實(shí)時(shí)重組酶輔助擴(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)狗源性成分

摘 要：為快速檢測(cè)狗源性成分，針對(duì)cytb基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)3 對(duì)重組酶輔助擴(kuò)增（recombinase aided amplification，RAA）引物和1 條核酸外切酶（exonuclease，exo）探針，通過(guò)引物和探針濃度的篩選，構(gòu)建一種實(shí)時(shí)RAA（real-time RAA，Rt-RAA）方法。利用交叉反應(yīng)和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)該檢測(cè)方法的特異性和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，并將Rt-RAA方法靈敏度以及對(duì)混合模擬樣品和市售樣品的檢測(cè)結(jié)果與相應(yīng)的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，Rt-RAA檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，在30 min內(nèi)可檢測(cè)到目的序列，對(duì)狗源性成分的檢出限為0.2%，明顯優(yōu)于實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法，應(yīng)用Rt-RAA方法與國(guó)標(biāo)方法對(duì)模擬樣品和市售實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果完全一致。因此，本研究建立的Rt-RAA檢測(cè)方法適用于狗源性成分的檢測(cè)，為肉源性成分鑒定提供了另一種快速、準(zhǔn)確的新方法。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光重組酶輔助擴(kuò)增技術(shù)；狗源性成分；肉制品摻假

Rapid Detection of Dog-Derived Ingredients by Real-Time Recombinase-Aided Amplification

LIU Mingming， YAN Haiyan， ZHOU Zhaoxu ， YE Yuhua， LI Zhigang， XIAO Zhaojing*

（Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection （National Center of Quality Supervision amp; Inspection of Agricultural Processed Products and Condiments）， Chongqing 401123， China）

Abstract： In order to establish a real-time recombinase aided amplification （Rt-RAA） method to rapidly detect dog-derived ingredients， three pairs of primers and one exonuclease （exo） probe were designed targeting the conserved region of the cytochrome B （cytb） gene. The designed primer combinations and probe concentration were optimized. The specificity and stability of the method were evaluated by cross-reactivity and repeatability experiments. The sensitivity of the Rt-RAA method and its results for simulated mixed samples and commercial samples were compared with those of the national standard method. The results showed that the Rt-RAA method had strong specificity and good stability and could detect the target sequence in less than 30 min. The detection limit for dog-derived ingredients was 0.2%， which was significantly better than that of real-time fluorescence polymerase chain reaction （PCR）. The results of the Rt-RAA method for simulated mixed samples and commercial samples were completely consistent with those of the national standard method. Therefore， Rt-RAA is suitable for the detection of dog-derived ingredients， providing a fast and accurate new method for the identification of

meat-derived ingredients.

Keywords： real-time recombinase-aided amplification; dog-derived ingredients; meat adulteration

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241009-261

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.7 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2025）04-0024-06

引文格式：

劉明明， 顏海燕， 周朝旭， 等. 實(shí)時(shí)重組酶輔助擴(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)狗源性成分[J]. 肉類(lèi)研究， 2025， 39（4）： 24-29. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241009-261. " http：//www.rlyj.net.cn

LIU Mingming， YAN Haiyan， ZHOU Zhaoxu， et al. Rapid detection of dog-derived ingredients by real-time recombinase-aided amplification[J]. Meat Research， 2025， 39（4）： 24-29. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241009-261. " http：//www.rlyj.net.cn

