煙草靶斑病拮抗菌Y18鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-5119（2025）02-0035-10

1，熊有明2，2，劉峰3，母婷婷2，彭靜4，楊未2， 1，1，5*，1*

1.，；2.，；3.，；4.，；5.，）

Identification of Tobacco Target Spot Antagonistic Strain Y18 and Optimisation of Its Fermentation Conditions

XIAO Yuel， XIONG Youming2， XIAO Zhipeng2， LIU Feng3， MU Tingting2， PENG Jing4， YANG Wei2，LI Lingling1，MEI Siyi1，LIU Tianbo5*，TANG Qianjun1*

(1.CollgeofPlantProtectio，HunanAgriculturalUniversity，Changsha428，China;2.HengyangBranchofHunanoba

Company，Hengyang 41oo1，Hunan，China;3.ongzhouBranchofHunan TobaccoCompany，Yongzhou450o，Hunan，Cina; 4.HunanPlantProtectionInstitute，Changsha41l25，China;5.HunanTobaccoResearch Institute，Changsha414，China)

Abstract:Tobacoargetspotdisease，causedbyizoctoniasolaniisoneofthemostimportantfoliariseasesoftobaccoe screeningandidentificationofbocontrolstrains，along withtheestablshmentofbocontrolfermentationconditions，cantecicaly supprtthepreventionandcontrolof thedisease，andtheaplcationofbiocontrolbacteria.Inthisstudya previouslysreeed antagoniststrainY18 wasidentifiedthroughthecombiationofmorphology，physiology，biochemistryandmolecularbiology.Using theinhibitionrateofY18onthemycelialgrowthoftargettobaccoblotchasanindex，thefermentationmediumcomponentsand fermentationconditions withtheoptimalinibitoryefectofY18onthetarget bloth were screened byone-waytest andorthogonal test.The strain Y18 was identified as Bacillusvelezensis，with the inhibitionrate of 8 1 . 6 3 % on Rhizoctonia solani. It also had pronouncedinibitiononPhytophthoracapsici，F(xiàn)usariumgraminearum，Phytophthoraparasiticavar.nicotiane，Ralstona solanacearum and Pseudomonas syringaepv. tabaci，respectively，with the inhibitory rate reaching 7 9 . 0 8 % ，and the size of the inhibition circle for Ralstonia solanacearum up to 2 7 . 2 8 m m .The optimal fermentation medium， carbon source， nitrogen source and inorganicsalt wereNBmedium，sucrose，beef pasteandmagnesiumsulphate，respectively.Theoptimalmediumcomponents were sucrose， beef paste and magnesiumsulphate.The optimal fermentation conditions were p H=6 ，fermentation timeof ，inoculum amount of 5 % and fermentation temperature of . The resultscan provide a theoretical basis for the development and utilization of strain Y18 as a biocontrol agent.

Keywords: tobacco target spot; Bacillus velezensis; antagonistic effect; fermentation optimization

煙草靶斑病是由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的真菌病害[1]，在我國(guó)主要煙區(qū)均有發(fā)生[2-3]，給烤煙生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前該病害主要通過(guò)化學(xué)藥劑防治，雖然能得到有效控制，但污染環(huán)境并造成農(nóng)藥殘留，病原菌也會(huì)產(chǎn)生抗藥性[4-6]，而生物防治具有綠色、高效、無(wú)污染等特點(diǎn)，是防治煙草靶斑病的重要途徑。

