)時(shí)加入普通PCR聚合酶，在PCR產(chǎn)物末端增加A尾。利用NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的在線工具設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。

1.2.3生物信息學(xué)分析在Expasy網(wǎng)站分析蛋白理化性質(zhì)，利用在線工具Cell-PLoc和CEL-LO工具預(yù)測亞細(xì)胞定位。在NCBI網(wǎng)站分析保守結(jié)構(gòu)域。以推導(dǎo)的芋頭LOX3氨基酸序列為查詢序列，使用Blast功能依次在擬南芥、煙草和番茄基因組數(shù)據(jù)中查詢同源蛋白，利用DNAman軟件繪制多序列比對圖。在MEGA軟件中利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從TAIR網(wǎng)站下載擬南芥LOX家族蛋白序列，在NCBI網(wǎng)站獲取煙草、浮萍、番茄LOX3蛋白序列。

1.2.4芋頭LOX3表達(dá)分析使用熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測冷藏期間LOX3的表達(dá)模式，qRT-PCR步驟按照翌圣生物科技有限公司的試劑盒（產(chǎn)品編號：11201ES50）說明書進(jìn)行，引物序列見表1。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析CA和VA處理對LOX3表達(dá)的影響，用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)（fragmentsperkilo-base of exon model per million mapped frag-ments，F(xiàn)PKM）表示。

1.2.5LOX活性和MDA含量測定將 1.0g 芋頭樣品（液氮速凍）在5mI ，1×PBS 緩沖溶液中研磨成勻漿液，于 4^°C，11000r/min 離心15min，收集上清液用于測定LOX活性和MDA含量。在比色皿中加入 0.1mL 上清液、 、2.9mL 反應(yīng)混合液（含終濃度為 0.1mol/L 乙酸鈉和2mmol/L 亞油酸鈉），立即在紫外風(fēng)光光度計(jì)中記錄反應(yīng)液在 234nm 波長下 3min 內(nèi)的吸光度變化。LOX活性以 OD_234nm 值每分鐘變化10表示一個(gè)酶活性單位（U），結(jié)果通過U每千克鮮質(zhì)量 （U/kg） 表示。使用生工生物工程有限公司的試劑盒（產(chǎn)品編號：D799761-0050），按照試劑盒說明書測定MDA含量。

1.2.6LOX3啟動子序列提取及元件分析通常默認(rèn)翻譯起始密碼子（ATG）上游200Obp左右的DNA序列為該基因的啟動子序列[25]，為此，在芋頭基因組中查找了 LOX3 基因ATG上游約2000bp的DNA序列。在PlantCARE網(wǎng)站鑒定順式作用元件，使用TBtools軟件繪制逆境相關(guān)元件在啟動子上的分布。

1.3 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

在MicrosoftExcel2016軟件中記錄和整理數(shù)據(jù)，并制作柱形圖和折線圖。在SPSS v22.0 軟件中分析數(shù)據(jù)間的顯著性（ Plt;0.05） 。

2 結(jié)果與分析

2.1貯藏溫度對鮮切芋頭褐變的影響

切面發(fā)黃發(fā)褐是鮮切芋頭的典型褐變癥狀[22]。為明確貯藏溫度對鮮切芋頭褐變的影響，比較了貯藏在不同溫度（ 和 4^°C ）下的褐變進(jìn)展。b”值表示黃藍(lán)色彩維度，正值對應(yīng)黃色方向，且隨著 b^* 值增大，黃色飽和度相應(yīng)增強(qiáng)。在 貯藏期間，切面亮度逐漸下降，黃褐色加深（圖1-A）， b^* 值快速增加（圖1-C），貯藏 24h 已無商品價(jià)值。但在 4^°C 貯藏時(shí)，切面黃褐色緩慢加深（圖1-B）， b^* 值緩慢增加（圖1-C），且增加速率明顯低于 貯藏時(shí)。在 4^°C 貯藏12d時(shí)的b^* 值為12.35，明顯小于 貯藏 24h 時(shí)的14.04，表明低溫貯藏能有效延緩鮮切芋頭褐變。但即使在 4^°C 下貯藏褐變?nèi)圆粩嗉又?，因此，探明低溫貯藏條件下的鮮切芋頭褐變機(jī)制，能為鮮切芋頭抗褐變技術(shù)的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

