鹽酸可樂定單克隆抗體的制備及免疫層析試紙的研制

鹽酸可樂定（Clonidinehydrochloride，CLO）是一種中樞神經系統(tǒng)腎上腺素 α₂ -受體激動劑，常作為抗高血壓藥物[1-2]。CLO主要通過刺激腦干α₂ -腎上腺素受體導致交感神經從中樞神經系統(tǒng)的傳出減少，從而降低外周阻力、腎血管阻力、心率以及血壓，也有用于手術后的麻醉和鎮(zhèn)痛[3-4]。有研究表明CLO具有改善胴體品質的作用，動物試驗結果顯示在豬飼糧中添加 0.5mg/kg 的CLO，能顯著提高豬的瘦肉率和眼肌面積，降低脂肪比率和背膘厚，推斷其主要的作用機理為通過促進下丘腦生長激素釋放激素神經元合成和釋放生長激素釋放激素，進而調節(jié)生長激素分泌，促進動物生長[5]。但是，在動物組織中累積的CLO殘留可能造成食物中毒，對人體消化道、心血管和神經系統(tǒng)造成影響，引起頭暈、乏力、嗜睡、惡心、嘔吐以及神經癥狀等[6]。2010年12月，原農業(yè)部1519號公告已明確將CLO列人了《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質》清單[7]。因此，加強對CLO殘留的檢測方法研究尤為必要。

目前，用于CLO殘留檢測的方法主要有高效液相色譜法（High performance liquid chroma-tography，HPLC）[8]、高效液相色譜－串聯(lián)質譜法（High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[9-10]等。然而這些方法的樣品前處理較為繁瑣，操作較為耗時，對儀器設備要求較高，對檢測效率產生較大影響?？乖c抗體特異性結合的酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）因其簡單、快速、價格低廉等優(yōu)點，已被廣泛應用于農獸藥殘留及畜禽疫病的監(jiān)控檢測[1-12]。在此基礎上發(fā)展起來的免疫層析試紙（Immunochromatographicstrip，ICS）可在短時間內（ 10min 左右）得到結果，更適合大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測。但目前針對CLO殘留檢測的ICS研究仍較為缺乏。本研究在制備CLO鼠源單克隆抗體（Monoclonalantibody，mAb）的基礎上，基于競爭模式研制檢測CLO的ICS方法，為高效監(jiān)控CLO殘留提供有力技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與耗材CLO、苯乙醇胺A（PhenylethanolamineA，PA）、沙丁胺醇（Salbu-tamol，SAL）鹽酸克倫特羅（Clenbuterolhydro-chloride，CL）、萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）、弗氏完全佐劑（Freund’s completeadjuvant，F(xiàn)CA）、弗氏不完全佐劑（Freund’sincompleteadjuvant，F(xiàn)IA）、牛血清白蛋白（Bovine serum al-bumin，BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）、PEG-1500、鼠源mAb 亞型鑒定試劑盒均為 Sig-ma公司產品；鹽酸阿可樂定（Apraclonidinehydrochloride，ACLO）購自中國食品藥品鑒定研究所；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG（Goatantimouse IgG-HRP， GaMIgG^-HRP， 為武漢艾美捷科技公司產品；HAT 培養(yǎng)基（HAT media sup-plement （ 50×） Hybri-Max）、HT培養(yǎng)基（HTmedia supplement（ 50×） Hybri-Max），葡萄球菌凝集素A（Staphylococal protein A，SPA）為美國Thermofisher公司產品;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自北京全式金生物技術有限公司；無血清細胞凍存液購自蘇州新賽美生物科技有限公司；其他試劑均為市售分析純及以上。包被液（CBS， pH9.6 的0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液）、稀釋液（PBS， pH7.4 的0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液）、洗滌液（PBST，含0.5% 吐溫-2O的PBS溶液）、封閉液（含 5% 脫脂奶的PBST溶液）、顯色液（TMB）；終止液L ?2mol/L 的稀硫酸）由實驗室配制。硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC）膜、吸水墊、聚苯乙烯硬板和玻璃纖維紙購自上海金標生物有限公司。

