基于SSR標記的197份谷子遺傳多樣性分析

谷子是起源于中國的傳統(tǒng)特色作物，其馴化栽培歷史可追溯到16000年前，屬于人類最早馴化栽培的禾谷類作物之一[]。谷子抗旱、耐瘠薄、穩(wěn)產且營養(yǎng)豐富[2]，一直是中國北方的主要糧食作物[3-4]，更是中國旱作生態(tài)農業(yè)的重要支柱作物[5]。隨著中國種業(yè)發(fā)展，谷子種質資源收集鑒定評價、品種育繁推也成為谷子產業(yè)發(fā)展的重點研究方向之一。中國擁有28000余份谷子種質資源[]，居世界第一位，解析其遺傳多樣性、遺傳分化和遺傳關系是種質資源遺傳改良、雜交育種以及創(chuàng)新利用的關鍵[7-9]。近些年，由于國家提出的一系列“種業(yè)振興行動方案”，種質資源遺傳多樣性的研究成為遺傳學家備受關注的方向。因此，如何高效衡量遺傳變異也是該研究領域的熱點問題[10]。目前，研究遺傳多樣性的人有很多，研究谷子遺傳多樣性的也多見報道[11-14]。采用的標記技術也從形態(tài)學標記等發(fā)展為SSR（simplesequencerepeat）、AFLP（amplified fragmentlength polymorphism）和 SNP（single nucleotidepolymorphism）等分子標記。SSR分子標記技術是共顯性標記，可以鑒別出雜合子和純合子，試驗操作簡單、重復性好、結果可靠[15]。秦嶺等[16]通過對20世紀80年代以來代表華北夏谷區(qū)的20個主栽谷子品種進行SSR標記多態(tài)性分析，結果表明華北夏谷區(qū)谷子品種遺傳多樣性較低，遺傳基礎狹窄。丁銀燈等[17]對國內外124 份谷子種質資源的表型鑒定以及SSR遺傳多樣性分析表明，表型性狀及SSR聚類分析均存在明顯的地理聚類特征，結合表型性狀鑒定出12份適宜新疆種植的谷子優(yōu)異種質。楊慧卿等[18]利用谷子SNP和SSR共77個標記對68份谷子分種質進行了遺傳多樣性分析，結果揭示68份谷子分蘗種質遺傳多樣性較好，為分蘗基因或數(shù)量性狀位點（quantitativetraitloci，QTL）挖掘奠定基礎。Kim等[19]利用28對引物對37份來自中國、韓國和巴基斯坦的谷子資源進行遺傳多樣性分析，其結果證明了谷子起源于中國這一結論。Pandey等[20]通過全基因組測序設計了21294個SSR引物，在8份狗尾草屬材料中成功驗證了約159個標記，多態(tài)性潛力約為 67% ，并對15573個谷子微衛(wèi)星標記與高梁 （16.9% ）、玉米 （14.5% ）和水稻 （6.4% ）的定位數(shù)據(jù)進行了計算機比對，結果表明谷子與目標種染色體之間存在同源關系，這為谷子等禾谷類作物在種質鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳連鎖圖譜構建、基因或數(shù)量性狀位點發(fā)現(xiàn)、比較定位等方面提供了理論依據(jù)。本研究通過對197份來自國內外的谷子地方農家種、育成品種（系）進行SSR分子標記多樣性分析，從多態(tài)性分析、分子方差分析、群體遺傳分化及基因流、群體遺傳關系等方面系統(tǒng)研究了197份谷子種質之間的遺傳多樣性和遺傳分化，為今后品種改良和選育、親本選擇、雜交組配等提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為197份來自國內外的地方農家種、育成品種（系）。國內品種196份，其中北京市5個、甘肅省4個、廣東省1個、貴州省1個、海南省1個、河北省29個、河南省2個、黑龍江省15個、湖南省1個、吉林省5個、遼寧省7個、內蒙古自治區(qū)83個、山東省7個、山西省31個、陜西省3個以及國家種質資源庫1個品種（系）；國外品種1份，為日本的1個品種，詳見表1。

1.2 DNA提取

將參試材料種子在室內進行培養(yǎng)，四葉一心時剪取適量葉片放入 1.5mL 離心管中， -80^°C 超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩２捎迷噭┖校ㄌ旄邢薰荆┨崛』蚪MDNA，用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度，并配制 100μL 使用液， 4^°C 保存。