2.2LOX家族基因在鮮切芋頭褐變過程中的表達(dá)模式

如圖2所示，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共17個(gè)基因被注釋為LOX，不同LOX基因在芋頭褐變過程中的表達(dá)模式差異很大，但總體可分為兩種模式。11個(gè)LOX基因在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量很低，且在不同時(shí)間點(diǎn)的差異不明顯。另外6個(gè)LOX基因在貯藏期間表達(dá)增加，其中2個(gè)LOX基因的初始（Od）表達(dá)量較高，且在鮮切后和低溫貯藏期間急劇增加。這兩個(gè)基因分別被注釋為LOX3（Taro_029076）和LOX6（Taro_032526），暗示LOX3和LOX6在鮮切芋頭褐變中具有重要作用。在6d和12d時(shí)，LOX3的表達(dá)量是0d時(shí)的6.88倍和6.80倍。

2.3芋頭LOX3基因全長克隆

由于LOX3和LOX6表達(dá)在鮮切處理后顯著增加，且LOX3表達(dá)量的增加幅度明顯高于LOX6 ，為此本研究重點(diǎn)探討 LOX3 在鮮切芋頭褐變中的作用。LOX3 基因CDS 長 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，以cDNA為模板擴(kuò)增到1條大于2000bp的DNA片段（圖3-A）。將該DNA片段切膠回收，連接至pUCm-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)繁重組質(zhì)粒。如圖3-B所示，以重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增到1條約 3 000bp 大小的DNA條帶，說明克隆產(chǎn)物已成功連接至pUCm-T載體，挑選單克隆陽性菌落測序鑒定。

2.4芋頭LOX3蛋白序列特性分析

芋頭LOX3分子質(zhì)量為 110. 31ku ，理論等電點(diǎn)為6.36。序列中有116個(gè)氨基酸帶正電荷，124個(gè)氨基酸帶負(fù)電荷。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為52.77，是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為77.80，親水性平均值為一0.34。芋頭LOX3蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)，說明其可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

芋頭LOX3蛋白序列中含有一個(gè)脂氧合酶（lipoxygenase）保守域（圖4-A），表明芋頭LOX3屬于脂氧合酶大家族。序列一致性分析結(jié)果顯示（表2），芋頭LOX3蛋白與同屬于天南星科的浮萍（Spirodelaintermedia）SiLOX3的序列一致性最高 75.73% 。與擬南芥、煙草和番茄LOX3的氨基酸序列一致性也較高，相似性為 63.23% ＼～65.28% （表2）。盡管芋頭LOX3與其他植物L(fēng)OX3

A. 20°C 貯藏期間的外觀變化；B.4℃貯藏期間的外觀變化； C.20^°C 和 4^°C 期間 b^* 值的變化趨勢 A. Appearance changes during storage at 20^°C ; B. Appearance changes during storage at 4°C ; C. Trends in b^* values during storage at and 4^°C （204

A.以芋頭cDNA為模板擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物電泳圖;B.以重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳圖；M.DNA marker; 1～5 .PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物；黑色箭頭指示LOX3產(chǎn)物位置 A.ElectrophoreticmapofPCRproductsamplifiedusingtarocDNAasatemplate；B.Electrophoresis mapofPCR productsamplified using recombinant plasmids as templates；M.DNA marker; 1-5 PCR amplification products；The black arrow indicates the position of LOX3 products

Fig.3Electrophoresisi map of full length of taro LOX3 gene from taro amplified by PCR

Fig.4Conserved domain and multiple sequence alignment of taro LOX3 protein蛋白序列的相似性較高，但芋頭LOX3序列的N端比其他植物多74個(gè)氨基酸殘基（圖4-B），暗示芋頭LOX3除脂氧合酶保守功能外可能還具有其他方面的功能。

為從系統(tǒng)發(fā)育角度分析芋頭LOX3的潛在功能，構(gòu)建了芋頭LOX3與擬南芥LOX家族的系統(tǒng)發(fā)育樹。擬南芥LOX家族共包含6個(gè)成員[26]，且親緣關(guān)系均較近。其中，芋頭LOX3與擬南芥LOX3和LOX4聚在同一分支，親緣關(guān)系最近（圖5）。

