紅花黃色素對氧自由基引起人紅細胞膜損傷的保護作用

周 璐，王媛凱，張立偉

（山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，山西太原030006）

紅花為菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥花瓣，為常用的活血化瘀中藥。紅花黃色素（SY）是紅花活血作用的主要有效部位，能夠改善心肌及腦組織微循環(huán)障礙，臨床上被大量應(yīng)用于冠心病和心絞痛的治療［1］。羥基紅花黃色素A（HSYA）和紅花黃色素B（SYB）是SY中含量較高的查耳酮類成分，也是SY發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)［2］。文獻報道，HSYA具有保護心腦［3-4］和拮抗血小板激活因子受體的作用，可明顯抑制血小板內(nèi)游離鈣離子濃度升高［5］；SYB可明顯抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠體外血小板聚集率并可延長大鼠凝血時間［6］。近來研究發(fā)現(xiàn)HSYA具有一定的抗氧化作用，可清除羥自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［7］。為了探討HSYA和SYB防治心血管疾病及抗氧化作用的機制，本文進行了HSYA和SYB對外源O2-.所致紅細胞膜氧化損傷的保護作用的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑 DPH探針（1，6-二苯基-1，3，5己三烯）為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，以四氫呋喃配成2 mmol/L溶液，裝入棕色瓶中置4℃冰箱中保存，臨用前用PBS稀釋成2×10-6mol/L；考馬斯亮藍試劑盒購自南京建成生物工程研究所；鄰苯三酚購自天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；維生素C為新鄉(xiāng)市常樂制藥有限公司生產(chǎn)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。新鮮血液由山西大學(xué)校醫(yī)院提供。PBS緩沖液（10 mM）的配制：NaCl 125 mM，KCl 2.7 mM，Na2HPO48 mM，KH2PO41.5 mM，glucose 10 mM，pH 7.4。

1.1.2 實驗儀器 CR-22G型高速冷凍離心機（HITACHI公司）；TGL-16M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；Cary-50Bio紫外可見分光光度計（美國瓦里安技術(shù)中國有限公司）；熒光光度計LS-50B（PE公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物的提取純化 HSYA、SYB的提取純化：紅花干燥粉末，加30倍水60℃提取2次，每次45 min，合并提取液，濾過，50℃減壓濃縮；將提取液過聚酰胺柱，水、30%乙醇、70%乙醇依次梯度洗脫，收集70%乙醇洗脫部分經(jīng)制備液相純化，得SYB純品；收集30%乙醇洗脫部分再經(jīng)反相柱材料MDS及制備液相純化，得HSYA純品。通過理化常數(shù)、化學(xué)方法及光譜數(shù)據(jù)（UV、IR、NMR、MS、CD 等）分析，鑒定了它們的結(jié)構(gòu)為 HSYA［8］及 SYB［9］。

1.2.2 紅細胞膜的制備 取新鮮健康人全血于1 000 r/min離心5 min，吸除上層白細胞及血小板，在洗凈的紅細胞中按照1∶40的比例加入預(yù)冷的5 mM pH

8.4 的PBS緩沖液，置于4℃冰箱中1 h，使之溶血。然后于4℃，15 000 r/min，離心30 min，離心后傾去離心管中的上層液體，下層品紅色沉淀反復(fù)洗滌至無色，最后懸浮于5 mM pH 8.4的PBS緩沖液中?？捡R斯亮藍法測膜蛋白含量，調(diào)蛋白濃度為400 mg/L。

1.2.3 氧化損傷紅細胞膜的制備 取制備好的紅細胞膜懸浮液，加入新鮮配制的鄰苯三酚溶液（終濃度為0.5 mM），混勻后37℃水浴 10 min，立即用6倍10 mM pH 7.4的PBS緩沖液洗滌并在4℃15 000 r/min離心10 min，沉淀即為氧化損傷紅細胞膜。

1.2.4 抗氧化損傷紅細胞膜的制備 取制備好的紅細胞膜懸浮液，加入不同濃度的HSYA和SYB，然后按“1.2.3”項下方法進行，沉淀即為抗氧化損傷紅細胞膜。同時以加入VitC制備的抗氧化損傷紅細胞膜作為陽性對照。