1.3 SSR引物

研究所用的12對多態(tài)性高、擴增效果好、條帶差異明顯的SSR引物序列是從100對引物中篩選出來的，由擎科生物科技有限公司合成（表2）。

1.4 PCR擴增及電泳檢測

采用PCR儀（型號：XPcycle，制造商：杭州BIOER）進行擴增。PCR反應體系為 10μL ，其中包括 2× Taq PCR Master Mix 5 μL 、DNA（濃度 20～50ng/μL ） 1μL 、上下游引物（濃度10μmol/L） 各 1μL ，最后加 2μLddH₂O 補足至10μL 。用于PCR擴增的程序： 95°C 預變性 2min 94^°C 變性 40s，56^°C 退火 45s，72^°C 延伸 1min 共29個循環(huán)； 72°C 徹底延伸 7min 。PCR擴增產物用 8% PAGE膠進行檢測， 180V，400mA 電泳 1.5h ，電泳結束后銀染檢測。

1.5 SSR分析與統(tǒng)計分析

利用 GenAlEx 6.51 軟件和Powermarker3.25軟件計算單個SSR位點在樣本整體的等位基因數(shù)（numberofalleles， N_a ）、有效等位基因數(shù)（numberof effectivealleles， N_e ）、Shannon's多樣性指數(shù)（Shannon’sinformation index，I）、觀測雜合度（observed heterozygosity， H_o ）、期望雜合度（expected heterozygosity， H_e ）、近交系數(shù)（inbreedingcoefficient， F_is ）、遺傳分化指數(shù)（coef-ficient of genetic differentiation， F_st ）、多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）等遺傳多樣性指數(shù)。利用 _GenAlEx6.51 軟件進行分子方差分析（molecularvarianceanaly-sis，AMOVA），利用 _GenAlEx6.51 軟件計算遺傳距離矩陣 PCoA（principal coordinates analy-sis）分析，使用軟件Ntsys2.1O中Qualitativeda-ta功能計算Jaccard遺傳相似系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性分析

12對SSR引物在197份谷子種質中均表現(xiàn)多態(tài)性，共檢測到173個等位基因 （N_a ），平均每對引物檢測出14.417個，變化范圍 2～29 個，M22標記檢測出的等位變異最少（2個），M86標記的等位變異最多（29個）；有效等位基因數(shù)（N_e 變化范圍在 1.081～10.237 ，有效等位基因變異占比 33.94% ;Shannon's多樣性指數(shù)（I）范圍在 0.206～2.631 ，平均為1.621，其中7對引物達到1.5以上；期望雜合度 （H_e ）變化范圍為0.075～0.902 ，平均為 0.652（H_egt;0.5） ，提示供試材料遺傳多樣性較高；觀測雜合度 （H_o ）變化范圍為 0. 000～0. 945 ，平均為0.148，僅1個引物的期望雜合度小于觀測雜合度外，其余引物期望雜合度均大于觀測雜合度，這說明供試種質內雜合子過?，F(xiàn)象少；PIC值變化范圍在 0. 073～ 0.895，平均為0.628，周于波等[21]根據(jù)Botstein等對高、中、低度多態(tài)性位點的劃分，PIC值平均值具有中度多態(tài)性 （0.250.5），3 對引物為中度多態(tài)性 （0.25lt; PIClt;0.5）.1 對引物多態(tài)性低。

本研究中高PIC值的引物占 66.7% ，表明這些SSR位點可從分子水平解釋基因型差異，具有豐富的遺傳差異性（表3）。

2.2 分子方差分析

利用AMOVA對197份谷子種質的群體遺傳結構進行分析（表4）表明，群體間差異不顯著（ Pgt;0.05） ，變異百分率為 12.0% ；群體內表現(xiàn)顯著差異性（ ?Plt;0.001 ，變異百分率達 88.0% 。說明197份谷子種質的種群內的遺傳變異是其總體變異的主要來源。

2.3群體遺傳分化及基因流

近交系數(shù) （F_is ）揭示群體間總樣本雜合基因型缺失或過剩狀態(tài)。近交指數(shù)為 （-0.271）～1.000，平均為0.774，1個位點（M45）的雜合基因過剩，群體平均雜合度較高，表明谷子材料有近交現(xiàn)象；遺傳分化指數(shù) （F_st ）為 0. 034～0. 756 ，均值為0.141，表明群體間遺傳分化 （14.1% 低于群體內的遺傳分化 （85.9% ）；197份谷子種質群體基因流（geneflow， N_m ）為 0.080～7.190 ，均值為3.462，表明群體間存在廣泛的基因交流（表5）。