1.1.2主要儀器DYY-6C電泳儀，大連杰邁科技有限公司； H1650R 臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；MultiskanFC酶標儀，3111型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國ThermoFisherScientific公司;ChemiDocXRS + 化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；TSR3000讀條儀，美國Bio-Dot公司；三維劃膜噴金儀，上海金標生物有限公司。

1.1.3試驗動物和瘤細胞6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，小鼠SP2/O骨髓瘤細胞由河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室提供。

1.2 方法

1.乙.1CLU干兄座抗體時制奮及金定CLU分子質量較小，沒有免疫原性。因此，需要通過與蛋白載體偶聯(lián)形成大分子復合物才能刺激機體產生相應的免疫應答反應。但CLO的分子結構中缺乏能夠與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團，無法與載體蛋白進行偶聯(lián)。CLO的衍生物ACLO與其結構相似，苯環(huán)上的氨基為偶聯(lián)載體蛋白制備人工抗原提供了活性基團（圖1）。因此，本研究將ACLO作為半抗原，采用重氮化法將ACLO分別與載體蛋白BSA 和OVA 偶聯(lián)[13]，制備免疫原CLO-BSA和包被原CLO-OVA。將CLO-BSA以 0. 15μg/200μL 的劑量免疫4只BALB/c小鼠，共免疫4次，每次間隔21d，首次免疫將CLO-BSA與FCA等體積乳化，后3次加強免疫將FCA替換為FIA。采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（IndirectELISA，i-ELISA）和間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（Indirect competitive ELISA，ic-ELISA）對免疫后的小鼠血清進行檢測[14]。i-ELISA 測定血清抗體效價簡要操作如下：用CBS將包被原CLO-OVA 稀釋為 1μg/mL ，每孔 100μL 包被于酶標板中，再用封閉液封閉；檢測血清時，每孔加入 100μL 倍比稀釋的多抗血清并以PBS 為空白對照， 孵育 15min 后洗板；然后每孔加入100μL 用封閉液稀釋的 GaMIgG-HRP，37^°C 孵育 30min 后洗板；最后每孔加入 100μL 顯色液，10min 后加入終止液終止顯色；用酶標儀讀取各孔 OD_450nm 值，判定 OD_450nm 值大于0.2且大于空白孔 OD_450nm 值2.1倍的孔為陽性，以陽性孔對應的最大稀釋倍數(shù)作為血清效價。ic-ELISA鑒定敏感性的簡要操作如下：將不同質量濃度的CLO標準溶液以每孔 100μL 加入CLO-OVA包被的酶標板中，并以PBS為對照，再加入等體積的稀釋血清， 孵育 15min 后洗板，后續(xù)操作同上述效價測定；以抑制率 B/B₀ （B為CLO標準溶液孔 OD_450nm 值， B₀ 為對照孔 OD_450nm 值）為縱坐標、CLO質量濃度對數(shù)值為橫坐標繪制曲線，計算半數(shù)抑制濃度（Half inhibitory concen-tration， IC₅₀ ），以評價血清敏感性。

選擇效價高、敏感性最好的小鼠作為融合對象，將抗原用無菌的PBS 稀釋后，以 0.5μg/μL 的劑量腹腔注射小鼠，進行沖擊免疫，并采用雜交瘤技術制備 CLO-mAb 。取小鼠脾細胞與SP2/O細胞在PEG1500的作用下進行融合，融合10d左右，待雜交瘤細胞長滿細胞培養(yǎng)板孔底的三分之一左右，收集上清液，用i-ELISA和ic-ELISA方法進行檢測，篩選出陽性雜交瘤細胞。通過有限稀釋法對陽性孔細胞進行亞克隆，篩選獲得穩(wěn)定分泌CLO-mAb的陽性單克隆雜交瘤細胞株，細胞株凍存并擴大培養(yǎng)。采用體內誘生腹水法制備腹水，采用辛酸一硫酸銨沉淀法純化腹水中的CLO-mAb并通過SDS-PAGE進行純化效果鑒定[15-16]。對CLO-mAb 的亞型、親和力、敏感性、特異性等免疫學特性進行鑒定，亞型利用鼠源mAb亞型鑒定試劑盒進行鑒定，親和力通過間接ELISA飽和法測定親和常數(shù) （K_m） 進行評價[17]，敏感性和特異性通過ic-ELISA測定 IC₅₀ 和交叉反應率（Crossreactivity，CR）進行評價，其中特異性鑒定利用PA、SAL、CL、RAC等常見受體激動劑藥物作為競爭物，以 IC₅₀ （CLO）/ IC₅₀ （競爭物）計算CR[18]。