2.5LOX3表達(dá)與鮮切芋頭褐變的相關(guān)性

在4 °C 貯藏期間，鮮切芋頭褐變指數(shù)（browningindex，BI）逐漸增加。與Od相比，經(jīng)過 12d 貯藏BI增加 66.47% （圖6-A）。 LOX3 表達(dá)量在0d到3d時(shí)急劇增加，表明切分處理誘導(dǎo)其表達(dá)。與0d相比，12d的 LOX3 表達(dá)量增加10.41倍（圖6-B）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示（圖6-C， LOX3 表達(dá)與BI具有明顯正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.73。

與BI增加趨勢相似，LOX活性也在低溫貯藏期間逐漸增加，從。d的 207.64U/kg 增加到12d的 314. 58U/kg ，增加 51.51% （圖6-D）。LOX活性與LOX3表達(dá)的相關(guān)性系數(shù)為0.73（圖6-E），說明 LOX3 表達(dá)可能是引起LOX活性增加的重要原因。MDA含量從0d的47.95μmol/kg 增加到12d的 92. 64μmol/kg ，增加93.21% （圖6-F），表明在褐變期間鮮切芋頭的膜脂過氧化程度不斷加重。

2.6對LOX3表達(dá)和LOX活性的影響

外源CA和VA處理可有效抑制鮮切芋頭褐變[22]。為進(jìn)一步明確LOX3 表達(dá)與鮮切芋頭褐變的相關(guān)性，分析了CA和VA處理對LOX3表達(dá)、LOX活性和MDA含量的影響。如圖7所示，外源CA和VA處理顯著下調(diào)LOX3表達(dá)，降低LOX活性和MDA含量。表明抑制LOX3表達(dá)可降低LOX活性，緩解鮮切芋頭膜脂過氧化。

2.7芋頭LOX3基因啟動子分析

啟動子是直接調(diào)控靶基因表達(dá)的重要調(diào)控元件，能通過識別環(huán)境信號因子激活或抑制靶基因表達(dá)[25]。去皮、鮮切等切分處理屬于機(jī)械損傷，由于 LOX3 表達(dá)量在鮮切后顯著增加，推測其可能通過啟動子中的順式作用元件響應(yīng)機(jī)械傷信號。因此，分析了LOX3啟動子序列中的順式作用元件。

結(jié)果顯示（表3），LOX3啟動子序列中含有CAAT-box和TATA-box等核心元件，證明該序列符合啟動子基本特性。LOX3啟動子中含有2個(gè)傷信號響應(yīng)元件（WUN），還含有許多激素響應(yīng)元件（圖8），比如3個(gè)脫落酸（abscisicacid，

ABA）響應(yīng)元件（ABRE）、3個(gè)茉莉酸甲酯（Me-JA）響應(yīng)元件（CGTCA-motif）和1個(gè)生長素（auxin，AUX）響應(yīng)元件（TGA），表明LOX3表達(dá)可能受植物激素調(diào)控。含有3個(gè)厭氧誘導(dǎo)元件（ARE）和大量的光響應(yīng)元件（表3）。除上述元件外，在LOX3啟動子中還發(fā)現(xiàn)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，如3個(gè)MYC和2個(gè)WRKY位點(diǎn)，說明LOX3 表達(dá)受MYC等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控（圖8）。

3討論

本研究的結(jié)果顯示，貯藏溫度越低，鮮切芋頭的褐變進(jìn)程越慢，說明低溫貯藏能有效延緩鮮切芋頭褐變。但即使貯藏在 4^°C 的低溫條件下，褐變?nèi)詴l(fā)展。因此，探討低溫貯藏條件下的褐變發(fā)生機(jī)制，對安全高效的抗褐變保鮮技術(shù)研發(fā)具有重要意義。近幾年的研究表明，細(xì)胞膜脂過氧化是加速鮮切果蔬褐變的重要原因，LOX能與細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生加氧反應(yīng)，形成氫過氧化物，導(dǎo)致膜脂過氧化[26-27]。MDA是反映膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)，MDA含量通常與細(xì)胞膜脂過氧化程度正相關(guān)[28]。本研究中，LOX活性和MDA含量隨BI增加而增加，CA和VA處理顯著抑制LOX活性增加，降低MDA含量和BI，表明細(xì)胞膜脂過氧化是促進(jìn)鮮切芋頭褐變的重要原因。

