DAP-seq和RNA-seq揭示轉(zhuǎn)錄因子APETALA3-3調(diào)控鐵皮石斛花型變化機(jī)理

摘""要：蘭花唇瓣是特化的花瓣，因其多樣性具有極大觀賞價值和生物學(xué)價值，但其形成機(jī)理迄今仍未解決。APETALA3-3（AP3-3）是花器官身份基因，與蘭花唇瓣形成有關(guān)，但其如何調(diào)控蘭花唇瓣多樣性形成機(jī)理目前未見報道。本研究以鐵皮石斛野生型植株和鐵皮石斛DoAP3-3過表達(dá)植株的花器官為研究對象，通過DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，從鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3調(diào)控下游靶基因的角度探討唇瓣多樣性形成機(jī)制。結(jié)果表明：共鑒定出MADS6、NAC029、NAC054、WOX3、AS2、ERECTA、AG等7個關(guān)鍵候選靶基因，這些靶基因可能通過特異性調(diào)控或在DoAP3-3的作用下與其他基因互作調(diào)控花器官發(fā)育和花型發(fā)育。酵母單雜交實(shí)驗驗證表明轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3與MADS6之間存在相互作用，影響花型發(fā)育。該研究為初步解析花器官特征基因DoAP3-3與其靶基因之間的調(diào)控機(jī)制，探究蘭科植物中高度特化和多樣化的花形態(tài)形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：APETALA3-3；鐵皮石斛；DNA親和純化測序；DAP-seq；轉(zhuǎn)錄組測序；花型發(fā)育中圖分類號：S682.31""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Mechanism"of"Transcription"Factor"APETALA3-3"Regulating"Floral"Morphogenesis"in"Dendrobium"officinale"Based"on"DAP-Seq"and"RNA-"seq"Analysis

SONG"Yarong，nbsp;ZHU"Hongfeng，"AO"Die，"LIU"Anqi，"LU"Deyin，"HE"Fengmei*

College"of"Horticulture"and"Landscape，"Yunnan"Agricultural"University，"Kunming，"Yunnan"650201，"China

Abstract："The"diversity"of"orchid"labellum，"a"specialized"petal，"has"great"ornamental"and"biological"value，"but"the"formation"mechanism"has"not"been"solved"so"far."APETALA3-3"（AP3-3）"is"a"floral"organ"identity"gene，"which"is"related"to"the"formation"of"orchid"labellum，"but"there"is"no"report"on"how"it"regulating"the"formation"mechanism"of"orchid"labellum"diversity."In"this"project，"wild"type"and"DoAP3-3"overexpressing"floral"organs"of"Dendrobium"officinale"were"used"as"the"research"objects"to"explore"the"formation"mechanism"from"the"perspective"of"transcription"factor"DoAP3-3"regulating"downstream"target"genes"through"DAP-seq"and"RNA-seq"joint"analysis."The"results"showed"that"a"total"of"7"key"candidate"target"genes，"MADS6，"NAC029，"NAC054，"WOX3，"AS2，"ERECTA，"AG"were"identified，"which"may"regulate"floral"organ"development"and"floral"morphogenesis"development"under"the"action"of"DoAP3-3"by"specific"regulation"or"interaction"with"other"genes."The"interaction"between"transcription"factor"DoAP3-3"and"MADS6"was"verified"by"yeast"one-hybrid"experiment，"which"further"affecting"floral"morphogenesis"development."This"study"would"lay"a"foundation"for"preliminary"analysis"of"the"regulatory"mechanism"between"DoAP3-3"and"its"target"genes，"and"exploring"the"formation"mechanism"of"highly"specialized"and"diversified"flower"morphology"in"Orchidaceae.