目前已有多種生防菌用于煙草靶斑病的防治，包括鏈霉菌（Streptomyces）[7]、木霉（Trichoder-ma)[8-9]、伯克霍爾德菌(Burkholderia)[1o]和芽孢桿菌(Bacillus)[1]等。芽孢桿菌是一類在自然界中廣泛存在的重要生防微生物，對(duì)多種病原菌的繁殖具有抑制作用[12-13]，在防治病害的同時(shí)還能起到促生作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常被運(yùn)用于防治病害[14-16]。鐘朗等[11]從土壤中篩選得到的枯草芽孢桿菌GXLL-3319，其菌液對(duì)煙草靶斑病的相對(duì)防效達(dá) 6 6 . 0 7 % ：陳丹陽(yáng)等[17]篩選到貝萊斯芽孢桿菌CDY-6，對(duì)煙草靶斑病有顯著拮抗作用。但目前針對(duì)煙草靶斑病生物防治的研究還較少，有必要進(jìn)一步對(duì)煙草靶斑病菌進(jìn)行生防菌株的開(kāi)發(fā)。

本研究以對(duì)煙草靶斑病菌抑制效果較好的Y18菌株為研究對(duì)象，以菌株Y18對(duì)煙草靶斑病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用Y18生防菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株Y18和煙草靶斑病菌，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。植物病原菌：煙草靶斑病菌、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、煙草黑脛病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)、煙草根腐病菌(Fusariumcommune)、煙草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)均保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室；辣椒疫霉病菌(Phy-tophthoracapsici)、煙草青枯病菌(Ralstoniasolana-cearum）由彭靜老師惠贈(zèng)

1.2 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母粉 ，胰蛋白陳 ， ，蒸餾水 1 0 0 0 m L 。NB培養(yǎng)基：胰蛋白陳 1 0g ，牛肉膏 ， N a C l5 g ，蒸餾水 1 0 0 0 m L

SOB培養(yǎng)基：胰蛋白陳 ，酵母粉 ，NaCl0 . 5 g ， ， ，蒸餾水 。BPD培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g ，胰蛋白陳 ， N a C l 1 5 g ，蒸餾水 。YT培養(yǎng)基：胰蛋白陳 1 0g ，酵母粉 ，葡萄糖 ， N a C l5 g 蒸餾水 1 0 0 0 m L 。

1.3Y18菌株抑菌效果測(cè)定

1.3.1菌株Y18對(duì)煙草靶斑病菌的拮抗效果在PDA平板中央接入新鮮煙草靶斑病菌菌餅，在距中央菌餅約 2 c m 處點(diǎn)接 1 0 μ L Y18菌株菌液，以只接有新鮮煙草靶斑病菌菌餅的平板為對(duì)照，分別重復(fù)3次， 培養(yǎng)5d，觀察并記錄煙草靶斑病菌菌絲的生長(zhǎng)情況，并計(jì)算抑制率。抑制率公式[18]為：

抑制率 ( % ) = 對(duì)照菌絲直徑-處理菌絲直徑 × 1 0 0 對(duì)照菌絲直徑-菌餅直徑

1.3.2菌株Y18無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)煙草靶斑病菌的抑制效果將菌株Y18接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d， 8 0 0 0 r / m i n 、室溫離心 2 0 m i n ，取上清后用 0 . 2 2 μ m 的細(xì)菌過(guò)濾器將其過(guò)濾。將無(wú)菌發(fā)酵液分別以 5 % 、 1 0 % 、 1 5 % 、 2 5 % 的體積比例加至 左右的PDA固體培養(yǎng)基中，混勻后倒平板，在平板中央接入新鮮煙草靶斑病菌菌餅，每組重復(fù)3次，以未加入無(wú)菌發(fā)酵液平板為對(duì)照， 培養(yǎng) 5 d 并計(jì)算抑制率，方法同1.3.1。

1.4 菌株Y18鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定挑取Y18單菌落接種于LB固體培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)2d，觀察菌落形態(tài)和生長(zhǎng)情況，掃描電鏡觀察菌體形態(tài)，并對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色、芽胞染色和莢膜染色。同時(shí)，參照文獻(xiàn)[19]測(cè)定菌株Y18的生理生化特征。