為鑒定促進(jìn)鮮切芋頭褐變的主效LOX基因，利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析了芋頭LOX家族基因在褐變過程中的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LOX3 和LOX6的表達(dá)在鮮切芋頭褐變過程中顯著增加，前期已證明LOX6表達(dá)與鮮切芋頭褐變密切相關(guān)[29]。為此，本研究重點(diǎn)探究LOX3 在鮮切芋頭褐變中的作用。芋頭LOX3氨基酸序列中含有脂氧合酶保守結(jié)構(gòu)域，表明芋頭LOX3屬于脂氧合酶家族。擬南芥AtLOX1參與脂質(zhì)氧化代謝，沉默AtLOX1能降低擬南芥的單線態(tài)氧（204號 （¹O₂"）含量[30]。在4個(gè)擬南芥LOX基因（AtLOX2、AtLOX3、AtLOX4和 AtLOX6 ）中，AtLOX4 對 a -亞麻酸的氧化作用最強(qiáng)[31]。芋頭LOX3與AtLOX4蛋白聚在同一分支，與擬南芥LOX家族其他成員的親緣關(guān)系也很近，與模式植物L(fēng)OX3的序列一致性很高，表明植物L(fēng)OX3催化脂肪酸氧化的功能高度保守。芋頭LOX3表達(dá)隨褐變增加，表達(dá)模式與褐變進(jìn)程具有明顯正相關(guān)性，CA和VA處理顯著下調(diào) LOX3 表達(dá)，表明 LOX3 表達(dá)上調(diào)可能是引起鮮切芋頭褐變的重要原因。

Fig.8Distribution of stress response elements in promoter of taro LOX3 gene

LOX表達(dá)上調(diào)是植物響應(yīng)非生物脅迫的重要機(jī)制，逆境脅迫尤其機(jī)械傷脅迫通常會誘導(dǎo)植物L(fēng)OX家族基因的表達(dá)[14]。采后黃瓜中機(jī)械損傷會顯著誘導(dǎo)LOXmRNAs積累，并伴隨LOX活性增加[32]。在受到機(jī)械損傷影響的水稻 （Ory^- za sativa）葉片中， LOX 表達(dá)和酶活性明顯高于正常葉片，LOX活性增加會激活膜脂過氧化反應(yīng)[33]。在馬鈴薯中，機(jī)械傷處理后觀察到許多LOX基因及同源基因表達(dá)上調(diào)[33]。同時(shí)，LOX還是催化合成JA的關(guān)鍵酶，JA信號對LOX表達(dá)具有反饋調(diào)節(jié)作用[15，34]。本研究中，芋頭LOX3表達(dá)在鮮切處理后顯著上調(diào)，且啟動子序列中含有傷信號、ABA和JA響應(yīng)元件，表明LOX3 通過啟動子中的響應(yīng)元件識別切分處理產(chǎn)生的傷信號，進(jìn)而誘導(dǎo)其表達(dá)。LOX催化合成的JA反過來能通過JA響應(yīng)元件增強(qiáng)其表達(dá)，這可能是 基因在整個(gè)低溫貯藏期間持續(xù)表達(dá)的重要原因。此外，芋頭LOX3啟動子中有多個(gè)MYB、MYC和WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在草莓成熟過程中，F(xiàn)aMYB11可直接與FaLOX5啟動子結(jié)合激活其表達(dá)，從而促進(jìn)脂基揮發(fā)性化合物的合成[35]。翻譯后激活和染色質(zhì)免疫沉淀分析結(jié)果顯示，煙草NtMYB12a能直接促進(jìn)Nt-LOX6 和NtLOX5的表達(dá)[36]。這些結(jié)果說明芋頭LOX3表達(dá)可能還受MYB等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，但具體哪些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控LOX3表達(dá)，值得深人研究。