1.2.2膠體金溶液的制備及抗體的標記根據(jù)Sun等[19]報道的方法，采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金（Aunanoparticles，AuNPs）溶液， 4^°C 條件下保存，備用，采用透射電鏡（Transmissione-lectronmicroscopy，TEM）對AuNPs進行表征。對AuNPs標記CLO-mAb的條件進行優(yōu)化，包括AuNPs溶液的 ΔpH 和 CLO-mAb 標記量。通過向 AuNPs 溶液中加入不同體積 0.2mol/L 的K₂CO₃ 溶液調節(jié)其 ΔpH 。最佳抗體標記量通過以下試驗確定。首先用雙蒸水（DDW）將CLO-mAb在稀釋杯中進行倍比稀釋，隨后分別加入125μL AuNPs溶液（不同 ，室溫靜置 5min 后，加入 125μL 1% NaCl溶液，根據(jù)AuNPs溶液顏色的變化確定最佳的CLO-mAb標記量，選擇AuNPs溶液將要變灰的孔所對應的抗體量記錄為最佳標記量。

在最佳的 pH 和抗體標記量條件下進行CLO-mAb標記，室溫反應 30min ，然后加人100μL （20 10% BSA溶液，室溫封閉 30min 。最后，

離心 15min ，棄去上清液，重懸于 200μL 的HB緩沖液（含 2% BSA、 4% 蔗糖和 0.02% 疊氮化鈉的硼酸鹽緩沖液）中，并在4^°C 條件下保存。

1.2.3ICS的組裝ICS的結構示意圖如圖 2-a 所示。主要由樣品墊、結合墊、NC膜、吸水墊和底板組成。參照Russo等[20]的方法對樣品墊進行處理。用劃膜噴金儀在結合墊上噴涂金標抗體（AuNPs-mAb），噴涂量為 5μL/cm ，在NC膜上噴涂劃出檢測線（Testline，T線）和質控線（Con-trolline，C線），T線上噴涂CLO-BSA，C線上噴涂SPA，按照樣品墊、結合墊、NC膜、吸水墊的順序組裝好后，用切條機切割成 3mm 寬的試紙，裝八山均衣，主血」一床懷竹。

1.2.4ICS的檢測原理及程序ICS的檢測原理如圖 2-b，2-c 所示，將待測樣品滴在樣品墊上，在虹吸作用下溶液向吸水墊的末端遷移。ICS基于競爭模式，對于陰性樣品（不含CLO），結合墊上的AuNPs-mAb移至T線時會被CLO-BSA捕獲，多余的 AuNPs–mAb 流經C線時被SPA捕獲，T線和C線將出現(xiàn)兩個深紅色帶。對于陽性樣品（含有CLO），樣品中的CLO與T線上的CLO-BSA競爭性結合AuNPs-mAb，T線的顏色會隨著CLO濃度的增加而變淺直至消失。無論樣品中是否含有CLO，C線都應該顯色，否則試紙無效。ICS的檢測時長為 10min ，結果可通過裸眼直接觀察T線顏色進行判定，也可使用讀條儀掃描T線相對光密度值（Relativeopticaldensity，ROD），建立標準曲線計算濃度進行定量。1.2.5ICS的性能評估為評估ICS的視覺檢測靈敏度，將CLO用PBS稀釋為不同濃度的標準溶液用于ICS檢測，同時，也用ICS檢測不同濃度的ACLO標準溶液，將ICS的T線顏色消失的最低濃度作為消線值，根據(jù)消線值高低判斷ICS 對于CLO和ACLO的檢測能力[21]。