Keywords："APETALA3-3;"Dendrobium"officinale;"DNA"affinity"purification"sequencing;"DAP-seq;"RNA-seq;"flower"morphologies"development

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.004

石斛屬（Dendrobium"Sw.）是蘭科最大屬之一，兼具觀賞價值和藥用價值，也是四大觀賞蘭花屬之一。目前學(xué)者們已掌握了鐵皮石斛（Dendr obium"officinale）瓶內(nèi)開花技術(shù)及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，可在分子層面對其花器官特異性進(jìn)行研究，因此鐵皮石斛是研究花器官發(fā)育的極好模型。

已有研究表明MADS-box基因作為植物花器官的發(fā)生發(fā)育與形態(tài)構(gòu)造的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)在花器官發(fā)育不同階段形成復(fù)雜復(fù)合物來調(diào)控花器官的發(fā)育，因而成為花器官研究最廣泛的基因家族[1-2]。經(jīng)典的“ABC”模型在模式植物擬南芥和金魚草花器官突變體的研究中被提出[3-4]，隨著矮牽牛和擬南芥中D類基因[5-6]及E類基因[7-8]的發(fā)現(xiàn)和鑒定，進(jìn)一步將花發(fā)育模型擴(kuò)展到“ABCDE”模型，即A+E共同控制萼片的形成，A+B+E共同控制花瓣的形成，B+C+E調(diào)控雄蕊的形成，C+E調(diào)控心皮的形成，D+E調(diào)控胚珠的形成。除“ABCDE模型”[9]外，“蘭花編碼”[10-11]、“Homeotic"Orchid"Tepal”模型[12]和“花被（P）編碼”[13]模型被廣泛認(rèn)為是解釋蘭花花被器官身份特征的假說。

APETALA3-3（AP3-3）是MADS-box基因家族中B類基因[14-15]。有研究表明在耬斗菜和黑種草中沉默AP3-3基因，僅導(dǎo)致其花瓣向萼片的同源異型轉(zhuǎn)變[16]，已有研究鑒定和預(yù)測了毛茛科多個物種中花瓣特征基因AP3-3的下游靶基因[17]。蘭科植物的唇瓣是特化的花瓣，是蘭科植物獨(dú)有的特異性器官，也是蘭科植物的主要觀賞器官和昆蟲傳粉器官，而AP3-3已被證明是蘭花唇瓣發(fā)育的主要轉(zhuǎn)錄因子，但目前AP3-3在蘭科植物中的研究較少。因此研究AP3-3在蘭花中參與唇瓣多樣性形成的差異表達(dá)調(diào)控機(jī)理，不僅能揭示唇瓣的起源與進(jìn)化等機(jī)制，還為遺傳操作改變花型、培育蘭花新品種和蘭花的保育等方面奠定基礎(chǔ)，在觀賞園藝和資源保護(hù)等領(lǐng)域具有更加廣闊的應(yīng)用前景。

DNA親和純化測序（DNA"affinity"purification"sequencing，DAP-seq）分析作為目前新開發(fā)的一種體外檢測TF-DNA（transcription"factor，TF）互作的分析方法，成功將體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗轉(zhuǎn)移到體外，極大地提高了DNA結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的效率，可以高通量精確定位植物體內(nèi)基因組中轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)[18-20]。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)被用于研究基因表達(dá)、調(diào)控和育種新基因的挖掘[21-22]。利用轉(zhuǎn)錄組與DAP-seq共同研究轉(zhuǎn)錄因子－靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，鑒定鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3下游靶基因，能夠精準(zhǔn)地挖掘出對表型具有顯著貢獻(xiàn)的核心基因。

1""材料與方法

1.1""材料

鐵皮石斛野生型植株（WT）和鐵皮石斛DoAP3-3過表達(dá)植株（OE）來自于本實(shí)驗室前期研究。鐵皮石斛新鮮葉片采自云南省林業(yè)和草原科學(xué)院石斛種植基地。