1.4.2分子生物學(xué)鑒定采用16SrRNA基因通用引物 2 7 F ： -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 和1492R： -AAGGAGGTGATCCACCC 。擴(kuò)增體系 ( 2 5 μ L) ): Tap-Mix 1 2 . 5 μ L ，上下游引物各 0 . 5 μ L DNA模板 1 μ L ， 。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：在 下進(jìn)行預(yù)變性 5 m i n ，在 下變性 3 0 s ，在 下退火 3 0 s ，在 下延伸 9 0 s ，總循環(huán)數(shù)為35；在 下運(yùn)行 1 0 m i n 終止反應(yīng)， 保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行序列檢測(cè)。利用NCBI進(jìn)行BLAST同源比對(duì)，并采用MEGAX中的最大似然法(MaximumLikelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5菌株Y18抑菌譜測(cè)定

采用1.3.1中的方法，測(cè)定菌株Y18對(duì)小麥赤霉病菌、煙草黑脛病菌、煙草根腐病菌、辣椒疫霉病菌、煙草青枯病菌、煙草野火病菌的抑制效果，評(píng)估菌株Y18的抑菌廣譜性。

1.6菌株Y18最適發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

1.6.1不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)煙草靶斑病菌的抑制效果以 1 0 % 的接種量將菌株Y18分別接種于LB、NB、SOB、BPD、YT發(fā)酵培養(yǎng)基。 ， 1 8 0 r / m i n ，培養(yǎng) 4 8 h 。將發(fā)酵液 8 0 0 0 r / m i n 離心 2 0 m i n ，用 細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾上清，獲得無(wú)菌發(fā)酵液。在PDA固體培養(yǎng)基中分別混入 5 % 、 10 % 、 1 5 % 無(wú)菌濾液倒板，將煙草靶斑病菌接種在PDA平板中央，以不加無(wú)菌濾液的平板作為對(duì)照，每組3次重復(fù)，測(cè)定不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率。1.6.2不同碳源對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用以1.6.1中確定的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，將碳源分別替換為等量的蔗糖、甘油、山梨醇、葡萄糖、乳糖，將種子液以 1 0 % 的接種量分別接種至不同培養(yǎng)基中，每組重復(fù)3次， 、 1 8 0 r / m i n 培養(yǎng) 4 8 h 后，測(cè)定不同碳源的培養(yǎng)基對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率。

1.6.3不同氮源對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用以1.6.1中確定的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，碳源為篩選出的最佳碳源，將氮源分別用等量的牛肉膏、酵母膏、硝酸鉀、胰蛋白肺、硫酸氨替換，將種子液以 1 0 % 的接種量分別接種至不同培養(yǎng)基中，每組3次重復(fù)， 、 1 8 0 r / m i n 培養(yǎng) 4 8 h 后，測(cè)定不同氮源的培養(yǎng)基對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率。

1.6.4不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用將1.6.1中確定的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，碳源為篩選出的最佳碳源，氮源為篩選出的最佳氮源，將無(wú)機(jī)鹽分別用等量的硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鈣、硫酸亞鐵替換，將種子液以 10 % 的接種量分別接種至不同培養(yǎng)基中，每組重復(fù)3次， 、 1 8 0 r / m i n 培養(yǎng) 后，測(cè)定不同無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率。

1.6.5菌株Y18發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn) 方法，對(duì)所確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖、牛肉膏、硫酸鎂3個(gè)發(fā)酵組分進(jìn)行優(yōu)化，分別測(cè)定不同組別培養(yǎng)基對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率，確定菌株的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，為方便后續(xù)試驗(yàn)，將此組分培養(yǎng)基命名為NBL培養(yǎng)基。

1.7菌株Y18最適發(fā)酵條件篩選

以1.6中確定的最佳培養(yǎng)基NBL（蔗糖 牛肉膏 1 0g ，硫酸鎂 ，蒸餾水 1 0 0 0 m L ）作為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、溫度、 Δ p H 及接種量等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)處理重復(fù)3次。Y18菌株對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率測(cè)定方法同1.3.2。1.7.1不同接種量對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用將種子液以 1 % 、 3 % 、 5 % 、 7 % 、 9 % 的接種量分別接至NBL發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組重復(fù)3次， 、1 8 0 r / m i n 培養(yǎng) 4 8 h 后，分別測(cè)定不同接種量發(fā)酵濾液對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率。