在實際樣品檢測中，腎上腺素受體激動劑常用的檢測樣品為豬尿，但豬尿中基質復雜，會對ICS的檢測效果產生較大影響。為消除基質效應，向豬尿中加入適當濃度的陰離子表面活化劑十二烷基硫酸鈉（SDS），并對其添加量進行優(yōu)化，以消除豬尿中基質對檢測結果的干擾。在此基礎上，用豬尿稀釋7個濃度水平（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和 0ng/mL） 的CLO溶液，用ICS分別平行測3次，然后用讀條儀掃描T線ROD值。以抑制率 B/B₀ （B為各濃度ROD值， B₀ 為零濃度ROD值）為縱坐標，CLO質量濃度的對數(shù)值為橫坐標，繪制標準曲線，計算 IC₅₀ 和 10% 抑制濃度（ IC₁₀ ）作為檢測限，用以評估ICS的靈敏度[22]。

最后進行加標回收試驗，將CLO添加至豬尿中，配制3個濃度水平（0.5、1和 ）的樣品，用相同批次的ICS檢測樣品進行批內試驗，用3個不同批次的ICS檢測樣品進行批間試驗，每個ICS平行測3次，根據(jù)加標回收率和變異系數(shù)（Coefficientofvariation，CV）評估ICS的準確度和精密度。

2 結果與分析

2.1 CLO-mAb的制備和鑒定

采用重氮化法制備CLO人工抗原，免疫BALB/c小鼠后，利用細胞融合技術篩選獲得1株可穩(wěn)定分泌CLO-mAb的雜交瘤細胞株，命名為34-F10。制備的腹水及其純化后經SDS-PAGE鑒定結果如圖3-a所示，腹水樣品有許多雜帶，而純化后的CLO- mAb 只含有兩條帶（輕鏈和重鏈）。 CLO-mAb 的亞型鑒定結果如圖3-b所示，分泌的抗體重鏈為 IgG1 類，輕鏈為 κ 型。采用間接ELISA飽和法測定CLO-mAb的 K_m ，繪制曲線如圖3-c所示，通過計算可得 K_m 為1.65×10⁹L/mol ，屬于高親和力抗體 （K_m 為 10⁷ ～10¹²L/mol）^[23] 。ic-ELISA 測定 CLO-mAb 的IC₅₀ 為 0.188ng/mL ，表明敏感性較高；其他常見受體激動劑藥物（PA、SAL、CL和RAC）作為競爭物的 IC₅₀ 均大于10 μg/mL ，CR小于0.002% ，表明無交叉反應，特異性良好。

2.2AuNPs的表征及最優(yōu) pH 和抗體標記量的 確定

對制備的 AuNPs 進行TEM表征，如圖 4-a 所示，制備的 AuNPs 分散均勻，粒徑為 25nm 左右。分別測定4種不同 pH 時AuNPs的抗體最佳標記量，結果如圖4-b所示，加入 1μL，2μL 、3μL，4μLK₂CO₃ 的 AuNPs 溶液所對應的最佳抗體標記量分別為 0.5μL，0.5μL，1μL，2μL ，選擇 AuNPs 顏色未發(fā)生變化的最低抗體濃度為最低穩(wěn)定量，因此，確定AuNPs最適標記 pH 的K₂CO₃ 添加量為 1μL ，最佳抗體標記量為0.5μL 。

2.3 ICS的視覺檢測

將CLO和ACLO標準品用PBS稀釋為不同濃度（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0ng/mL） ，用ICS檢測后評估視覺檢測靈敏度。結果如圖5所示，CLO和ACLO對ICS的T線消線值均可達到 2.5ng/mL ，表明ICS的視覺檢測靈敏度較高，可用于CLO和ACLO的殘留檢測。