狗肉自古有“香肉”和“白狗”等別稱(chēng)，在傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)記載中具有一定的滋補(bǔ)功效[1]，但作為一種存在諸多爭(zhēng)議的食材，其在市場(chǎng)上的流通狀況復(fù)雜多樣。由于狗的養(yǎng)殖成本高、供應(yīng)稀缺且價(jià)格居高不下，一些不法商販為謀取高額利潤(rùn)，通過(guò)非法途徑或養(yǎng)殖場(chǎng)棄用的毛皮動(dòng)物肉摻入或替代進(jìn)行銷(xiāo)售。近年來(lái)，狗肉摻假事件屢禁不止。2023年5月曝光線上銷(xiāo)售的桂林靈川狗肉，實(shí)則為鴨肉烹飪制成。甚至有報(bào)道稱(chēng)某些食品加工商戶(hù)將未經(jīng)檢驗(yàn)的狐貍?cè)?、貂肉加工成熟食，以狗肉的名義出售。狐貍、貂與狗同屬犬科動(dòng)物，可能攜帶多種病毒[2]，失去毛皮的狐肉、貂肉被低價(jià)收購(gòu)冒充狗肉銷(xiāo)售流通，不僅嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者合法權(quán)益，貿(mào)然食用還會(huì)給食用者健康帶來(lái)潛在的危險(xiǎn)。尤其在新冠肺炎全球肆虐的背景下，食用野味的危險(xiǎn)性愈發(fā)凸顯。此外，對(duì)于穆斯林消費(fèi)者而言，不明標(biāo)簽的狗肉成分摻入清真食品，無(wú)疑于嚴(yán)重侵犯了他們的宗教信仰[3]。為應(yīng)對(duì)一系列嚴(yán)峻問(wèn)題，2020年深圳市和珠海市相繼立法禁食狗肉[4]。

隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，越來(lái)越多的分子生物學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于肉源性成分檢測(cè)，主要包括基于外源蛋白和基于外源核酸的2 種檢測(cè)技術(shù)。相比于蛋白質(zhì)，DNA是大多數(shù)生物體的遺傳物質(zhì)，具有更高的穩(wěn)定性和特異性。因此，基于DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)技術(shù)通常作為肉類(lèi)鑒定的首選方法[5-6]，其中包括傳統(tǒng)PCR[7]、分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR（molecular beacon-based real-time PCR，MB-real-time PCR）[8]、實(shí)時(shí)熒光PCR[9]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）[10]及數(shù)字PCR[11]等。近年來(lái)，DNA擴(kuò)增技術(shù)的推進(jìn)使得物種鑒定的方法得到了快速發(fā)展?；趥鹘y(tǒng)PCR檢測(cè)通量低的缺點(diǎn)[12-13]，已構(gòu)建了多種多重傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法用于狗與其他物種的區(qū)分檢測(cè)，但仍需依賴(lài)凝膠電泳的步驟[14-15]。隨著實(shí)時(shí)熒光PCR的產(chǎn)生，免去了此步驟的操作[16-17]，同時(shí)能對(duì)整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并在此基礎(chǔ)上又衍生了多重實(shí)時(shí)熒光PCR和新型通用引物多重實(shí)時(shí)PCR等檢測(cè)技術(shù)[18-20]，從而解決了MB-real-time PCR和PCR-RFLP背景信號(hào)低、設(shè)計(jì)復(fù)雜、特異性酶要求較高及易出現(xiàn)假陽(yáng)性等問(wèn)題，但仍需昂貴的變溫分析儀器。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的開(kāi)發(fā)擺脫了對(duì)變溫儀器的依賴(lài)，但檢測(cè)時(shí)間仍然較長(zhǎng)，且操作復(fù)雜[21]?；诖?，構(gòu)建一種恒溫、快速且操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法非常必要。

實(shí)時(shí)重組酶輔助擴(kuò)增（real-time recombinase aided amplification，Rt-RAA）是近年來(lái)新興的一種PCR衍生檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于分子診斷、微生物檢測(cè)、病原體鑒定和食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域[22-24]。該方法在37～42 ℃恒溫條件下，主要通過(guò)UvsX重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）和Bsu DNA聚合酶3 種酶20 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的快速積累[25]，無(wú)需熱循環(huán)儀。擴(kuò)增過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)取決于DNA聚合酶外切酶的活性，可以識(shí)別和剪切無(wú)堿基位點(diǎn)四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）。此外，Rt-RAA試劑存在凍干粉形式，便于運(yùn)輸?shù)椒?wù)點(diǎn)，無(wú)需冷鏈貯藏。并且，可以使用各種檢測(cè)儀器查看擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物或?qū)⑵浼稍诓煌脚_(tái)上，從而為資源匱乏環(huán)境中的廣泛運(yùn)用提供了靈活性[26]。