1.2""方法

1.2.1""DNA親和純化測序""提取鐵皮石斛葉片DNA，并將其片段化，用磁珠篩選目標(biāo)片段后利用建庫試劑盒（NEXTflex"Rapid"DNA-Seq"Ki）構(gòu)建文庫；構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3的halo-tag體外表達(dá)質(zhì)粒，利用麥胚系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)。將純化后的轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3和親和標(biāo)簽融合蛋白與基因組DNA文庫共同孵育，用Halo"Tag特異性磁珠，將目的蛋白和DNA復(fù)合物進(jìn)行提取和純化，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用QubitTM"dsDNA-HS"Assay"Kit檢測DNA文庫質(zhì)量，測序由武漢愛基百客生物科技有限公司完成。

1.2.2""DAP-seq測序數(shù)據(jù)分析""使用Fastqc（version："0.11.5）軟件對原始數(shù)據(jù)質(zhì)控處理，使用Trimmomatic（version："0.36）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，使用BWA（version："0.7.15-r1140）軟件將clean"reads數(shù)據(jù)比對到Dendrobium"catenatum（GCF_"001605985.2）參考基因組上，利用MACS（version："2.1.1.20160309）軟件在基因組范圍內(nèi)檢測轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3相對于對照所富集的峰，篩選顯著性富集的峰，篩選閾值為q"valuelt;0.001且Fold"Change大于2。對peak關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行GO及KEGG分析。利用Homer、MEME、MEME-ChIP軟件分析轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3靶標(biāo)基因富集motif。利用IGV軟件對結(jié)合峰進(jìn)行可視化分析，紅色峰為重復(fù)1，藍(lán)色峰為重復(fù)2，綠色峰為陰性對照（input）。每個基因的外顯子－內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和方向（箭頭）顯示在面板的底部。紅色箭頭表示靶基因TSS上下2000"bp范圍內(nèi)結(jié)合情況。[0-50]代表結(jié)合的強(qiáng)度，通過峰的高度來反映。

1.2.3""轉(zhuǎn)錄組測序""對鐵皮石斛野生型植株（WT）和鐵皮石斛DoAP3-3過表達(dá)植株（OE）分別提取不同時期（從花芽到完全開放）混合樣花蕾RNA，利用Illumina高通量測序平臺進(jìn)行RNA測序，測序由北京擎科生物科技股份有限公司完成。

1.2.4""轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析""使用Fastqc對測序得到的raw"data進(jìn)行過濾，利用Hisat將過濾得到的clean"reads與參考基因組Dendrobium"catenatum（GCF_001605985.2）進(jìn)行序列比對。用DEGseq軟件對鐵皮石斛DoAP3-3過表達(dá)植株和WT植株測序結(jié)果進(jìn)行基因表達(dá)量差異分析，以Fold"Change≥2且FDRlt;0.01篩選差異表達(dá)基因。將獲得的差異基因與NR、eggNOG、GO、KEGG、Swissprot和Pfam等六大公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得在各數(shù)據(jù)庫的注釋信息，篩選花器官發(fā)育相關(guān)差異表達(dá)基因。

1.2.5""啟動子順式作用元件生物信息學(xué)分析""利用植物順式元件數(shù)據(jù)庫Plant"CARE對關(guān)鍵候選靶基因啟動子序列的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測分析，用TBtools軟件進(jìn)行可視化分析。

