高性能豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料的制備方法與表征

中圖分類號(hào)：TB34 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Preparation and characterization of high performance antibacterial porcine acellular dermal matrix dressings

YANG Bo1，WANG Kai1， YANG Guang1， MO Tianlu1， LIANG Fu1，CHEN Xiaohong2 （1.SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineeing，UniversityofShanghaiforSienceandTechnologyangha20093， China;2.SchoolofaterialsndChemistry，UniversityofhanghaiforcienceandTechnologyhanghai2o3，ina）

Abstract： Acellular dermal matrix has been used as a clinical wound dressing due to its ability to promote wound healing. However， similar products on the market have poor mechanical strength and lack antimicrobial properties. In this study， we improved the preparation process of porcine acelular dermal matrix（PADM） and incorporated quercetin （QCT） and poly-L-lysine （PLL） to fabricate an antimicrobial quercetin-poly-L-lysine-porcine acellular dermal matrix（QCT-PLL-PADM） dressing with enhanced performance. Fourier transform infrared spectrum analysis show that the samples retain the natural triple-helical structure of collagen after the addition of QCT and PLL. Differential scanning calorimetry and mechanical property analysis show that the QCT-PLL-PADM samples exhibit a 50% increase in thermal stability and a 90% improvement in mechanical properties compared to pure PADM. Moreover， QCT-PLL-PADM demonstrates excelent antimicrobial activity， with an antimicrobial rate exceeding 92% . Additionally， cellular compatibility analysis reveals that QCT-PLL-PADM promot cell adhesion and growth， with a relative growth rate of cells over 75% . Compared to commercial products， the mechanical strength of QCT-PLL-PADM is enhanced by 90%～110% ， and other properties are enhanced by 20%～40% . These results indicate that QCT-PLL-PADM can serve as an effective wound dressing and has potential applications in skin and oral tissue repair.

Keywords： porcine; acellular dermal matrix; dressing quercetin; poly-L-lysine

傷口敷料是一類用于創(chuàng)傷、燒傷、潰瘍等傷口覆蓋的醫(yī)用材料，主要作用是為傷口提供理想的恢復(fù)環(huán)境，加快傷口愈合[]。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料具有良好的生物相容性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和豐富的生物活性成分，在促進(jìn)皮膚修復(fù)和傷口愈合等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值[2。但脫細(xì)胞真皮基質(zhì)并不具備抗菌性能，這限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。因此，對(duì)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行抗菌改性成為研究熱點(diǎn)。常用于脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的抗菌劑包括季銨鹽、金屬納米材料和天然抗菌材料等[3-5]。季銨鹽和金屬納米材料均具有抗菌譜廣和抑菌活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，常用作傷口敷料抗菌劑，但它們的生物相容性較差，需要對(duì)使用濃度進(jìn)行嚴(yán)格控制。

本文使用豬皮制備豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（porcineacellulardermalmatrix，PADM）。PADM的主要成分為I型膠原蛋白，這使其具有良好的生物活性、低抗原性和生物相容性。Pabst等對(duì)PADM的分析結(jié)果表明，PADM具有良好的生物相容性，并且PADM允許周圍細(xì)胞攀附生長的同時(shí)自身慢慢降解吸收，最終由新生結(jié)締組織完全取代[]。但是，純脫細(xì)胞真皮基質(zhì)容易被機(jī)械應(yīng)力破壞或被體內(nèi)膠原酶降解，并且不具備抗感染能力，這會(huì)導(dǎo)致愈合過程中出現(xiàn)問題[8-9]。因此，開發(fā)一種可以防止感染，同時(shí)促進(jìn)傷口愈合的高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)十分必要。