2.4豬尿樣品檢測

試驗結果表明，表面活性劑SDS可以明顯消除基質效應，且不影響ICS的靈敏度，結果如圖6-a所示，ICS的T線在SDS的處理下能產生穩(wěn)定的顯色。同時，試驗確定了表面活性劑SDS的最佳用量，結果如圖6-b所示，隨著SDS濃度的增加，C線的顏色變淺甚至消失，其原因可能是過量的SDS會破壞AuNPs和 mAb 之間的結合力，引起AuNPs和mAb解離，從而導致C線不顯色。試驗結果表明， 0.04% 的SDS為ICS消除豬尿樣品中基質效應的最佳添加量。在優(yōu)化條件下，用豬尿樣品將CLO標準溶液稀釋為7個濃度（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和 0ng/mL） ，并用ICS進行檢測，結果如圖6-c所示，確定目測檢測限為 2.5ng/mL 。用讀條儀掃描ICS的T線，并繪制標準曲線如圖6-d所示，得到線性回歸方程為 y=-0.743 7x+0.382 7.R²=0.991 8. ICS的 IC₅₀ 為 ，檢測限（ IC₁₀ ）為0.202ng/mL ，表明ICS能夠滿足豬尿樣品中 CLO殘留的靈敏檢測。

2.5 加標回收試驗

通過加標回收試驗對ICS的準確度和精密度進行評估。用豬尿樣品將CLO標液稀釋為3個濃度水平（0.5、1和 ，分別用ICS進行批內和批間檢測。從表1的結果可知，批內的平均回收率為8 2.79%～92 ： 96% ，CV為3.99%～7 . 08% 。批間的平均回收率為82.36%～89.09% ，CV為 4.05%～7.04% 。結果表明所研制的ICS的準確度和精密度較高。

3討論

3.1 人工抗原制備

CLO屬于小分子化合物，自身無免疫原性。抗原具有免疫原性通常需要其分子質量大于10ku ，因此，需將CLO偶聯(lián)載體蛋白方可刺激機體免疫應答產生抗體。但小分子結構上需具有相應的活潑基團才可與常用的含有大量羥基、氨基等活潑基團的BSA、OVA等載體蛋白偶聯(lián)。通常，分子結構上若含有氨基、羧基、羥基等活性基團，可直接采用戊二醛法、重氮化法、碳二亞胺法、混合酸酐法等偶聯(lián)方法；若無活性基團則可通過適當?shù)幕瘜W修飾方法，引人端基為活性基團的連接臂，再與載體蛋白偶聯(lián)[24]。CLO分子結構上無活性基團，前期試驗嘗試通過化學修飾引入活性基團，但人工抗原制備效果不佳。因此，從結構類似物具有較強交叉反應性的角度考慮，選擇類似物代替目標物進行偶聯(lián)，也可達到預期效果[25]。本研究根據(jù)CLO的分子結構，選擇僅在苯環(huán)上多一個活性氨基的結構類似物ACLO作為半抗原，采用重氮化法制備人工抗原，通過小鼠免疫、細胞融合、腹水制備等程序，達到了制備CLO-mAb的目的，且CLO-mAb的免疫學特性良好，K_m 處于高親和力抗體范圍， IC₅₀ 為0.188ng/mL ，且與其他常見受體激動劑藥物無交叉反應，敏感性和特異性良好，能夠為后續(xù)ICS的研制提供有效的抗體保障。

3.2 基質效應

ICS作為應用廣泛的快速檢測方法，在大批量樣品現(xiàn)場篩查中發(fā)揮著重要作用。在進行現(xiàn)場檢測時，通常需要進行簡單的樣品前處理，但一些樣品（如尿液、血液、動物組織等）成分較為復雜，會產生基質效應，不利于保持正常的檢測環(huán)境，影響抗體的性能和ICS檢測體系的穩(wěn)定性，導致檢測靈敏度和準確度降低，甚至出現(xiàn)假陽性或假陰性結果[26]。因此，需要加入必要的手段來消除復雜樣品的基質效應影響。有研究通過篩選具有環(huán)境耐受性的抗體用于方法建立[27]，但通常會對ICS樣品墊或樣品稀釋液進行優(yōu)化，以消除基質效應。本研究所研制的ICS針對的常用檢測樣品為豬尿，其中含有大量尿素、尿酸和無機鹽，若用PBS稀釋樣品，則檢測靈敏度會有所降低。已有相關研究發(fā)現(xiàn)，向豬尿中添加表面活性劑可減弱基質效應[28]，本研究嘗試添加表面活性劑SDS，并對其添加量進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)SDS能較好地消除基質效應，但SDS濃度過高時可能影響AuNPs和 mAb 之間的結合，導致ICS的C線不顯色，最終選擇 0.04% 的SDS作為消除樣品中基質效應的最佳添加量。