1.2.6""酵母單雜交互作實(shí)驗""以鐵皮石斛DoAP3-3過表達(dá)植株的cDNA為模板，擴(kuò)增DoAP3-3編碼序列，連接到pGADT7載體（Clontech，"USA）中，得到pGADT7-DoAP3-3，作為獵物。以鐵皮石斛MADS6基因DNA為模板，擴(kuò)增目的基因啟動子的特異性DNA序列，克隆到pHIS2載體（Clontech，"USA）中，得到pHIS2-MADS6，作為誘餌。將構(gòu)建到pHIS2載體上的MADS6基因及構(gòu)建到pGADT7的DoAP3-3基因，通過共轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y187。分別從轉(zhuǎn)化反應(yīng)的平板上隨機(jī)挑取3個單菌落，OD600=0.002，稀釋（100、10?1、10?2）點(diǎn)板至對應(yīng)的不添加histidine，但添加不同濃度（0、2.5、5、10、20、30、40、50、75、100"mmol/L）HIS3蛋白競爭性抑制劑3-AT（3-amino-1，2，4-"triazole）的缺陷型平板上，30"℃恒溫培養(yǎng)3"d，篩選合適濃度，消除自激活現(xiàn)象。將實(shí)驗組（pHIS2-MADS6+"pGADT7-DoAP3-3）、陰性對照組（pHIS2-MADS6+"pGADT7）、陽性對照組（pGAD53m+pHIS2-p53）驗證成功的單菌落，用2"mL的ddH2O水重懸，OD600=0.002，濃度設(shè)置為3個梯度100、10?1、10?2，吸取10"μL分別點(diǎn)板到SD-TL（-trp，-leu）、SD-TLH（-trp，-leu，-his）、SD-TLH+40"mmol/L"3AT培養(yǎng)基上（參照Clontech公司的PT3024-1/Yeast"Protocols"Handbook），每個板點(diǎn)3個點(diǎn)，30"℃恒溫培養(yǎng)3～5"d。

2""結(jié)果與分析

2.1""鐵皮石斛野生型植株和DoAP3-3過表達(dá)植株花器官形態(tài)比較分析

鐵皮石斛野生型植株和DoAP3-3過表達(dá)植株花型差異如圖1所示，其花型差異只表現(xiàn)在花瓣和萼片分布以及唇瓣的大小和顏色上，其他形態(tài)無明顯變化。過表達(dá)花朵的2片花瓣逆時針旋轉(zhuǎn)大于90°，與萼片幾乎重疊，花瓣和萼片或鑲嵌或融合；過表達(dá)花朵的唇瓣較大，且唇瓣腹部近軸凸起消失較為平展，遠(yuǎn)軸處紫色斑點(diǎn)消失。

2.2""DAP-seq測序數(shù)據(jù)結(jié)果分析

提取鐵皮石斛葉片DNA進(jìn)行DAP-Seq測序，獲得DAP-seq原始數(shù)據(jù)。將鐵皮石斛clean"reads數(shù)據(jù)比對到Dendrobium"catenatum（GCF_"001605985.2）基因組序列，比對率達(dá)99.72%，并得到轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3結(jié)合的peaks。對所有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的peaks進(jìn)行匯總和分類，在基因組范圍內(nèi)共獲得175"468個peaks，平均peaks長度為399.43"bp，對peaks各功能元件分布個數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，其中6579個peaks位于啟動子區(qū)域上，占peaks總數(shù)的3.75%（圖2），有56.85%位于基因間區(qū)，3.75%峰位于啟動子區(qū)域，5′-非翻譯區(qū)和3′-非翻譯區(qū)分布最少（圖3A）。位于啟動子區(qū)域上的peaks有90.74%的峰都結(jié)合到啟動子上（圖3B）。這表明DoAP3-3是具有DNA結(jié)合能力和基因調(diào)控活性的轉(zhuǎn)錄因子。

2.3""DAP-seq鑒定轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3結(jié)合花發(fā)育下游潛在靶標(biāo)基因分析

在啟動子范圍內(nèi)共篩選出5768個潛在結(jié)合靶基因，對應(yīng)6579個peaks，其中與花器官及花型發(fā)育相關(guān)的潛在靶基因共82個，對應(yīng)94個peaks。這些潛在結(jié)合靶基因包括轉(zhuǎn)錄因子家族基因和功能性蛋白基因，如MYB-related、MADS-MIKC、AP2/ERF-ERF、B3、B3-ARF、C2C2-YABBY、HB-BELL、MADS-M-type、NAC等轉(zhuǎn)錄因子家族基因（圖4）；TAA1、DCR、ERECTA等功能性蛋白基因。