1.7.2不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用以1.7.1中確定的最適接種量接種至NBL發(fā)酵培養(yǎng)基中， 、 1 8 0 r / m i n 分別培養(yǎng)12、24、36、48、60和 ，每組重復(fù)3次，分別測(cè)定不同時(shí)間發(fā)酵濾液對(duì)靶斑病菌的抑制率。

1.7.3不同發(fā)酵溫度對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用以最適接種量接種至NBL發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別置于25、28、31、34、 恒溫?fù)u床中， 1 8 0 r / m i n 培養(yǎng)至最佳發(fā)酵時(shí)間，分別測(cè)定不同培養(yǎng)溫度發(fā)酵濾液對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率。

1.7.4不同發(fā)酵pH對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用將NBL發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，以最適接種量接至不同 的NBL培養(yǎng)基中，選擇最適發(fā)酵時(shí)間和溫度， 1 8 0 r / m i n 培養(yǎng)，分別測(cè)定不同pH發(fā)酵濾液對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率。1.7.5菌株Y18發(fā)酵條件正交優(yōu)化依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn) 方法，對(duì)所確定最佳發(fā)酵條件中的接種量、時(shí)間、溫度、 進(jìn)行優(yōu)化，分別測(cè)定不同組別發(fā)酵條件對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率，確定菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2021進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，IBMSPSS

Statistics23進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，抑菌圈直徑采用最小顯著差數(shù)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1菌株Y18對(duì)煙草靶斑病的抑制作用

2.1.1Y18菌株對(duì)煙草靶斑病菌的拮抗效果菌株Y18可明顯抑制煙草靶斑病菌菌絲生長(zhǎng)，抑制率最高可達(dá) 8 1 . 6 3 % （圖1）。

2.1.2菌株Y18無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)煙草靶斑病菌的抑制效果無(wú)菌發(fā)酵液抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)菌發(fā)酵液體積比例越大，對(duì)煙草靶斑病菌菌絲生長(zhǎng)抑制越強(qiáng)(表1，圖2)。在 2 5 % 濾液體積比例下，能完全抑制煙草靶斑病菌菌絲生長(zhǎng)，添加菌株Y18無(wú)菌發(fā)酵液的煙草靶斑病菌菌絲產(chǎn)生扭曲、畸形、分枝增多等異?，F(xiàn)象(圖3)。

注：a，對(duì)照；b， 5 % c， 10 % d， 1 5 % e， Note:a，CK;b-e were the different volumeratio of 5 % 10 % 1 5 % and 2 5 % ，respectively.

Fig.2Inhibition of sterile fermentation brothat different concentrations on Rhizoctonia solani 注：a，正常菌絲形態(tài)；b，濾液濃度 2 5 % 下菌絲形態(tài)。 Note:a，normal myceliummorphology;b，mycelial morphology at 2 5 % filtrate concentration.

2.2 拮抗菌株Y18鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)觀察菌株Y18的單菌落在LB平板上呈白色近圓形，無(wú)黏液，僅有一層薄膜，外表面常有褶(圖4)。革蘭氏陽(yáng)性菌，中生芽孢橢圓形，有莢膜，掃描電鏡下菌體呈短桿狀(圖5)

2.2.2生理生化鑒定生理生化特征鑒定表明，菌株Y18能夠水解淀粉，分解明膠使之液化，接觸酶、氧化酶檢測(cè)陽(yáng)性，甲基紅、V.P試驗(yàn)、硝酸鹽還原均呈陽(yáng)性；吲哚試驗(yàn)陰性，代謝過(guò)程中不產(chǎn)生硫化氫(表2)。

注：a，革蘭氏染色；b，芽孢染色；c，莢膜染色；d，掃描電鏡。

Note:a，gram staining;b，spore staining; c， capsule staining;d， scanning electron microscope.