本研究針對(duì)細(xì)胞色素B（cytochrome B，cytb）基因序列的保守區(qū)域建立用于狗源性成分的Rt-RAA檢測(cè)方法，對(duì)該方法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，并評(píng)估其特異性和靈敏度。此外，利用Rt-RAA檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際樣品和模擬樣品進(jìn)行檢測(cè)，并將結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠活體購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；狗肉、貓肉、狐貍?cè)夂王跞獾孽r肉質(zhì)控樣品由東莞元佳實(shí)驗(yàn)科技有限公司提供；牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、馬肉、鵝肉、驢肉、駱駝肉為本實(shí)驗(yàn)室日常肉品質(zhì)檢測(cè)所用的質(zhì)控樣品；兔肉、馬鹿肉、梅花鹿肉為線上購(gòu)買(mǎi)，并通過(guò)GB/T 38164—2019《常見(jiàn)畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》進(jìn)行真實(shí)性鑒定，結(jié)果均符合要求；核酸擴(kuò)增試劑盒（內(nèi)含水化緩沖液、MgAc緩沖溶液）由眾測(cè)（杭州）生物科技有限公司提供；核酸提取試劑盒由成都TaKaRa公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

CFX96 Touch熒光定量PCR儀 美國(guó)Bio-Rad

公司；GR85DA高壓滅菌鍋 致微（廈門(mén)）儀器有限公司；

ME403千分之一電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Nanodrop ONEc超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

由于狐貍和貂與狗同屬于犬類(lèi)動(dòng)物，檢測(cè)通常易受干擾，本研究為了保證所建立Rt-RAA方法在檢測(cè)中的可實(shí)用性，將狐貍?cè)夂王跞夥鬯椋⒌荣|(zhì)量混合后作為本次實(shí)驗(yàn)所用的基底肉。將狗肉與基底肉混合，其中狗肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、50%、25%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0%，以確定狗源性成分檢出限。

1.3.2 樣本DNA提取

按照提取DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)，取約50 mg新鮮狗肉樣本，與裂解液充分研磨混合，為提高所提取的DNA質(zhì)量，加入20 μL蛋白酶（20 mg/mL）和10 μL RNA酶（10 mg/mL）反應(yīng)2 h，后續(xù)通過(guò)吸附柱進(jìn)行吸附和過(guò)濾，即可得到目的DNA。通過(guò)超微量分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，將吸光度A260 nm和A280 nm比值在1.7～1.9的目的DNA稀釋至10 ng/μL，于－20 ℃保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3 Rt-RAA引物、探針設(shè)計(jì)與合成

基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的狗基因序列，通過(guò)BLAST進(jìn)行對(duì)應(yīng)序列同源性分析，確定cytb基因（基因ID：804486）中的保守序列。根據(jù)該序列，通過(guò)Rt-RAA工作原理和探針引物設(shè)計(jì)規(guī)則，使用Snap Gene軟件設(shè)計(jì)3 對(duì)狗特異性引物和1 條核酸外切酶（exonuclease，exo）探針，相關(guān)序列如表1所示。設(shè)計(jì)的引物和探針序列均送至生工生物工程（武漢）股份有限公司進(jìn)行合成。

1.3.4 Rt-RAA檢測(cè)條件

為研究Rt-RAA最適反應(yīng)條件，分別對(duì)不同的引物對(duì)進(jìn)行篩選，并探究其探針濃度，最終將篩選確定的反應(yīng)終濃度200 nmol/L的RAA-cytb-F2、R1引物和反應(yīng)終濃度160 nmol/L的RAA-cytb-P作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)物。此外，反應(yīng)體系還包括：25 μL水化緩沖液、2.5 μL 280 mmol/L