對DAP-seq檢測到的與花發(fā)育相關(guān)的基因進(jìn)行功能注釋，篩選Plt;0.05前30條途徑進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示，鐵皮石斛富集GO條目主要是生物過程，包括繁殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、花器官發(fā)育、花輪發(fā)育等生物過程（圖5）。

2.4""轉(zhuǎn)錄組測序分析

對鐵皮石斛野生型植株和DoAP3-3"過表達(dá)植株分別提取生殖生長期花蕾RNA，利用Illumina高通量測序平臺進(jìn)行RNA測序，共產(chǎn)出15.88"Gb數(shù)據(jù)，Q30堿基百分比在95.98%及以上。分別將各樣品的clean"reads與參考基因組進(jìn)行序列比對，比對效率為87.82%～91.43%。

2.5""轉(zhuǎn)錄組測序分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3調(diào)控花發(fā)育相關(guān)差異表達(dá)基因

為了鑒定在鐵皮石斛中受DoAP3-3轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)﹁F皮石斛野生型植株（WT）和DoAP3-3過表達(dá)（OE）植株花蕾進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，共發(fā)現(xiàn)8101個差異表達(dá)基因，其中3845個基因下調(diào)表達(dá)、4256個基因上調(diào)表達(dá)（圖6A）。進(jìn)一步對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)86個與花發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中32個基因上調(diào)差異表達(dá)，54個基因下調(diào)差異表達(dá)（圖6B）。AS2、MADS16、NAC054、DL、LFL1、GI等基因在過表達(dá)植株中的表達(dá)量較低，均低于野生型植株。WOX3、FT、FZP、GATA22、ENDO2等基因在過表達(dá)植株中的表達(dá)量較高，均高于野生型植株。

2.6""DAP-seq結(jié)合RNA-seq分析轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3調(diào)控花器官及花型發(fā)育的潛在直接靶基因

將DAP-seq中鑒定到的與花發(fā)育相關(guān)的82個靶標(biāo)基因與過表達(dá)植株和野生型植株RNA-seq分析中的85個DEGs進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)30個共同的基因（圖7A）。在DoAP3-3過表達(dá)植株中有19個基因為正向調(diào)控的靶標(biāo)基因，11個為負(fù)向調(diào)控的靶標(biāo)基因（圖7B）。這些靶標(biāo)基因按照功能分類可分為3類：第一類與花發(fā)育階段中的成花誘導(dǎo)有關(guān)，其中NAC035、FT、LFL1、LHY、ZHD4、ZTL、AOD3、RVE8參與調(diào)控開花時間；第二類與花器官原基形成即花器官發(fā)育有關(guān)，其中MADS6影響花分生組織決定性花器官發(fā)育、花器官形成及花輪形態(tài)發(fā)生，F(xiàn)ZP、BAM1決定花分生組織身份，指定花器官身份，AG、CYP40參與花早期發(fā)育過程中器官身份的控制，在維持花分生組織的決定性中發(fā)揮作用，DL決定心皮身份和花分生組織，ATH1控制花器官與莖之間的邊界形成，影響花器官脫落，TAA1、FHA2影響花器官、雄蕊發(fā)育，LUG調(diào)節(jié)花器官的發(fā)育，JMJ706參與花形態(tài)發(fā)生；第三類參與花發(fā)育階段花器官發(fā)育成熟即花型發(fā)育，其中NAC054、NAC029影響花朵發(fā)育，WOX3參與萼片形成，AS2影響花瓣發(fā)育，ERECTA調(diào)控花形態(tài)和花序結(jié)構(gòu)，DCR影響毛狀體形態(tài)發(fā)生。在DoAP3-3過表達(dá)植株中WOX3、NAC029、MADS6、ERECTA、AG表達(dá)量均高于野生型，AS2、NAC054的表達(dá)量較低（圖8，圖9），結(jié)合過表達(dá)植株花型表型變化與其基因功能，這些基因極有可能是轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3的關(guān)鍵下游靶基因。

2.7""轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3調(diào)控花型關(guān)鍵候選靶基因分析