4結(jié)論

本研究在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，從鮮切芋頭中克隆LOX3全長序列，探究其表達(dá)與鮮切芋頭褐變的相關(guān)性。芋頭LOX3蛋白序列中含有脂氧合酶保守域，與其他植物L(fēng)OX的親緣關(guān)系和序列一致性較高，表明植物L(fēng)OX3具有相對保守的生物學(xué)功能。 LOX3 啟動子中含有傷信號元件和多個(gè)逆境相關(guān)元件，表明切分處理能通過逆境響應(yīng)元件激活其表達(dá)。LOX3表達(dá)與LOX活性和BI間具有明顯正相關(guān)性，CA和VA處理顯著抑制 LOX3 表達(dá)，降低LOX活性和MDA含量，表明LOX3表達(dá)可能是引起鮮切芋頭褐變的重要原因?？傊狙芯棵鞔_了LOX3表達(dá)與鮮切芋頭褐變的相關(guān)性，為芋頭新品種創(chuàng)制提供了重要候選基因。

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Cloning of LOX3 Gene Encoding Lipoxygenase and Its Potential Roles in Browning of Fresh-cut Taro

LIN Wei1 ，WANG Bin1'2，XIE Jing1and LUO Tao3

（1.Guangdong ProvincialKeyLaboratoryof UtilizationandConservationofFoodand Medicinal Resources in Northern

Region/Collge of Biology and Agriculture，Shaoguan University，Shaoguan Guangdong5120o5，China;2.Guangdong

Provincial Engineering and TechnologyResearchCenterof SpecialFruitandVegetablesinNorthernRegion/Engineering and Technology Research Centerof Shaoguan Horticulture，Shaoguan University，Shaoguan Guangdong512005， China；3.Guangdong Province Key Laboratory of Postharvest Science of Fruitsand Vegetables/Collge of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou51o642，China）

Abstract To identify the key LOX genes regulating the browning of fresh-cut taro，this study compared the effects of storage temperatures on the browning of fresh-cut taro and analyzed the expression patterns of LOX family genes during the browning based on transcriptomic data. The results showed that the b^* values on the cut-surface of fresh-cut taro rapidly increased during storage at 20 ^°C .After 24 hours of storage at ，the commercial values of fresh-cut taro were almost lost.Cold storage at 4^°C could effectively delay the increase in b^* values，but the browning of fresh-cut taro continued to develope. Based on transcriptomic data，a total of 17 gene members from taro LOX family were identified in fresh-cut taro，with the expression level of LOX3 significantly increased after cutting as well as during cold storage. These results suggested that the upregulated LOX3 expression might be closely related to taro browning. Therefore，the coding sequence （CDS） of LOX3 gene was cloned from fresh-cut taro through the RT-PCR method. The CDS of taro LOX3 was 2958bp ，encoding a protein containing 985 amino acid residues. The LOX3 promoter sequence contained two wound signaling elements and abundant stress related elements.Moreover，the LOX activity and malondialdehyde （MDA）content significantly increased as the browning index （BI） increased. There was a positive correlation between LOX3 expression and LOX activity as well as BI. In addition，exogenous cinnamic acid and vanillic acid treatments significantly downregulated LOX3 expression，delayed the increase in LOX activity and MDA contents.In summary，the expression of LOX3 is closely related to the browning of fresh-cut taro，and the upregulated expresson induced by cutting may be an important reason for browning occurrence of fresh-cut taro under cold conditions.

Key wordsFresh-cut taro; Postharvest storage; Cut-surface browning;Lipoxygenase; Gene cloning

Received 2024-06-12 Returned 2024-09-11

Foundation item Guangdong Provincial Key Laboratory of Utilization and Conservation of Food and Medicinal Resources in Northern Region （No. FMR2023004M） and Guangdong Provincial Department of Education’s Provincial University Student Innovation and Entrepreneurship Training Program （No.S202410576028）.

First authorLIN Wei，female，undergraduate. Research area： storage and freshness preservation of postharvest fruit and vegetables. E-mail：1448053435@qq. com

Corresponding authorWANG Bin，male，Ph.D，associate professor. Research area：biology of postharvest fruit and vegetables. E-mail：b_wang@sgu. edu. cn

LUO Tao，male，Ph.D，associate professor. Research area： molecular biology of postharvest fruit and vegetables. E-mail：luotao0502@scau. edu. cn

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsibleeditor：GUYulan）