2.4群體的遺傳關系

根據(jù)12對SSR引物擴增結果，計算197份谷子種質間的遺傳相似系數(shù)，其變化范圍為0.838 2～1.000 0 ，平均值為0.9052。其中來自山西省大同市的millet-4‘大同29’與貴州的mil-let-106‘黔南農家種’、山西省大同市的millet-4‘大同29’與山西省太原市millet-112的‘噸谷’、內蒙古自治區(qū)赤峰市的millet-6‘黃金苗'與海南?？诘膍illet-105‘黃殼狗尾粟（糯粟）、山西省大同市的millet-70‘晉谷23’與貴州的millet-106‘黔南農家種'遺傳相似系數(shù)最低（0.8382）；來自內蒙古自治區(qū)呼和浩特市的自有品系millet-41‘蒙21-3-23’與millet-42‘蒙21-L5021’、河北省石家莊市的millet-149‘冀谷168'與河北省石家莊市的millet-162‘冀雜金苗2號遺傳相似系數(shù)最高（1.0000）。

197份谷子種質間的遺傳距離，其變化范圍為 0.000 0～1.000 0 ，平均值為0.6851。其中來自內蒙古自治區(qū)呼和浩特市的自有品系millet-41‘蒙21-3-23’與millet-42‘蒙21-L5021’、河北省石家莊市的millet-149‘冀谷 ₁₆₈? 與河北省石家莊市的millet-162‘冀雜金苗2號'遺傳距離最?。?.0000）；有47對谷子種質之間的遺傳距離最大（1.0000），如表6所示。

2.5 二維主坐標分析（PCoA）

利用GenALEX（6.51b2）軟件計算遺傳距離矩陣，基于GD矩陣進行二維主坐標分析，并繪制主坐標1和主坐標2的PCoA散點圖，按照散點的密集性以及品種來源，將197份谷子種質分為4大類：第一亞群（A）包括38份谷子種質；第二亞群（B）包括14份谷子種質；第三亞群（C）包括85份谷子種質；第四亞群（D）包括60份谷子種質。其中，第四亞群為混合亞群，包括第一亞群、第二亞群和第三亞群的部分種質，說明各亞群之間可能存在基因交流。第一主成分和第二主成分分別可以解釋總變量的 23.08% 和 20.33% （圖1）。主成分分析結果表明，地理位置相近的群體并沒有被優(yōu)先聚為一類，說明各品種（系）的遺傳差異性與地區(qū)之間的關系可能沒有相關性。

3討論

遺傳多樣性是衡量物種適應環(huán)境變化能力的重要指標[13]。SSR 遺傳多樣性分析能直觀地從DNA水平上反映出生物的多樣性[22]。Shannon's多樣性指數(shù)是衡量植物遺傳多樣性重要指標之_[23]。呂建珍等[1]對 175 份來源不同的谷子品種進行36對簡單序列重復（SSR）標記分析，結果表明Shannon's多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量（PIC）平均為2.0172和0.8106，且不同生態(tài)區(qū)中汾陽的SSR標記Shannon’s多樣性指數(shù)最高。秦嶺等[16]通過49對引物在20個谷子品種中擴增出142個等位變異，多態(tài)性信息含量（PIC）變幅為 0. 0904～0. 6896 ，平均為0.4168。李劍峰等[24通過連續(xù)2年在吉林省吉林市和公主嶺市、河南省洛陽市、海南省樂東縣調查102份谷子資源的主要農藝性狀和采用70個多態(tài)性SSR標記對谷子資源進行基因型鑒定，結果發(fā)現(xiàn)除了千粒重，其余9個性狀間在4個地理環(huán)境普遍存在顯著或極顯著正相關，70對SSR引物共檢測到397個等位基因，SSR標記的Shannon's多樣性指數(shù)變幅為 0.439～1.118 ，平均為0.7738。本研究選用的100對SSR引物對30份來源不同的谷子種質進行擴增，其中有12對引物在30份來源不同的谷子種質中擴增的多態(tài)性條帶豐富。12對有多態(tài)性的引物在197份谷子種質中共檢測出173個等位變異基因，平均每個位點檢測出的等位變異數(shù)位為14.417個，Shannon's多樣性指數(shù)范圍在 0. 206～2. 631 ，平均為1.621，高于呂建珍等[11]和李劍峰等[24]研究的Shannon's多樣性指數(shù)，說明本研究的197份谷子種質資源的遺傳多樣性豐富。但是本試驗利用的引物數(shù)量太少，多態(tài)性位點覆蓋度低，有待進一步擴大引物數(shù)量，提高多態(tài)性位點的覆蓋度。