3.3 ICS的構建及性能

用于ICS構建的抗體標記物種類繁多，其中AuNPs制備方法成熟，容易通過靜電作用與抗體結合，且不影響其生物活性，仍是目前應用最為廣泛的抗體標記物[29]。用于標記抗體的AuNPs粒徑大多為 20～40nm^[30] ，本研究采用檸檬酸鈉還原法制備了粒徑為 25nm 左右且分散均勻的AuNPs，適合ICS的構建。ICS的檢測模式主要分為夾心模式和競爭模式，夾心模式也被稱為直接模式，通常用于含有多個抗原表位的大分子抗原物質，能被不同抗體識別從而構成夾心檢測，ICS的T線顯色與被檢靶標的量成正比；而競爭模式普遍應用于小分子抗原檢測中，被檢樣品中的靶標與T線上的人工抗原競爭與特異性抗體結合，ICS的T線顯色與被檢靶標的量成反比[31]。本研究將 AuNPs標記具有良好免疫學特性的 CLO-mAb ，通過優(yōu)化標記條件，基于競爭模式構建了ICS。通過對ICS檢測性能進行評估，ICS能夠靈敏檢測CLO及其衍生物ACLO，視覺檢測消線值達到 2.5ng/mL ；讀條儀定量檢測的檢測限為 0.202ng/mL ，且具有良好的靈敏度與準確度，雖與相關研究中用于豬尿CLO殘留檢測的ELISA試劑盒靈敏度等性能相當[32]，但操作更加簡易，檢測更為省時。本研究下一步仍需擴大樣品種類，拓展ICS在實際樣品檢測中的應用范圍，并探索ICS中新型納米標記材料的適用性，以及受體激動劑藥物多靶標的高通量檢測，并嘗試結合便攜式檢測裝置實現(xiàn)智能化檢測，進一步提高CLO的監(jiān)控檢測效率。

4結論

本研究通過制備CLO人工抗原，經小鼠免疫和細胞融合，篩選獲得了免疫學特性良好的CLO-mAb，在此基礎上，制備AuNPs并優(yōu)化pH和最佳抗體標記量，采用競爭模式構建ICS，通過表面活性劑消除基質效應，并檢測豬尿樣品進行性能評價。ICS的視覺檢測消線值為2.5ng/mL ，通過讀條儀定量檢測，檢測限為0.202ng/mL 。加標回收試驗表明ICS具有較高的準確度和精密度，成功用于豬尿樣品中的CLO殘留的快速檢測，可為提升獸藥殘留監(jiān)控效率、保障動物性食品安全提供有效支撐。

參考文獻 Reference：

[1]SHARMA A，GUPTA L.Clonidine a wonder drug[J].InidianJournal of Anesthesia and Analgesia，2ol9，6（6）： 2057-2062.

[2]DERK G，BARTON A，AN RP，et a.The safety and efficacy of clonidine in hemodialysis patients：a systematic reviewand meta-analysis[J].Pharmacology，2022，107（11/ 12）：545-555.

[3]BASKER S，SINGH G，JACOB R. Clonidine in paediatrics-a review[J].IndianJournalofAnaesthesia，20o9，53（3）： 270-280.

[4]CAPINO A C，MILLER JL，JOHNSON P N.Clonidine for sedationand analgesia and withdrawal in criticallyill infants andchildren[J].Pharmacotherapy，2016，36（12）：1290- 1299.

[5]王雷杰，占秀安，許梓榮，等.可樂定對生長豬胴體組成的影 響及其作用機理探討[J].浙江大學學報（農業(yè)與生命科學 版），2005，31（5）：654-658.

[6]王漢斌，熊錫山，孫成文，等.北京懷柔“4.23”急性可樂定 中毒事件臨床救治體會[J].中國科學（生命科學），2011，41 （10）：1043-1050.