MgAc緩沖溶液和1 μL目標(biāo)DNA，最終用ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。在本體系下，探究在33～43 ℃梯度范圍內(nèi)最佳反應(yīng)溫度，每一反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行。所有實(shí)驗(yàn)運(yùn)行程序均為30 s/循環(huán)，40 個(gè)循環(huán)。

1.3.5 Rt-RAA特異性實(shí)驗(yàn)

按照上述確定的Rt-RAA檢測(cè)條件，對(duì)提取的鼠肉、貓肉、狐貍?cè)?、貂肉、牛肉、鵝肉、羊肉、駱駝肉、豬肉、兔肉、雞肉、梅花鹿肉、馬肉、驢肉、馬鹿肉和鴨肉DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并以狗肉的DNA和ddH2O分別作為陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照作為參照，以確定檢測(cè)方法的特異性。

1.3.6 Rt-RAA靈敏度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將狗肉與基底肉充分混合，制成狗肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、50%、25%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0%的模擬樣品，并提取DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，以確定所建立的方法對(duì)狗肉的檢測(cè)靈敏度，并與GB/T 38164—2019中實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)靈敏度進(jìn)行對(duì)比。

選取狗肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、0.5%、0.2%的模擬樣品DNA，進(jìn)行重復(fù)性擴(kuò)增反應(yīng)，每組設(shè)置10 個(gè)平行樣，以確定Rt-RAA檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。每組平行樣均按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行DNA提取，將A260 nm/A280 nm在1.7～1.9范圍內(nèi)的DNA質(zhì)量濃度均稀釋至10 ng/μL。

1.3.7 市售樣品和模擬樣品檢測(cè)

在狗肉店、燒烤店和小商店隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)15 份樣品，并制作市售模擬樣品（將狗肉與基底肉混合，制成狗肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%和1%的樣品，通過(guò)高壓滅菌鍋121 ℃、20 min蒸熟），利用所建立的Rt-RAA方法和GB/T 38164—2019中的實(shí)時(shí)熒光PCR法進(jìn)行狗源性成分檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析并評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用PowerPoint軟件作圖。采用Exce1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rt-RAA引物及相應(yīng)探針濃度的篩選

根據(jù)NCBI公布的基因序列，按照Rt-RAA工作原理，合成用于目的片段擴(kuò)增的引物和探針。為達(dá)到最優(yōu)的擴(kuò)增效果，本研究鑒定并篩選9 對(duì)引物-探針組合與狗源DNA反應(yīng)性。如圖1A所示，所有組合均得到有效擴(kuò)增，并且呈現(xiàn)典型的“S”型曲線。然而，只有5 對(duì)引物組合在相對(duì)較低的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值）下快速達(dá)到擴(kuò)增平臺(tái)期，其中引物組合F2R1（RAA-cytb-F2和RAA-cytb-R1）擴(kuò)增起點(diǎn)早于其他組合。因此，將F2R1引物組合用于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步優(yōu)化和驗(yàn)證。在固定200 nmol/L引物終濃度條件下，在40～280 nmol/L

濃度范圍探究不同濃度探針對(duì)Rt-RAA信號(hào)響應(yīng)的影響。如圖1B所示，熒光強(qiáng)度和反應(yīng)效率隨著探針濃度的增加而逐漸增加，160 nmol/L時(shí)反應(yīng)起始點(diǎn)明顯早于其他探針濃度擴(kuò)增曲線，且熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。因此，選擇160 nmol/L作為所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)的探針濃度。