槲皮素（quercetin，QCT）是一種類黃酮，以糖昔的形式存在于蔬菜和其他植物中，分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特，在4個(gè)位點(diǎn)只有一個(gè)額外的氧原子[10]，這種特殊結(jié)構(gòu)使其具有一定的生物活性、抗菌作用和抗氧化性[-2]。聚賴氨酸（poly-L-lysine，PLL）是一種多肽類抗菌劑，該聚合物是通過賴氨酸殘基的 a -羧基和 ε? -氨基發(fā)生縮合反應(yīng)而形成的酰胺鍵，可以與帶負(fù)電的物質(zhì)產(chǎn)生靜電吸附作用[13]。PLL具有熱穩(wěn)定性高、安全無毒、抗菌能力強(qiáng)、可生物降解和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[14]，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌等具有顯著的抑制效果，

目前，市面上的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)產(chǎn)品的機(jī)械強(qiáng)度與抗菌能力已無法滿足越來越高醫(yī)用需求。因此，本文使用了丙三醇縮水甘油醚（GPE）和QCT作為PADM的交聯(lián)劑，選擇QCT和PLL為PADM提供優(yōu)異的機(jī)械性能和抗菌能力。對(duì)材料的熱穩(wěn)定性、力學(xué)性能和抗菌性能等進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并比較了QCT-PLL-PADM與PADM的生物相容性。

材料與方法

1.1 材料

豬皮購自北京瑞健高科生物科技有限公司；GPE購自爭銳化工有限公司；氯化鈉、十二烷基苯磺酸鈉、胰蛋白酶、甘氨酸、三乙醇胺、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氯化銨、乙醇、溴化鉀、QCT和PLL等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；海奧口腔修復(fù)膜和蓋氏口腔修復(fù)膜購自口腔醫(yī)院。

1.2 儀器

恒溫培養(yǎng)搖床（THZ-100，一恒科學(xué)儀器有限公司）、離心機(jī)（TDL-80-2B，安亭科學(xué)儀器廠）、超聲機(jī)（XM-400ULF，小美超聲儀器（昆山）有限公司）、真空冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-25T，寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司）、烘箱（DFZ6030A，一恒科學(xué)儀器有限公司）、傅里葉紅外光譜儀（Nicoletisl0，ThermoFisher，美國）、差式掃描量熱儀（DSC-8000，PerkinElmer，美國）、掃描電子顯微鏡（JSM-IT500HR，JEOL，日本）、微電腦式拉力試驗(yàn)機(jī)（TM2101-T5，濟(jì)南泰欽電氣有限公司）、紫外分光光度計(jì)（UV-VISUV5，METTLERTOLEDO，瑞士）、酶標(biāo)儀（Infinite200PRO，TECAN，美國）。

1.3 方法

1.3.1 PADM樣品制備

a.將厚度為 0.4mm 的豬皮裁剪成 1.5mm×2mm （長 × 寬）的樣品，放置于離心管中，加人 10mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5% 的 NaCl 溶液，設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000r/min ，離心 60min ，重復(fù)3次。

b.設(shè)置搖床溫度為 38^°C ，轉(zhuǎn)速為 200r/min 樣品放置于 50mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.4% 的十二烷基苯磺酸鈉溶液中，加入 和 5μL 脂肪醇聚乙烯醚，勻速轉(zhuǎn)動(dòng) 60min 后，用去離子水沖洗，重復(fù)3次。

c.分別取 25mL10U/mL 的胰蛋白酶緩沖溶液和 20U/mL 的中性蛋白酶緩沖溶液混合，將樣品置入其中。設(shè)置搖床溫度為 28^°C ，轉(zhuǎn)速為 200r/min 勻速轉(zhuǎn)動(dòng) 12h 后，用去離子水沖洗，再在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2% 的 ΔNaOH 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2.5% 的 NaS 溶液中勻速轉(zhuǎn)動(dòng) 60min 后，用去離子水沖洗。沖洗完成后，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2% 的 ΔNH₄Cl 溶液中轉(zhuǎn)動(dòng)60min ，然后使用去離子水沖洗。

d.將樣品置于 5U/mL 的胰蛋白酶緩沖溶液中，設(shè)置搖床溫度為 32^°C ，轉(zhuǎn)速為 200r/min ，勻速轉(zhuǎn)動(dòng) 60min 后，用去離子水沖洗，重復(fù)2次。