本研究從鑒定出的直接靶標(biāo)基因中挑選出7個與花型發(fā)育密切相關(guān)的靶基因MADS6、NAC029、NAC054、WOX3、AS2、ERECTA、AG作為關(guān)鍵候選靶基因。對這7個靶基因進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果顯示，除了含有多個轉(zhuǎn)錄起始核心元件TATA-box和CAAT-box外，這7個基因啟動區(qū)域分布的順式作用元件與植物激素反應(yīng)、光反應(yīng)、植物生長發(fā)育、生物和非生物脅迫反應(yīng)有關(guān)（圖10）。

為了更深入地了解DoAP3-3的DNA結(jié)合特性，本研究使用MEME和MEME-CHIP軟件對7個候選靶基因的啟動子與peak重疊序列分別進(jìn)行motif分析和motif富集分析。motif分析發(fā)現(xiàn)，除AG外其余靶基因均能與motif1、motif2、motif3結(jié)合（圖11）。motif富集分析顯示，富集到BASIC"PENTACYSTEINE（BPC）TFs的結(jié)合基序的GA/CT-rich（圖12）。

為了進(jìn)一步驗證DoAP3-3調(diào)控花型發(fā)育的直接作用，本研究選擇在DAP-seq分析中啟動子區(qū)域顯示出富集結(jié)合位點(diǎn)（圖9，圖11）的MADS6基因作進(jìn)一步驗證，通過酵母單雜交實(shí)驗驗證DoAP3-3與其之間是否存在相互作用以調(diào)控花型變化。由圖13可知，陽性對照（pGAD53m+"pHIS2-p53）在SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+"40"mmol/L"3AT平板上均能正常生長；陰性對照組（pHIS2-MADS6+pGADT7）在SD-TL、SD-TLH平板上能正常生長，在SD-TLH+40"mmol/L"3AT平板上不生長；實(shí)驗組（pHIS2-MADS6+pGADT7-"DoAP3-3）在SD-TL、SD-TLH平板上能正常生長，在SD-TLH+40"mmol/L"3AT平板微弱生長，表明DoAP3-3與酵母中MADS6的啟動子存在相互作用。

3""討論

花是被子植物獨(dú)有的非常重要的觀賞及生殖器官?；ㄆ鞴僭诖笮　⑿螒B(tài)、顏色等方面均有差異，但決定花器官身份特性的潛在遺傳和分子機(jī)制是高度保守的，花器官的基本身份特征由一套核心的基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)決定，這些基因通過調(diào)節(jié)不同下游基因集的表達(dá)來控制花器官的發(fā)育和特征，而這種調(diào)控機(jī)制涉及復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)和環(huán)境影響，以確?；ㄆ鞴僭诒３只旧矸萏卣鞯耐瑫r，表現(xiàn)出豐富的特異性，如蘭科植物由花瓣特化而來的唇瓣。

MADS6在水稻中是AGL6-like的同源基因，調(diào)節(jié)花器官身份和花分生組織決定性。在AGL6-like突變體的花中，內(nèi)稃和漿片的身份受到干擾，并觀察到漿片-雄蕊的鑲嵌器官[23]；TSAI等[24]在蝴蝶蘭中分離得到了1個GLOBOSA/"PISTILLATA樣基因PeMADS6，PeMADS6的表達(dá)集中在萼片、花瓣和唇瓣原基中，通過異位過表達(dá)PeMADS6的擬南芥植物的花顯示出花瓣狀萼片的形態(tài)。有研究表明，靶基因NAC054的同源基因CUC1突變會導(dǎo)致花器官的輕微融合，而雙重突變體（CUC1和CUC2同時突變）則表現(xiàn)出嚴(yán)重的花器官融合現(xiàn)象[25]。AG作為MIKCc型MADS-box家族中的C類基因，不僅控制雄蕊、心皮的分化和發(fā)育，還調(diào)控花分生組織的終止[26-27]。在AG基因突變體植株中，WUS基因的高調(diào)表達(dá)能夠誘導(dǎo)花分生組織發(fā)育過程產(chǎn)生不確定性，使得AG基因突變體植株的花器官出現(xiàn)只含萼片和花瓣，且數(shù)量不確定的輪軸，產(chǎn)生“花嵌花”的表型[28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DoAP3-3過表達(dá)植株花朵表型中出現(xiàn)了花瓣-萼片的鑲嵌器官，MADS6、AG基因在過表達(dá)植株花朵中的表達(dá)量顯著高于野生型，NAC054在野生型和過表達(dá)植株中的表達(dá)量均較低，在過表達(dá)植株中表達(dá)量幾乎為0。因此，過表達(dá)植株花朵出現(xiàn)花瓣-萼片鑲嵌器官可能是轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3正調(diào)控MADS6、AG基因，鑲嵌器官可能是花瓣狀萼片，也可能是DoAP3-3負(fù)調(diào)控NAC054造成花瓣和萼片基部融合現(xiàn)象。