[7]張瑩雪.可樂定及賽庚啶的檢測技術研究進展[J].甘肅畜 牧獸醫(yī)，2019，49（1）：20-21，24.

[8] MAMINA O，KABACHNY V. Identification and quantitative determination of clonidine by HPLC method[J].ScienceRise：PharmaceuticalScience，2020，5（27）：30-36.

[9]LUO W，PAN J X，CHEN B，et al.Rapid determination of clonidine in pharmaceutical preparations by paper spray tandem mass spectrometry （PS-MS/MS）[J]. Analytical Letters，2023，56（14）：2215-2225.

[10]李丹妮，嚴鳳，周悅榕，等.QuEChERS-超高效液相色譜 法-串聯(lián)質譜法同時檢測豬組織中賽庚啶及可樂定殘留量 [J].中國獸藥雜志，2017，51（2）：29-34.

[11]LEI H T，WANG Z H，EREMIN S A，et a.Application of antibodyand immunoassayforfood safety[J].Foods， 2022，11（6）：826.

[12]袁莉，楊順利，尚佑軍，等.豬瘟病毒結構蛋白抗體間接 ELISA檢測方法的建立及評價[J].西北農業(yè)學報，2018， 27（9）：1273-1279. clonal antibodies and development of a direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay to detect residues of phenylethanolamineA in urine samples[J].Journal of Agriculturaland FoodChemistry，20l2，60（46）：11618- 11624.

[14]王耀，曹金博，曹夕丹，等.鹽酸可樂定人工抗原及其鼠 源多抗的制備[J].西北農業(yè)學報，2021，30（11）：1595- 1602.

[15]YIN M Q，HU X F，SUN Y N，et al. The broad-spectrum and ultra-sensitive detection of zeranol and its analogues by an enzyme-linked immunosorbent assay in cattle origin samples[J].RSC Advances，2020，10（35） ：20809-20816.

[16］孫亞寧，王麗，王棟，等.豬瘟抗體檢測試紙研發(fā)及制 備工藝的優(yōu)化[J].西北農業(yè)學報，2019，28（2）：169-175.

[17］王耀，李燕虹，吳佳蓓，等.大豆 Bowman-Birk 胰蛋白酶 抑制因子單克隆抗體的制備與鑒定[J].中國食品學報， 2020，20（7）：216-221.

[18]項自來，王玲，夏蘇干，等.苯乙醇胺A單克隆抗體的研 制及 ELISA檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2019， 46（3）：849-857.

[19]SUN Y N，HU X F，ZHANG Y，et al. Development of an immunochromatographic strip test for the rapid detection ofZearalenone in corn[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（46）：11116-11121.

[20]RUSSO L，SANCHEZ-PURRA M，RODRIGUEZ-QUIJADAC，etal.Detection of resistance protein A（MxA）in paper-based immunoassays with surface enhanced Raman spectroscopy with AuAg nanoshells[J]. Nanoscale，2019， 11（22） ：10819-10827.

[21]LV S，XU X X，SONG S S，et al. An immunochromatographic assay for the rapid and qualitative detection of mercury in rice[J].Biosensors，2022，12（9）：694.

[22]CHEN L L，HU X F，SUN Y N，et al. An ultrasensitive monoclonal antibody-based lateral flow immunoassay for therapiddetection of xylazineinmilk[J].Food Chemistry，2022，383：132293.

[23]VAN REGENMORTEL M H，AZIMZADEH A. Determination of antibody affinity[J]. Journal of Immunoassay， 2000，21（2/3）：211-234.

[24]宋娟，王榕妹，王悅秋，等.半抗原的設計、修飾及人工抗 原的制備[J].分析化學，2010，38（8）：1211-1218.

[25]HU X F，NA G Q，SUN Y N，et al. Establishment of ultrasensitive immunoassay strip based on colloidal goldMcAb probe for detecting cyproheptadine hydrochloride and sixphenothiazinesinfeed[J].Food Additives amp; Contaminants.Part A，Chemistry，Analysis，Control，Exposure amp; Risk Assessment，2023，40（11）：1440-1449.