e.配置 pH 為10.5的 ΔNaHCO₃–NaOH 緩沖液，搖床設(shè)置同步驟 ，將樣品置于緩沖液中轉(zhuǎn)動(dòng) 30min 后取出，設(shè)置搖床溫度為 35^°C ，轉(zhuǎn)速為 200r/min 將樣品置于 50mL 緩沖液中，加入 3mL GPE、0.5mL 三乙醇胺，勻速轉(zhuǎn)動(dòng) 36h 。

f.在交聯(lián)液中添加 1.5g 甘氨酸，勻速轉(zhuǎn)動(dòng)60min 后使用去離子水沖洗，設(shè)置搖床溫度為32% ，轉(zhuǎn)速為 200r/min ，將樣品置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的 NH₄Cl 溶液中轉(zhuǎn)動(dòng) 60min ，然后用去離子水沖洗至廢液 pH 為7.5。設(shè)置搖床溫度為 35^°C ，將樣品置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1% 的甘氨酸溶液中勻速轉(zhuǎn)動(dòng) 60min 后，用去離子水沖洗，初步制得PADM樣品。

1.3.2 QCT-PLL-PADM樣品制備

將 400mgQCT 溶解到 20mL 乙醇中，超聲處理 15min 得到均勻的溶液。將PADM加人到QCT溶液中，再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1% 、0.3% 、 0.5% 、 0.7% 的PLL，在 37^°C 恒溫?fù)u床中交聯(lián) 24h 。每個(gè)樣品用超純水洗滌5次，送至冷凍干燥機(jī)中凍干 ^12h 后，在 35^°C 、濕度 85% 的干燥箱中回軟6h[15]

1.3.3傅里葉變換紅外光譜測定

取 2mg 樣品與 100mg 溴化鉀研磨均勻，壓制成薄片。傅里葉紅外光譜采集過程中，保持室溫為 25^°C ，設(shè)置光譜儀掃描范圍為 400～4000cm^-1 、掃描速率為每光譜32次掃描。

1.3.4掃描電子顯微鏡觀察

將一定量的樣品噴金處理，置于掃描電子顯微鏡下，在 20kV 加速電壓條件下進(jìn)行放大觀察。

1.3.5差示掃描量熱法測定

用差示掃描量熱儀測定樣品的熱變性溫度。將 5mg 樣品密封在鋁坩鍋中，以空坩鍋?zhàn)鳛閷?duì)照。參數(shù)設(shè)置：溫度范圍 10～120^°C ，加熱速率10^°C/min ，氮?dú)獯祾咚俾?20mL/min 。

1.3.6抗張強(qiáng)度及斷裂拉伸率測定

用拉力試驗(yàn)機(jī)以 100mm/min 的速率測量矩形樣品的抗張強(qiáng)度和斷裂拉伸率。

1.3.7孔隙率測定

稱取樣品 1g （準(zhǔn)確到 _0.0001g ，記為 m₁ 。將樣品割為小碎片，面積 1cm² 左右，投入 50mL 容量瓶中，往瓶中加人去離子水至刻度標(biāo)線。用循環(huán)水真空泵將容量瓶內(nèi)抽真空至樣品不會(huì)有氣泡冒出。對(duì)含有去離子水和樣品的容量瓶進(jìn)行稱重，記質(zhì)量為 m₂ 。再將樣品碎片取出，對(duì)剩余的含有去離子水的容量瓶稱重，質(zhì)量記為 m₃ 。樣品的孔隙率 P 計(jì)算公式為

P=[（m₂-m₃-m₁）/（m₂-m₃）]×100%

每組進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，最終結(jié)果為其平均值。

1.3.8水蒸氣透過率測定

將樣品放人生理鹽水中浸泡 30min ，量取10mL 的生理鹽水加入試管中，對(duì)裝有生理鹽水的試管稱重，質(zhì)量記為 m₀ 。將試管口用樣品密封住，然后用線繩扎緊固定。將密封住的試管在（36±1） C 恒溫干燥箱中干燥， 24h 后稱重，質(zhì)量記為m4。樣品的水蒸氣透過率 Wr計(jì)算公式為[16]