2.2.3分子生物學(xué)鑒定將Y18菌株16SrRNA基因測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST同源比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，菌株Y18與貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezen-sis的基因序列相似度達(dá) 9 9 % ，再利用MEGAX中最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株Y18與Bacillusvelezensis在同一分支上(圖6)。因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)結(jié)果，將菌株Y18鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

2.3菌株Y18抑菌譜測(cè)定

對(duì)菌株Y18進(jìn)行抑菌譜測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌、煙草黑脛病菌、煙草青枯病菌、煙草野火病菌等病原菌均有較好的抑制效果，對(duì)病原真菌抑制率最高可達(dá) 7 9 . 0 8 % ，對(duì)煙草青枯病菌的抑菌圈最大為 2 7 . 2 8 m m (表3，圖7），可見(jiàn)菌株Y18具有良好的抑菌廣譜性。

2.4菌株Y18最適發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

2.4.1不同培養(yǎng)基種類對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用用NB培養(yǎng)基發(fā)酵的Y18菌株無(wú)菌發(fā)酵液，對(duì)煙草靶斑病菌的抑制效果顯著高于其他培養(yǎng)基，在5 % 、 10 % 和 1 5 % 無(wú)菌發(fā)酵液下抑制率分別高達(dá)

Bacillus velezensis strain Pt0-RL4(OQ581570.1) Bacillus velezensis strain RT2(OQ586464.1) 99% Bacillus velezensis strain Pt-RP9(OQ581565.1) Bacillus velezensis strain Pto-RP7(OQ581564.1) Y18 97% Bacillusamyloliquefaciensstrain RM3(KX462881.1) 99% Bacillus amyloliquefaciens strain zzx45(KJo09435.1) Bacillus subtilis strain N2-10(CP098417.1) 99%Bacillus subtilis strain PK12(CP026039.1) Escherichia coli strain K12(LT899983) 0.02

注：同一圖中左側(cè)為植物病原菌平板對(duì)照，右側(cè)為菌株Y18對(duì)植物病原菌的抑制作用。a為辣椒疫霉病，b為煙草根腐病菌，c為小麥赤霉病菌，d為煙草黑脛病菌，e為煙草青枯病菌，f為煙草野火病菌。

Note:Teleftelotateotofapagesdtgtpaelototofstat ats Pseudomonas syringae pv.tabaci.

8 4 . 8 7 % 、 8 8 . 0 1 % 和 9 2 . 0 4 % ，因而選擇NB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基用于后續(xù)試驗(yàn)(圖8)。

1 0 % 無(wú)菌發(fā)酵液濃度下，不同供試碳源對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率依次為：蔗糖 山梨醇 > 甘油 葡萄糖 乳糖，以蔗糖為碳源時(shí)對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率最高，可達(dá) 8 8 . 2 2 % ，因此選擇蔗糖為最佳碳源(圖9)。

2.4.3不同氮源對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用在10 % 無(wú)菌發(fā)酵液濃度下，不同供試氮源對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率依次為：牛肉膏 > 酵母膏 > 硫酸氨>胰蛋白膚 > 硝酸鉀，以牛肉膏為氮源時(shí)抑制率最高，可達(dá) 9 0 . 0 8 % ，因此選擇牛肉膏為最佳氮源(圖10)。2.4.4不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用在10 % 無(wú)菌發(fā)酵液濃度下，不同供試無(wú)機(jī)鹽對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率依次為：硫酸鎂 > 磷酸氫二鉀 > 氯化鈉 ∣ > 氯化鈣 > 硫酸亞鐵，以硫酸鎂為唯一無(wú)機(jī)鹽時(shí)抑制率最高，為 91 . 2 4 % ，因此選擇硫酸鎂為最佳無(wú)機(jī)鹽(圖11)。