群體間 F_st 與 N_m 是衡量種群間遺傳差異的重要指標[25]。任重等[26]研究時參考Wright的建議，群體間遺傳分化指數(shù) （F_st） 可評估群體遺傳分化水平：弱， F_stlt;0. 05 ；中等， 0. 05stlt; 0.15；高， 0.15stlt;0.25 ；極高， F_stgt;0.25 。本研究中遺傳分化指數(shù) （F_st） 為 0. 034～0. 756 ，均值為0.141，群體間存在中等程度的遺傳分化；分子方差AMOVA分析顯示品種（系）群體內的遺傳變異占變異總量的 88% ，群體間 12% ，均揭示遺傳變異主要來源于群體內部。較高的基因流（N_m=3.462） 可能是引起谷子種質資源產生中等遺傳分化的一個原因。雖然谷子是自花授粉作物，但是谷子也存在一定的天然異交率，本研究的197份谷子種質資源雖然來自不同的生態(tài)區(qū)，但是有很大一部分品種（系）均來源于同一親本，親緣關系較近。本研究主要利用SSR分子標記從基因水平反映谷子的遺傳多樣性，下一步將結合表型和生化品質成分進行更加深人的鑒定和評價，以便更加準確地了解197份谷子種質資源的多樣性分布，充分利用遺傳距離較遠的種質資源，進一步提高谷子育種工作效率[27-28]。

4結論

197份谷子種質具有較高的遺傳多樣性，并且12對引物中有8對引物具有高度多態(tài)性（PICgt;0.5） 。AMOVA分析表明197份谷子種質的群體內的遺傳變異是其總體變異的主要來源，且群體間存在廣泛的基因交流；遺傳相似系數(shù)、遺傳距離和主成分分析也表明，地理位置相近的群體并沒有被優(yōu)先聚為一類。

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Genetic Diversity Analysis of 197Foxtail Millet Accessions Based on SSR Markers

WEN Rui， ZHAO Yajie， JIA Yiming， JIN Xiaolei and ZHANG Yonghu （InnerMongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，HohhotOloo31，China）

Abstract This study aims to analyze the genetic diversity of 197 foxtail millet germplasms，in order to expand the utilization of foxtail millet germplasms and to accelerate the breeding process.12 pairs of primers were used to test the molecular markers of 197 millet germplasm resources.The genetic diversity，population structure，genetic differentiation，and genetic relationship of milet germplasm resources were analyzed. A total of 173 alleles（ （N_a ）were detected by 12 SSR primers in 197 millet germplasms，with an average of 14.417 alleles per primer. The average Shannon’s information index （I） was 1.621，of which7 pairs of primers reached more than 1.5.The average PIC was 0.628，and 8 pairs of primers were highly polymorphic （ ΔPICgt;Δ0. 5） . Molecular variance analysis （AMOVA） showed that the inter-population variation of 197 foxtail millet germplasms was 12.0% ，while the intra-population variation was 88.0% . The genetic differentiation index among populations was between 0.034 and O.756，with an average of O.141.PCoA analysis divided the 197 foxtail millt germplasms into four categories. The first principal component and the second principal component can explain 23.08% and 20.33% of the total variables，respectively. The selected 12 pairs of primers well reflect the genetic diversity of millet germplasms （ PICgt;0. 5 .There are moderate genetic differentiation （F_st=0.141 ） and extensive gene flow （ ΔN_m=3.462 ）among the 197 millet populations.

Key wordsFoxtail millet；Simple-sequence-repeat （SSR）markers；Genetic diversity； Genetic differ entiation;Gene flow

Received 2024-09-24 Returned 2024-11-13

Foundation item Ministry of Finance and Ministry of Agriculture and Rural Affairs-China Agriculture Research System（No. CARS-06-14. 5-B11）； Inner Mongolia Science and Technology Program Project （No.2021GG0375）.

First author WEN Rui， female，assistant research fellow.Research area：foxtail millet breeding and cultivation.E-mail：15848120452@163.com

Corresponding authorZHANG Yonghu， male，Ph.D，associate research fellow.Research area： foxtail millet breeding and cultivation. E-mail： zhangyonghu0815@126.com

（責任編輯：成 敏，陳婷婷 Responsible editor：CHENG Min，CHEN Tingting）