1.2.5 HSYA和SYB對人紅細胞膜流動性的影響取已制備好的正常紅細胞膜、氧化損傷紅細胞膜和抗氧化損傷紅細胞膜各1 mL，每組4管，分別加入含DPH 為 2 μM/L 的 PBS（10 mM，pH 7.4）溶液 3 mL 混勻，于37℃孵育30 min。離心除去DPH標(biāo)記殘液，用PBS（10 mM，pH 7.4）緩沖液洗滌1次，最后懸浮在 4 mL PBS（10 mM，pH 7.4）緩沖液中，采用熒光偏振法檢測DPH熒光各向異性，激發(fā)波長為362 nm，發(fā)射波長為432 nm。熒光各向異性（r）根據(jù)公式（1）計算：

式中Iυυ和Iυh分別代表與激發(fā)偏振光振動方向平行、垂直時的熒光偏振度，G 為校正因子（G=Ihυ/Ihh）。

表觀微黏度（η）根據(jù)公式（2）計算：

式中γ0為0.362。膜流動性用膜表觀微黏度表示，γ值越大，η值越大，則膜流動性越小，反之亦然。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析并進行多組組間比較，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié) 果

HSYA和SYB對紅細胞膜流動性的影響，結(jié)果見表1。

表1 HSYA和SYB對紅細胞膜流動性的影響 （n=4）

由表1可見，氧化組與正常對照組比較，其熒光各向異性值明顯增大（P<0.01），即表觀微黏度值明顯增大（P<0.01），紅細胞膜流動性明顯降低。而在膜制劑中預(yù)先分別加入了不同濃度的HSYA和SYB后再經(jīng)鄰苯三酚處理，其熒光各向異性值明顯降低（P<0.01），表觀微黏度明顯下降（P<0.01），紅細胞膜流動性明顯增大，并且存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

3 討論

細胞膜流動性與細胞膜的能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、物質(zhì)交換等重要功能密切相關(guān)［10］，適宜的膜脂流動性是維持生物膜正常功能的必要條件。大量事實證明，許多疾病與生物膜脂的流動性變化有關(guān)，如動脈粥樣硬化、高血脂、糖尿病、遺傳性球形紅細胞增多癥等患者的紅細胞膜的膜脂流動性明顯低于正常人［11］。

由于紅細胞持續(xù)暴露于充足的氧分壓環(huán)境中，富含與鐵結(jié)合的血紅蛋白，且膜中含有豐富的多不飽和脂肪酸，對氧化損傷較敏感，易導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的損傷和破壞，從而造成膜流動性的降低、紅細胞剛性增加，影響微循環(huán)灌注。細胞膜過氧化反應(yīng)在體內(nèi)的進程很難掌控，故本文用鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2-.）處理正常的和經(jīng)過藥物保護的紅細胞膜，觀察細胞膜流動性的變化。鄰苯三酚在堿性（pH 8.4左右）條件下自氧化產(chǎn)生O2-.，O2-.壽命極短，可通過連鎖反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基、單線態(tài)氧和過氧化氫，這些活性氧能直接或間接促使紅細胞膜脂質(zhì)過氧化，并導(dǎo)致膜流動性的降低［12］。

DPH是比較敏感的常用熒光探針，在水中熒光強度很低，當(dāng)嵌入到膜脂疏水區(qū)內(nèi)層時熒光強度可增加1 000倍。本實驗用氧自由基攻擊紅細胞膜后，紅細胞膜脂熒光各向異性值和表觀微黏度值均明顯上升，表明紅細胞膜經(jīng)氧自由基攻擊后膜脂流動性下降。預(yù)先將紅細胞膜與HSYA和SYB分別孵育，然后再用氧自由基進行攻擊，紅細胞膜的熒光各向異性值和表觀微黏度值均呈現(xiàn)下降趨勢，且存在劑量與效應(yīng)關(guān)系，提示HSYA和SYB能阻止紅細胞膜脂流動性的降低。本研究結(jié)果對進一步闡明紅花改善微循環(huán)的作用機制，開發(fā)天然的心腦血管藥物具有重要意義。

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