[26] ZHANG Y，PENG J，GUO P，et al. Matrix effect of swine urine on time-resolved fluorescent nanobeads and colloidal gold immunochromatographic assay[J]. Food and Agricultural Immunology，2018，29（1）：711-721.

[27]LIU MG，BAI Y C，DOU L N，et al. A highly salt-tolerant monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the rapid detection of phenylethanolamine Ain urine[J]. Food and Agricultural Immunology，2022， 33（1）：575-587.

[28]FENG M，SURYOPRABOWO S，TAO H，et al. Rapid detectionofclonidineand itscross-reactivitywith apraclonidine in pig urine using an immunochromatographic test strip[J].Food and Agricultural Immunology，2o18，29：

821-832. [29] GUOJC，CHENSQ，GUOJH，eta.Nanomaterial labels in lateral flow immunoassays for point-of-care-testing [J].JournalofMaterialsScienceamp;.Technology，2021，

60：90-104. [30] CHANDLERJ，GURMINT，ROBINSONN.Theplaceof goldin rapid tests[J].IVD Technology，20oo，6（2）：

37-49. [31]LIG，LI QM，WANG X，et al.Lateral flow immunoassays forantigens，antibodies and haptens detection[J]. International JournalofBiological Macromolecules，2o23，242：

125186. [32] 李丹妮，顧欣，黃華，等.可樂定ELISA檢測試劑盒的 研制及其性能評價[J].中國獸藥雜志，2017，51（8）：40-45.

Preparation of Monoclonal Antibodies and Development of Immunochromatographic Strips for Clonidine Hydrochloride

WANG Yao1 ，JING Yubing1 ，CAO Jinbo1'2，SUN Yaning2 ， XING Yunrui2，CHEN Xiujin1，LI Zhaozhou1 and HU Xiaofei' （1.Foodand Bioengineering Collge/Henan International Joint Laboratory of Food Green Processing and Quality Safety Control，Henan University of Science and Technology，Luoyang Henan 47looo，China; 2.KeyLaboratoryofAnimal Immunology，Henan AcademyofAgricultural Sciences，Zhengzhou450o02，China

Abstract Clonidine hydrochloride （CLO） is a novel alternative to traditional receptor agonist and is prohibited for use in feed and animal drinking water. The development of rapid detection methods for CLO is of great significance for improving the efficiency of monitoring veterinary drug residues and ensuring the safety of animal-derived food. In this study，murine monoclonal antibodies of CLO with high sensitivity and strong specificity were prepared，andan immunochromatographic strip （ICS） was developed for rapid detection of CLO residues based on a competitive model. The ICS cutoff value of ICS for visual detection was 2.5ng/mL ，and quantitative detection was conducted by a reader，and the detection limit was 0.202ng/mL . The results of pig urine samples recovery test showed that the intra-assay recovery rate of ICS ranged from 82.79% to 92.96% ，with a maximum coefficient of variation（CV）of 7.17% ，the inter-assay recovery rate of ICS ranged from 82.36% to 89.09% ，with the highest CV of 7.04% . ICS demonstrated high sensitivity and accuracy，providing a practical and rapid detection tool for the efficient monitoring of CLO residues.

Key wordsClonidine hydrochloride; Monoclonal antibody;Immunochromatographic strip； Rapid detection

Received 2024-04-30 Returned 2024-06-05

Foundation item National Natural Science Foundation of China （No. 31702218）；Scientific and Technological Research Project of Henan Province （No.232102320298，No.242102321131）； Training Plan for Young Backbone Teachers in Higher Education Institutions of Henan Province （No. 2023GGJS046）； Postgraduate Education Reform and Quality Improvement Project of Henan Province （No. HNYJS202oJDo6）； Public Welfare Industry Scientific Research Project of Luoyang Municipality （No.2202021A）.

First author WANG Yao，male，Ph.D，associate professor. Research area： rapid detection technology of food safety. E-mail： wangyao@haust. edu.cn

Corresponding authorHU Xiaofei，male，Ph.D，research fellw. Research area： animal nutrition，food and feed immunoassay. E-mail： huxf1972@126.com

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）