Wr=（m₀-m₄）/S

式中， s 為試管口的面積。每組進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，最終結(jié)果為其平均值。

1.3.9抗菌性測定

將活化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)速 200r/min 、溫度 37% 的搖床中培養(yǎng) 12h ，在600nm 處測定菌液的光密度（opticaldensity，OD）值，之后與LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行混合，稀釋至OD值約為0.6，然后按 1：1000 比例繼續(xù)稀釋，稀釋至菌落計(jì)數(shù)約為 。將經(jīng)高溫滅菌處理后的樣品加入到 3mL 稀釋后的菌液中，其中，不添加樣品的為空白對(duì)照組，在轉(zhuǎn)速 200r/min 、溫度 37^°C 、光照條件下的搖床中培養(yǎng) 24h ，測定600nm 處的OD值。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌來源于，由實(shí)驗(yàn)室自行分離保存?？咕蔉計(jì)算公式為[17]

F=[（D₀-D₁）/D₀]×100%

式中， D₀，D₁ 分別為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組在 600nm 處的OD值。

1.3.10細(xì)胞相容性測定

使用人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2）作為模型細(xì)胞，通過CCK-8法測定并體外評(píng)估樣品的細(xì)胞毒性。將樣品切成 10mm×70mm 的矩形，置于 50mL 離心管中紫外滅菌 ^12h ，然后浸泡在9.3mL 細(xì)胞培養(yǎng)基中 24h ，得到提取物。根據(jù)樣品的厚度（根據(jù)《 ：ISO 10993-12： 2012? ）計(jì)算浸提比例為 6cm²/mL 。細(xì)胞培養(yǎng)基是補(bǔ)充有體積分?jǐn)?shù)為 10% 的胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)為 1% 的DMEM（Dulbecco'smodified Eaglemedium）培養(yǎng)基。消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的HK-2細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至 1×10⁴ 個(gè) /mL 后，吸取 100μL 細(xì)胞懸液鋪入96孔板中，置于 37^°C 、 CO₂ 體積分?jǐn)?shù)為 5% 的恒溫培養(yǎng)箱中 24h 后，去除完全培養(yǎng)基，在每個(gè)孔中加入 100μL 浸泡提取液，同時(shí)做完全培養(yǎng)基空白對(duì)照組，置于 37^°C 、 CO₂ 體積分?jǐn)?shù)為 5% 的恒溫培養(yǎng)箱中孵育1、3、 5d 。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，于96孔板中每孔加入 10μL 的CCK-8試劑，孵育 2h 。在酶標(biāo)儀檢測 492nm 波長下，測量樣品的OD值。人腎皮質(zhì)/近曲小管上皮細(xì)胞來自市農(nóng)業(yè)科學(xué)院保存。細(xì)胞相對(duì)增長率 R 計(jì)算公式為[18]

R=（D₂/D₃）×100%

式中， D₂ 、 D₃ 分別為樣品組、對(duì)照組在 492nm 處的OD值。

2 結(jié)果與分析

以豬皮為原料，對(duì)制備的PADM和QCT-PLL-PADM樣品進(jìn)行一系列分析，部分結(jié)果與市面常用產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比。

2.1 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜可以表征樣品的微觀結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PLL對(duì)QCT-PLL-PADM樣品的基團(tuán)和微觀結(jié)構(gòu)造成的影響如圖1所示。QCT-PLL-PADM樣品的光譜中并不存在QCT與PLL的特征峰，這表明QCT 和PLL與 PADM結(jié)合[19-20]。對(duì)于PADM樣品， 3410cm^-1 附近的峰為酰胺A，由 的拉伸振動(dòng)和氫鍵產(chǎn)生[21]； 1650cm^-1 的峰為酰胺I，由 C=0 拉伸振動(dòng)產(chǎn)生； 1545cm^-1 的峰為酰胺Ⅱ，由 的彎曲振動(dòng)與 C-N 的拉伸振動(dòng)產(chǎn)生。酰胺I和酰胺ⅡI主要表征膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[2-23]，酰胺 A存在說明膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。由圖1可知，隨著PLL含量的增加，QCT-PLL-PADM樣品酰胺條帶特征峰并無削弱跡象，這表明QCT和PLL對(duì)膠原蛋白的特征性三螺旋結(jié)構(gòu)并無影響[24-25]，膠原蛋白生物學(xué)特性結(jié)構(gòu)保持完整，這與細(xì)胞相容性結(jié)果一致。