2.4.5菌株Y18發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化通過(guò)正交試驗(yàn)將蔗糖、牛肉膏、硫酸鎂這3個(gè)發(fā)酵組分設(shè)置成3因素3水平試驗(yàn)(表4)，共9組試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分配比進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明(表5，第7組試驗(yàn)對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率最高，可達(dá)到9 0 . 6 8 % ，與優(yōu)化前的發(fā)酵液NB相比，優(yōu)化后的抑菌率提高 1 0 . 4 2 % 。根據(jù) R 值大小可知，各因素對(duì)Y18菌株無(wú)菌發(fā)酵液抑菌效果影響的大小順序?yàn)椋赫崽?> 硫酸鎂 > 牛肉膏；根據(jù) k 值可知，最佳水平為A2B2C。因此，確定菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為：蔗糖 1 0 g ，牛肉膏 1 0 g ，硫酸鎂 ○

2.5菌株Y18最適發(fā)酵條件篩選

2.5.1不同接種量對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用在接種量為 5 % 時(shí)， 10 % 無(wú)菌發(fā)酵液濃度下對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率最高，可達(dá) 9 0 . 5 5 % ，因此選擇5 % 為最適接種量(圖12)。

2.5.2不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用在10 % 無(wú)菌發(fā)酵液濃度下， 1 2～4 8 h 的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)煙草靶斑病菌的抑制效果相差不大，但 3 6 h 的無(wú)菌發(fā)酵液抑制效果相對(duì)更好，抑制率達(dá) 91 . 4 9 % 因此選擇發(fā)酵 3 6 h 為最佳發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)(圖13)。

2.5.3不同發(fā)酵溫度對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用在10 % 無(wú)菌發(fā)酵液濃度下， 時(shí)Y18菌株發(fā)酵濾液對(duì)煙草靶斑病菌的抑制效果最好，可達(dá) 9 0 . 5 9 % 因此選擇 為最佳發(fā)酵溫度(圖14)。

2.5.4不同發(fā)酵pH對(duì)煙草靶斑病菌的抑制作用在10 % 無(wú)菌發(fā)酵液濃度下，pH為5時(shí)，Y18菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率最高，可達(dá)9 0 . 3 2 % （圖15)。而pH為3或11時(shí)抑制效果較差，說(shuō)明過(guò)酸或過(guò)堿性環(huán)境不利于Y18菌株生長(zhǎng)和抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。因此選擇最適發(fā)酵培養(yǎng)基pH為5。

2.5.5菌株Y18發(fā)酵條件正交優(yōu)化通過(guò)正交試驗(yàn)將接種量、時(shí)間、溫度和pH這4個(gè)發(fā)酵條件組分設(shè)置成4因素3水平試驗(yàn)(表6)，并選取共9組試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件組分配比進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明(表7)，第5組試驗(yàn)對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率最高，可達(dá)

9 2 . 7 1 % ，較優(yōu)化前提高 1 2 . 4 5 % 。根據(jù) R 值大小可知，各因素對(duì)Y18菌株無(wú)菌發(fā)酵液抑菌效果影響的大小順序?yàn)椋?p H > 溫度 > 時(shí)間 ∣ > 接種量。根據(jù) k 值可知，最佳水平為A2B3C2D1。因此，確定菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件組分為： p H=6 ，發(fā)酵時(shí)間 4 8 h ，接種量 5 % ，發(fā)酵溫度 ，后續(xù)將根據(jù)此發(fā)酵條件進(jìn)行試驗(yàn)。