PRS是WOX3的一個同源基因，在PRS突變體中，PRS基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致側(cè)生萼片發(fā)育受到抑制，萼片邊緣細(xì)胞缺失，側(cè)生萼片缺失或變小，導(dǎo)致發(fā)育不對稱，從而造成花器官形態(tài)異常等現(xiàn)象[29]。本研究獲得的DoAP3-3過表達(dá)植株花朵中，花器官萼片左右兩側(cè)大小不一，右側(cè)萼片明顯大于左側(cè)萼片，且WOX3基因在野生型植株花朵中不表達(dá)，在過表達(dá)植株花朵中低表達(dá)，這表明WOX3基因的過表達(dá)和低表達(dá)均會影響萼片發(fā)育。AS2[30]作為AS2/"LOB（基因家族的成員，除了在葉片極性形成中調(diào)節(jié)外，在花發(fā)育中具有獨(dú)立的功能[31]。AS2與ASL[32]相互作用共同調(diào)控花瓣的近端-遠(yuǎn)端對稱性，從而影響花瓣形態(tài)和功能。在單突變體（AS2或ASL1）中，花瓣的形態(tài)發(fā)育異常并不明顯，但在雙突變體（AS2和ASL1）中，花瓣的形態(tài)異常更加顯著；ASL1和AS2的過表達(dá)會導(dǎo)致BP表達(dá)的下調(diào)，而BP的過表達(dá)則會導(dǎo)致花瓣形態(tài)異常，如花瓣變長和向外卷曲，因此ASL1和AS2通過抑制KNOX基因（如BP）的表達(dá)來調(diào)控花瓣的極性[33]。在某些極性異常的花瓣中，由于細(xì)胞擴(kuò)展和分化異常導(dǎo)致花瓣基部可能出現(xiàn)膨大現(xiàn)象；或花瓣可能偏離正常位置，導(dǎo)致花對稱性破壞；或?qū)е禄ò昱c萼片等其他花器官的重疊現(xiàn)象，影響花的整體形態(tài)。因此AS2可能通過與其他基因相互作用，影響花瓣和萼片的近端-遠(yuǎn)端極性，在維持花器官正常形態(tài)和對稱性中發(fā)揮重要作用。

NAP作為NAC029的同源基因，在模式植物擬南芥中已被鑒定為是花同源基因APETALA3/"PISTILLATA的直接靶標(biāo)，參與調(diào)控花瓣和雄蕊的形成，該研究在擬南芥中敲除了AP3-3，導(dǎo)致花瓣被萼片狀的器官替代，雄蕊被心皮狀的器官替代，通常與第四輪的心皮融合[34]。而NAP基因的過表達(dá)會造成花瓣和雄蕊生長受抑制，導(dǎo)致花瓣短小且雄蕊縮短，因此NAP正常表達(dá)是保證花瓣和雄蕊細(xì)胞適時擴(kuò)張和器官成熟的關(guān)鍵。本研究鑒定出NAC029在過表達(dá)植株中的表達(dá)量高于野生型，NAC029與NAP基因?qū)儆谕椿?，這表明其功能可能在一定程度上是保守的，可能存在保守的TF-Target關(guān)系，因此推測NAC029或許是轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3的關(guān)鍵靶基因之一。