2.2 掃描電子顯微鏡分析

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)是由膠原分子、原纖維、纖維和纖維束組成的多層聚集體，膠原分子與纖維之間的化學(xué)鍵可以將膠原與纖維拉緊，使樣品結(jié)構(gòu)略微收縮，變得更加致密。從圖2（a）的箭頭處可觀察到，PADM樣品中的膠原纖維束逐層堆疊并交織在一起形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以提高樣品的抗拉伸能力，在傷口愈合過程中提供良好的支撐和結(jié)構(gòu)支持，更好地促進(jìn)組織重建。從圖 2（b）～（c） 的箭頭處可觀察到，PLL交聯(lián)后以顆粒狀形式附著在QCT-PLL-PADM樣品纖維間隙上，隨著PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其附著量也隨之增加，這會(huì)對(duì)樣品的孔隙率造成一定影響。圖2（d）箭頭處表明，PLL在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5% 時(shí)開始附著在樣品表面，這使得PLL更容易接觸并殺死細(xì)菌。圖2（e箭頭處表明，當(dāng)PLL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升至0.7% 時(shí)，樣品表面的PLL顯著增加，這可能會(huì)覆蓋膠原蛋白表面的生物活性位點(diǎn)，導(dǎo)致樣品對(duì)細(xì)胞黏附能力下降，使得細(xì)胞增殖和遷移能力變?nèi)鮗26-27]。

2.3 熱分析

樣品的熱分解過程可以通過差示掃描量熱法（differential scanningcalorimetry，DSC）檢測。對(duì)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)而言，溫度的升高會(huì)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，膠原蛋白中的氫鍵和一些弱鍵會(huì)發(fā)生斷裂，分子間作用力逐漸降低。溫度的升高會(huì)破壞膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)，使樣品理化性質(zhì)發(fā)生變化[28]，這不利于傷口愈合過程的順利進(jìn)行。市面上的產(chǎn)品，如國內(nèi)海奧口腔修復(fù)膜、國外蓋氏口腔生物膜的熱變性溫度在 45～52°C ，不具備較強(qiáng)的耐熱性。圖3和圖4表明，膠原蛋白的熱變性溫度相對(duì)較低，在 45^°C 左右，添加QCT與PLL后，QCT-PLL-PADM樣品的熱變性溫度顯著上升至67.9^°C 。這說明交聯(lián)后，樣品的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，樣品的耐熱性增加。并且，PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，會(huì)在樣品表面形成覆蓋物，這種表面改性也會(huì)提高樣品的耐熱性。樣品熱變性溫度的升高有利于保持膠原蛋白的生物相容性和理化性質(zhì)，同時(shí)表明QCT與PLL發(fā)生有效交聯(lián)，

2.4 機(jī)械性能分析

抗張強(qiáng)度和斷裂拉伸率是材料力學(xué)性能的重要測試指標(biāo)，通常用于表征材料抵抗外力的能力。膠原基生物醫(yī)用材料在臨床應(yīng)用中應(yīng)具有一定的柔韌性、抗張強(qiáng)度和抗撕裂性，以免對(duì)機(jī)體的傷口修復(fù)造成影響[2]。因此，調(diào)節(jié)膠原蛋白基生物材料的力學(xué)性能尤為重要。目前，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的強(qiáng)度已經(jīng)無法滿足一些生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的臨床需求。

PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)樣品機(jī)械性能的影響如圖5所示。隨著PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，樣品的抗張強(qiáng)度逐漸提升，在PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5% 時(shí)，達(dá)到最大值 97.4MPa 。相較于市面上產(chǎn)品 40～50MPa 的抗張強(qiáng)度，性能提升較大。這說明了QCT、PLL和膠原蛋白分子形成了穩(wěn)定的化學(xué)鍵，使膠原纖維排列得更加緊密，從而提高了抗張強(qiáng)度。當(dāng)PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.7% 時(shí)，抗張強(qiáng)度下降，這可能是由于樣品中反應(yīng)性基團(tuán)的消耗以及纖維中PLL填充過多造成的，這可能會(huì)破壞膠原纖維的排列，使得部分結(jié)構(gòu)剛性過強(qiáng)，導(dǎo)致應(yīng)力集中，受到外力更容易發(fā)生斷裂。

對(duì)于需要保持張力的身體部位（如皮膚、硬腦膜、肌腱等），適當(dāng)?shù)臄嗔牙炻士梢源龠M(jìn)創(chuàng)傷組織恢復(fù)[29]。目前，市面上產(chǎn)品的斷裂伸長率通常在 112%～118% ，QCT-PLL-PADM的最大斷裂拉伸率為 117% 。QCT-PLL-PADM斷裂拉伸率表現(xiàn)為先增加后減小，增加說明形成的化學(xué)鍵為氫鍵。因?yàn)闅滏I可以使膠原纖維之間形成穩(wěn)定的交織網(wǎng)絡(luò)，這種優(yōu)化的組織結(jié)構(gòu)使得膠原纖維能夠在受到外部拉伸力時(shí)，各個(gè)纖維之間相互支撐和配合，減少了斷裂的可能性，提高了斷裂拉伸率。隨著PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)從 0.5% 增加至 0.7% QCT-PLL-PADM的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)變得更致密，形成更緊、更強(qiáng)的剛性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致材料的斷裂拉伸率下降。纖維被過度拉伸時(shí)其以定向方式聚集，這使纖維更難變形，從而降低斷裂拉伸率。

2.5 孔隙率分析

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)通常具有較為緊密的結(jié)構(gòu)，但由于缺乏必要的微孔結(jié)構(gòu)，血管內(nèi)皮細(xì)胞可能難以快速長入，不能為細(xì)胞的生長增殖提供良好的微環(huán)境，也不利于物質(zhì)的交換，進(jìn)而影響組織修復(fù)和重建[30]。大量的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，合適的孔徑和較高的孔隙率能夠有效促進(jìn)組織再生。理想的膠原材料應(yīng)為三維纖維狀多孔結(jié)構(gòu)，孔與孔之間相互貫通，孔隙率高于 80%^81] 。但過高的孔隙率也會(huì)導(dǎo)致材料機(jī)械性能下降，因此，需要根據(jù)具體的應(yīng)用要求進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。

PLL對(duì)樣品孔隙率的影響如圖6所示。隨著PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，樣品的孔隙率逐漸降低。這是因?yàn)楦嗟腜LL會(huì)占據(jù)樣品的孔隙空間，使得孔隙變小。PLL分子較大，結(jié)合到樣品表面后會(huì)產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，阻礙其他分子進(jìn)入孔隙，導(dǎo)致孔隙率的降低。同時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)會(huì)使基質(zhì)形成更加緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而降低樣品的孔隙率。PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于 0.7% 時(shí)，樣品孔隙率仍然保持在 80% 以上，與市面上的產(chǎn)品相接近。

2.6 水蒸氣透過率分析

水蒸氣透過率是醫(yī)用敷料的一個(gè)重要指標(biāo)。皮膚創(chuàng)面治療過程中，往往會(huì)有大量的傷口滲出液產(chǎn)生，若不能及時(shí)除去滲出液，會(huì)造成創(chuàng)面積液，從而影響傷口的恢復(fù)。但是，創(chuàng)面的恢復(fù)需要一個(gè)濕潤的有利環(huán)境，水蒸氣透過率不能太大，以免造成創(chuàng)面干燥。臨床上普遍認(rèn)為，敷料的水蒸氣透過率應(yīng)保持在創(chuàng)面蒸發(fā)率的 50% 左右，即2500 g/（m2-24 h）左右[16]