3討論

芽孢桿菌是自然界中重要的有益微生物，很多菌株已被商業(yè)化開(kāi)發(fā)制備成生物殺菌劑、殺蟲(chóng)劑、除草劑等[20-21]。此外，許多芽孢桿菌還具有促生作用，其機(jī)制主要包括促進(jìn)植物吸收養(yǎng)分[22-23]，產(chǎn)生激素或者調(diào)節(jié)植株激素水平[24]，使植物體內(nèi)葉綠素含量升高[25]等。在植物病害防治中，芽孢桿菌展現(xiàn)出重要地位，且許多研究都表明芽孢桿菌具有極大的生防潛力。貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，在農(nóng)業(yè)上被廣泛利用，多用于植物病害的生物防治。劉蕾等[26]篩選出的貝萊斯芽孢桿菌BZ3，其發(fā)酵液對(duì)TMV的田間小區(qū)防效為 7 2 . 0 7 % 5劉涵斐等[27]分離到的貝萊斯芽孢桿菌F85，其無(wú)菌發(fā)酵液濃度為 20 % 時(shí)，對(duì)煙草炭疽病菌菌絲干質(zhì)量抑制率和分生孢子芽管畸形率達(dá) 100 % 。本研究鑒定出的貝萊斯芽孢桿菌Y18對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率可達(dá) 8 1 . 6 3 % ，高于鐘朗等[1]篩選出的枯草芽孢桿菌GXLL3319對(duì)煙草靶斑病菌的抑制效果。

芽孢桿菌屬產(chǎn)生廣泛的次生代謝產(chǎn)物，有助于植物病害控制，促進(jìn)植物發(fā)育，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景[28]，而菌株生長(zhǎng)情況及所分泌次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量與發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件密切相關(guān)[29-30]，因此，篩選菌株最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基和最優(yōu)發(fā)酵條件十分必要。相關(guān)發(fā)酵條件優(yōu)化的研究也較多，如馬云濤等[31]對(duì)貝萊斯芽孢桿菌JK2使用單因素結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化該菌條件后，得到最佳培養(yǎng)條件為： p H=6 . 6 ，轉(zhuǎn)速 2 0 8 r / m i n ，溫度 ，接種量 3 . 9 % ；呂天宇等[32]對(duì)貝萊斯芽孢桿菌FX1培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)培養(yǎng)基組分為：玉米淀粉 ，酵母膏 ，磷酸二氫鉀 ，硫酸錳 0 . 0 0 1 g ，最適培養(yǎng)條件為： p H=7 . 5 ，轉(zhuǎn)速 1 5 0 r / m i n ，溫度 ；蘭成忠等[33]對(duì)貝萊斯芽孢桿菌FJ17-4進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化研究，得到最佳發(fā)酵條件為： p H=7 ，溫度 ，接種量 1 2 . 5 % ，轉(zhuǎn)速 1 8 0 r / m i n ，發(fā)酵時(shí)間 4 0 h 。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出貝萊斯芽孢桿菌Y18發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為：蔗糖 ，牛肉膏 ，硫酸鎂 ；最優(yōu)發(fā)酵條件為： p H=6 ，發(fā)酵時(shí)間4 8 h ，接種量 5 % ，發(fā)酵溫度 。由此可見(jiàn)，不同生防菌的最適生長(zhǎng)條件和最適抑菌條件會(huì)有所差異[34]，每株菌都有自已最佳的生長(zhǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)需求，且菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量會(huì)隨著發(fā)酵條件的改變而發(fā)生變化[35]。后續(xù)將進(jìn)一步在本研究的基礎(chǔ)上分離鑒定其次生代謝產(chǎn)物，深入探究其抑菌機(jī)理，為生防菌劑的開(kāi)發(fā)提供理論支撐。

4結(jié)論

本研究鑒定出對(duì)煙草靶斑病菌有顯著拮抗效果的菌株Y18為貝萊斯芽孢桿菌。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基NB的基礎(chǔ)上，確定了菌株發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基組分和最優(yōu)發(fā)酵條件。發(fā)酵優(yōu)化后能顯著提高對(duì)煙草靶斑病菌的抑制率，該研究結(jié)果為后續(xù)分離鑒定Y18菌株的次生代謝產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為將來(lái)菌株Y18作為生防菌劑運(yùn)用到生產(chǎn)中提供了理論依據(jù)，節(jié)約了時(shí)間和成本。

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