正交試驗法優(yōu)選犬問荊山奈素提取中水解條件的研究

劉計權(quán)，謝樹蓮，尹曉琴，蘇志蘭

（1.山西中醫(yī)學院，山西太原 030024； 2.山西大學生命科學學院，山西太原030006）

犬問荊Equisetum palustre Linn為木賊科問荊屬藥用植物［1］，據(jù)文獻資料報道，問荊屬中藥用植物的主要成分為黃酮醇及二氫黃酮醇類，如山奈素、槲皮素、二氫槲皮素等［2］。藥理研究顯示，該類成分具有抗心肌缺血、降血壓、鎮(zhèn)靜、以及抗腫瘤、抗癌等作用，且可作為清肝明目、鎮(zhèn)痛止血藥作為戒毒藥品［3-4］。犬問荊廣泛分布于全國各地，本實驗以山奈素為指標，利用正交試驗法對犬問荊山奈素提取中的水解條件進行了優(yōu)選。

1 實驗材料

Waters高效液相色譜儀（515泵，2996紫外檢測器）。山奈素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110861-200808）；甲醇為色譜純，水為雙蒸水，磷酸為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純。犬問荊采自內(nèi)蒙赤峰，經(jīng)鑒定為木賊科問荊屬藥用植物犬問荊Equisetum palustre Linn。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取犬問荊0.75 g粉末過三號篩，共9份，置于具塞圓底燒瓶中，精密加入75%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷后稱定重量，用75%乙醇補足減少的重量，搖勻濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL加濃鹽酸進行水解［5］。水解液于水浴中蒸干，殘渣加蒸餾水10 mL溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，合并萃取液，水浴揮干溶劑，殘渣加乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻作為供試品溶液。

2.2 水解條件的正交設(shè)計

根據(jù)文獻和預實驗［6］，選用L9（34）正交表對水解條件進行正交實驗，選用加濃鹽酸體積、水解溫度、水解時間3項作為考察因素，每個因素3個水平，各因素水平見表1。

2.3 山奈素的測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Sinochorm-ODS BP色譜柱（250 nm×4.6 nm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（56∶44）；流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：365 nm。山奈素對照品和犬問荊供試品HPLC色譜圖見圖1、圖2。

表1 山奈素水解條件因素水平表

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取山奈素對照品5.7 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對照品溶液（含山奈素0.114 mg/mL）。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 置 10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；分別吸取10 μL，按上述色譜條件測定峰面積，以山奈素進樣量（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行回歸分析，計算得回歸方程為Y=4 636.2X－47 562，r=0.999 9。結(jié)果表明：山奈素在 0.057 μg～1.140 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 樣品含量測定

精密吸取上述供試品溶液10 μL分別注入色譜儀進行測定，帶入回歸方程計算山奈素的含量。測定結(jié)果及結(jié)果分析見表2、表3。

從表2可以看出，不同因素水平對結(jié)果影響強弱順序為：A1＞A2＞A3，B2＞B3＞B1，D2＞D1＞D3，從而初步認為最佳水解條件為A1B2D2。為進一步明確各因素的水平變化對實驗結(jié)果是否具有顯著影響，利用方差分析作進一步考察。由表3可知，F(xiàn)0.05＜FD＜F0.01，即因素D（加鹽酸量）的水平變化對實驗結(jié)果有顯著影響，因素A（水解時間）和因素B（水解溫度）的水平變化對實驗結(jié)果無顯著性影響。從節(jié)約的角度考慮，最終確定理想的水解條件為A1B1D2，即60℃下，加鹽酸2.5 mL，水解30 min。

表2 山奈素水解條件L9（34）正交試驗結(jié)果

表3 山奈素水解條件方差分析表

2.5 重復性實驗

根據(jù)正交試驗所得的最佳水解條件，稱取同批犬問荊3份，按最佳水解條件制備供試品溶液，在上述色譜條件下，精密吸取上述對照品溶液與各供試品溶液10 μL，對山奈素的含量進行測定。結(jié)果見表4。

表4 犬問荊中山奈素的含量測定結(jié)果 （n=3）

由表4可知，3次所測犬問荊中山奈素的平均含量為0.057 7 mg/g，與最佳水解條件下所測的平均值相近，RSD為0.49%，說明該方法穩(wěn)定、可行。

3 討 論

3.1 提取溶劑的考察

由于甲醇毒性大，故考慮能否用75%的乙醇代替75%甲醇作為提取溶劑，對兩者的提取效果進行考察。結(jié)果以75%乙醇回流提取完全，所測目標成分山奈素含量較高，且色譜圖中各峰分離效果好。由于乙醇較甲醇對人體危害小，故最終確定采用75%的乙醇作溶劑回流提取樣品。

3.2 樣品的純化處理

本品成分復雜，用乙醇作溶劑提取后，在主峰前有大量的極性組分，為了減小其他組分的干擾，故用乙酸乙酯對樣品進行萃取，并且進行萃取次數(shù)的考察，測定結(jié)果表明，用乙酸乙酯萃取3次即可提取完全。

3.3 流動相的選擇

參考有關(guān)文獻，采用甲醇-0.4%磷酸溶液為流動相，比較不同比例的流動相，結(jié)果以甲醇-0.4%磷酸溶液（56∶44）為流動相山奈素與其相鄰的組分峰可獲得良好分離，且保留時間長短適中［7-8］。

本研究獲得的最佳水解條件穩(wěn)定、可行，可用于犬問荊中山奈素含量的提取測定，為犬問荊的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

［1］張貴君.常用中藥鑒定大全［M］.哈爾濱：科學技術(shù)出版社，1993：135.

［2］李淑惠，靳丹虹，李德坤，等.木賊科植物研究概況［J］.中草藥，2000，31（7）：13-14.

［3］閻兆，王芳，謝樹蓮.問荊屬3種藥用植物生物量的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34（23）：6 218-6 219.

［4］李時珍.本草綱目（上）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：1 013.

［5］中華人民共和國衛(wèi)生部.中國藥典［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：459.

［6］張憲，趙惠萍，張小茜，等.木賊質(zhì)量標準的研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（5）：48-49.

［7］呂武清，虞金寶，宋友晰，等.HPLC法測定滿山香中山奈素的含量［J］.中草藥，2004，35（4）：457-459.

［8］路玫，榮延平，蒙大平.反相高效液相色譜法測定苦丁茶含片中槲皮素和山奈素的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（1）：119-120.