由圖7可知，隨著PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，樣品的水蒸氣透過率逐漸降低，在PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5% 時(shí)，接近臨床標(biāo)準(zhǔn) 2500g/（m²?24h） 。降低原因是PLL分子鏈上的氨基與樣品發(fā)生靜電相互作用，填充了樣品的孔隙，形成了更致密的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)會(huì)降低樣品的透氣性和水分蒸發(fā)速率，從而有助于保持基質(zhì)內(nèi)部的水分。PLL具有較強(qiáng)的吸濕性，能夠起到物理阻隔的作用，減緩水分子的蒸發(fā)和流失，提高樣品的保濕能力。綜上，PLL的加入能有效降低樣品的水蒸氣透過率，改善其水蒸氣阻隔性能，

2.7 抗菌性分析

生物醫(yī)用材料應(yīng)具有抗菌特性，以防止傷口感染。多肽抗菌劑PLL的抗菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，隨著PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，抗菌效果逐步提高，當(dāng)PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5% 時(shí)，抗菌率達(dá)到了最大值 92% 。PLL是一種陽離子多肽，可以通過靜電作用與細(xì)菌細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷相互吸引，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的完整性，致使細(xì)胞內(nèi)容物泄露，最終殺死細(xì)菌。此外，通過破壞細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，聚賴氨酸可以阻止細(xì)菌的附著和生長，從而減少細(xì)菌的繁殖和感染能力。在PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，其主要抗菌成分在PADM的間隙中通過氫鍵與膠原纖維交聯(lián)[32]，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到 0.5% 時(shí)，抗菌成分開始交聯(lián)在QCT-PLL-PADM樣品表面，更容易與細(xì)菌接觸并將其殺死，從而提高樣品的抗菌能力。

2.8 細(xì)胞相容性分析

CCK-8法常用于檢測細(xì)胞體外存活和增殖，細(xì)胞的生長情況如圖9所示。細(xì)胞的光密度值增加，表明細(xì)胞正常增殖，且添加PLL樣品的光密度均高于純PADM，這說明PLL可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖及黏附。而隨著PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，光密度在第3天和第5天開始下降，這說明PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)會(huì)出現(xiàn)相容性問題，導(dǎo)致細(xì)胞的增長速率下降。而由圖10可知，當(dāng)PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% 時(shí)，樣品的相對(duì)增長速率仍高于 75% ，說明細(xì)胞增殖速度并不會(huì)受到過分抑制。綜上可得，QCT和PLL的引入不會(huì)對(duì)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的生物相容性產(chǎn)生不利影響。因此，綜合理化性質(zhì)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果，樣品滿足生物材料對(duì)細(xì)胞相容性的要求。

3結(jié)論

本文對(duì)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并添加生物活性因子QCT和可降解抗菌劑PLL，制得的QCT-PLL-PADM樣品保持了膠原蛋白的天然三螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)具備較強(qiáng)的抗菌能力，且樣品的熱穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度和親水性全面提升。在PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5% 時(shí)，QCT-PLL-PADM樣品的熱分解溫度上升到 70% ，抗張強(qiáng)度達(dá)到 97.4MPa ，拉伸斷裂率為 109% ，相較于市面上常用的產(chǎn)品，熱穩(wěn)定性能提高了 20% ，機(jī)械強(qiáng)度提高了 90%～110% 。此外，樣品水蒸氣透過率和孔隙率符合臨床使用標(biāo)準(zhǔn)，且抑菌率達(dá)到了 92% 細(xì)胞相對(duì)增率在 75% 以上。這說明QCT-PLL-PADM具有良好的生物相容性，可在傷口修復(fù)和組織再生等方面進(jìn)行應(yīng)用。

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（編輯：董偉）