2.2 Rt-RAA反應(yīng)溫度的優(yōu)化

溫度是Rt-RAA擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)，

如圖2所示，在33～43 ℃溫度區(qū)間內(nèi)均能有效擴(kuò)增出目的序列。在33～39 ℃范圍內(nèi)，隨著擴(kuò)增溫度的升高，Ct值逐漸降低。在41 ℃時(shí)，擴(kuò)增起始點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)延遲。盡管在43 ℃下進(jìn)行Rt-RAA擴(kuò)增反應(yīng)效率有所提高，但Ct值仍高于39 ℃擴(kuò)增Ct值。因此，將39 ℃作為實(shí)驗(yàn)反應(yīng)溫度，以實(shí)現(xiàn)Rt-RAA方法效果達(dá)到最佳。

2.3 Rt-RAA的檢測(cè)特異性驗(yàn)證

特異性是Rt-RAA作為檢測(cè)方法使用之前需評(píng)估的重要指標(biāo)。如圖3所示，只有狗肉樣品DNA呈現(xiàn)出典型的“S”型擴(kuò)增曲線，其他肉類(lèi)和空白對(duì)照均未檢測(cè)出熒光強(qiáng)度變化。表明Rt-RAA檢測(cè)方法具有較高的特異性，可以將目的基因與日常其他肉類(lèi)基因進(jìn)行區(qū)分，有效避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)。

2.4 Rt-RAA的檢測(cè)靈敏度

如圖4所示，隨著狗肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，所檢測(cè)的Ct值逐漸減小。其中，Rt-RAA方法可檢測(cè)狗肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)低至0.2%，且在Ct值20以?xún)?nèi)即可檢測(cè)到擴(kuò)增熒光強(qiáng)度。

GB/T 38164—2019中實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)狗肉最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)則為0.5%，且擴(kuò)增熒光在Ct值30以上才可被儀器所捕獲。表明本研究創(chuàng)建的Rt-RAA方法檢測(cè)狗源性成分靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，并為檢測(cè)更低質(zhì)量分?jǐn)?shù)狗源性成分提供了更加靈敏、快捷的新方法。

2.5 Rt-RAA的檢測(cè)穩(wěn)定性

如圖5所示，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的狗源性成分在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中均能出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但重復(fù)樣本之間稍有不同，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)的檢測(cè)結(jié)果差異最大。隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，所測(cè)的平均Ct值逐漸升高。狗肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、0.5%和0.2%時(shí)所測(cè)得的10 次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.68%、8.26%和10.90%。表明本研究構(gòu)建的Rt-RAA檢測(cè)方法具有可接受的穩(wěn)定性。

2.6 市售樣品和模擬樣品檢測(cè)結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證所構(gòu)建的Rt-RAA方法的實(shí)用性，本研究增加了模擬樣品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。如表2所示，2 種方法對(duì)模擬樣品檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)100%。

3 結(jié) 論

本研究以狗的多拷貝線粒體基因組中cytb基因保守序列為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)了3 對(duì)RAA引物和1 條exo探針。通過(guò)引物的篩選、探針濃度和反應(yīng)溫度的優(yōu)化，構(gòu)建了用于狗源性成分的Rt-RAA檢測(cè)方法。該方法的建立有效縮短和簡(jiǎn)化了摻假鑒定過(guò)程，從而提高了檢測(cè)效率。此外，構(gòu)建的Rt-RAA檢測(cè)方法具有較高的特異性和較低的檢出限，對(duì)于16 種非靶標(biāo)物種無(wú)交叉反應(yīng)，可檢測(cè)出質(zhì)量分?jǐn)?shù)低至0.2%的狗源性成分，并且結(jié)果穩(wěn)定。針對(duì)市售樣品和模擬樣品的檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光PCR法一致。為確保在日常中能夠檢出較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的狗肉樣品，本研究將循環(huán)數(shù)設(shè)定為40。在此循環(huán)數(shù)下，Rt-RAA檢測(cè)方法在30 min內(nèi)即可完成擴(kuò)增。綜上所述，本研究開(kāi)發(fā)的

Rt-RAA反應(yīng)體系是一種有效的檢測(cè)方法，可用于市場(chǎng)上狗源性成分鑒定，為打擊非法狗肉摻假提供了有力的技術(shù)支撐。

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