ERECTA基因影響細(xì)胞分裂的速率和模式，被認(rèn)為是植株在不同發(fā)育環(huán)境下的生長調(diào)節(jié)因子，ERECTA編碼一個富含亮氨酸重復(fù)片段的類受體絲氨酸/蘇氨酸激酶，它與細(xì)胞的增殖有關(guān)并且被認(rèn)為是植物生長因子受體[35]。在ER突變體中，花器官的細(xì)胞分裂速率降低會導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少；ER基因的過表達(dá)會促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)展。在過表達(dá)ER基因的植物中，細(xì)胞分裂速率加快，細(xì)胞體積增大，從而導(dǎo)致組織和器官的增大，這表明ER基因在維持正常的細(xì)胞分裂速率中發(fā)揮重要作用[36]。大多數(shù)花器官是從變態(tài)葉發(fā)育而來的，ER可以通過控制花瓣細(xì)胞增殖來調(diào)節(jié)花瓣的形狀和大小，有研究者推測ER可能是控制不同植物花器官形態(tài)差異的主要因素[37]。蘭科植物唇瓣是花瓣特化而來，在DoAP3-3過表達(dá)花器官中，ERECTA的表達(dá)量顯著高于野生型，且ERECTA在啟動子范圍內(nèi)有2個結(jié)合峰，與轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3結(jié)合強(qiáng)度較強(qiáng)，結(jié)合其功能特征，這或許可以解釋過表達(dá)植株唇瓣比野生型唇瓣明顯增大的原因。

本研究成功鑒定出轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3的7個靶標(biāo)基因，DoAP3-3通過結(jié)合GA/CT基序來調(diào)控這7個靶基因的表達(dá)。CArG"box"motif"[CC"（A+"T-rich）"6GG]是AP3-3最常見的結(jié)合位點(diǎn)[17]，MADS結(jié)構(gòu)域蛋白已被證明在體外可以與非CArG盒序列結(jié)合[38]，這意味其在基因表達(dá)調(diào)控中有更廣泛的多樣性和復(fù)雜性。即使這些基因調(diào)控序列中不存在CArG盒，DoAP3-3結(jié)構(gòu)域蛋白仍然有可能與其他基序結(jié)合，并調(diào)控這些基因的表達(dá)。本研究通過酵母單雜交實(shí)驗驗證DoAP3-3與MADS6之間存在相互作用，表明DoAP3-3通過調(diào)控MADS6的表達(dá)，進(jìn)而影響花型發(fā)育。DoAP3-3是否與其他靶基因之間存在相互作用，后續(xù)還需進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子互作實(shí)驗研究。

4""結(jié)論

DAP-seq作為體外檢測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的一種方法，成功將體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗轉(zhuǎn)移到體外，極大地提高了DNA結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的效率，可用于非模式植物轉(zhuǎn)錄因子的研究。在本課題組的前期研究基礎(chǔ)上，通過瓶內(nèi)開花技術(shù)，培育出鐵皮石斛過表達(dá)植株花朵，并對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析；通過DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析成功鑒定出與轉(zhuǎn)錄因子DoAP3-3直接結(jié)合并調(diào)控花型形態(tài)發(fā)育的7個關(guān)鍵候選靶標(biāo)基因：MADS6、NAC029、NAC054、WOX3、AS2、ERECTA、AG。這些基因可能通過特異性調(diào)控或與其他基因相互作用，在調(diào)控花型形態(tài)發(fā)育中發(fā)揮重要功能。該研究為初步解析花器官特征基因DoAP3-3與其靶基因之間的調(diào)控機(jī)制，探究蘭科植物中高度特化和多樣化的花形態(tài)形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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