球孢白僵菌高毒力菌株的誘變選育及固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

摘要""為篩選出產(chǎn)孢量高、致病力強(qiáng)以及遺傳穩(wěn)定的球孢白僵菌突變菌株以及適宜的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件，本研究將球孢白僵菌孢子菌懸液置于紫外燈下進(jìn)行誘變處理，篩選菌落直徑和面積大、單位面積產(chǎn)孢量高以及對(duì)小菜蛾毒力強(qiáng)的突變菌株；并采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)篩選出的突變菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，S2突變菌株的產(chǎn)孢量是原始菌株的3.05倍，其校正死亡率和半致死時(shí)間比原始菌株分別提高了8.7%和縮短了17.2%；在連續(xù)傳代培養(yǎng)5代后，其平均產(chǎn)孢量穩(wěn)定在4.74×10⁹個(gè)/cm²左右，表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。進(jìn)一步優(yōu)化得到S2突變菌株的最佳固態(tài)發(fā)酵工藝條件：麥麩和米糠質(zhì)量比1.34∶1.00，無(wú)機(jī)鹽含量0.26%，接種量9.32%，含水量50%，發(fā)酵溫度26"℃；在此條件下突變菌株的實(shí)際產(chǎn)孢量達(dá)到11.762×10⁸個(gè)/g。本研究為球孢白僵菌殺蟲(chóng)劑的研發(fā)提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞""球孢白僵菌；高毒力；紫外誘變；產(chǎn)孢量；固態(tài)發(fā)酵

中圖分類號(hào)""Q932 """"""文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼""A """"""文章編號(hào)""1007-7731（2025）07-0053-07

DOI號(hào)""10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.07.014

Mutation breeding and optimization of the solid-state fermentation process for high virulence strains of Beauveria bassiana

QIAN Senhe¹""""YANG Zicheng¹""""RUAN Yonghai¹""""HOU Shumin²

（¹College of Biological and Food Engineering， Anhui Polytechnic University， Wuhu 241000， China;

²Crop Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230041， China）

Abstract "To screen mutant strains of Beauveria bassiana"with high sporulation yield， high virulence， genetic stability， and suitable solid-state fermentation conditions， this study treated the spore suspension of B. bassiana"with UV irradiation mutagenesis. Mutants exhibiting large colony diameter and area， high sporulation per unit area， and enhanced virulence against Plutella xylostella"were selected. Single-factor experiments and response surface methodology were employed to optimize the solid-state fermentation process for the selected mutant strains. The results showed that the sporulation yield of the S2 mutant strain was 3.05-fold higher than that of the original strain， with corrected mortality and median lethal time improved by 8.7% and shortened by 17.2%， respectively. After five successive subcultures， the average sporulation yield of S2 remained stable at approximately 4.74×10? spores/cm2， demonstrating robust genetic stability. Further optimization revealed the optimal solid-state fermentation conditions for S2： wheat bran to rice bran mass ratio of 1.34∶1.00， inorganic salt content of 0.26%， inoculum size of 9.32%， moisture content of 50%， and fermentation temperature of 26 °C. Under these conditions， the actual sporulation yield reached 11.762×10? spores/g. This study provides an experimental foundation for the development of B. bassiana-based insecticides.

Keywords "Beauveria bassiana; high virulence; UV irradiation mutagenesis; spore production; solid-state fermentation

在農(nóng)作物病蟲(chóng)害的防治實(shí)踐中，長(zhǎng)期大量施用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)導(dǎo)致病蟲(chóng)耐藥性的形成，還會(huì)對(duì)土壤環(huán)境造成污染，破壞生態(tài)平衡，一定程度上影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展進(jìn)程^[1]。生物防治是一種促進(jìn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要策略，其中利用微生物進(jìn)行害蟲(chóng)防治是生物防治策略中重要的組成部分之一^[2]。

球孢白僵菌是子囊菌門的昆蟲(chóng)病原真菌，具有廣泛的地理分布特征，其生態(tài)位覆蓋從低海拔地區(qū)至高山區(qū)域。該菌通過(guò)無(wú)性生殖產(chǎn)生分生孢子，其菌落形態(tài)呈絨狀^[3]。球孢白僵菌具有侵染昆蟲(chóng)體表和體內(nèi)的能力，其分生孢子能在蟲(chóng)體表皮萌發(fā)，并長(zhǎng)出芽管^[4]；同時(shí)，分生孢子產(chǎn)生的脂肪酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等物質(zhì)能夠溶解昆蟲(chóng)表皮，為芽管侵入蟲(chóng)體創(chuàng)造條件；芽管穿透表皮侵入蟲(chóng)體，在蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，消耗寄主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并產(chǎn)生白僵菌素和卵孢霉素等代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致蟲(chóng)體中毒死亡^[5]。生產(chǎn)上可通過(guò)工業(yè)化培養(yǎng)球孢白僵菌，其產(chǎn)生的分生孢子可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為微生物殺蟲(chóng)劑。

球孢白僵菌不同菌株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量以及對(duì)昆蟲(chóng)的毒力等方面表現(xiàn)出顯著差異。因此，選育產(chǎn)孢量高、致病力強(qiáng)且遺傳穩(wěn)定的菌株，是開(kāi)發(fā)球孢白僵菌微生物殺蟲(chóng)劑的關(guān)鍵。獲得優(yōu)良菌株的方法包括自然分離篩選、誘變選育、雜交選育以及基因工程技術(shù)構(gòu)建等^[6]。誘變選育作為一種經(jīng)典方法，能夠快速獲得優(yōu)良突變菌株。特別是紫外誘變，作為一種有效的手段，能夠干擾DNA的正常復(fù)制過(guò)程，引起基因突變，從而在短時(shí)間內(nèi)篩選出具有正向突變的菌株^[7]。蘇筱雨等^[8]通過(guò)紫外誘變篩選出了對(duì)美國(guó)白蛾具有高毒力的白僵菌菌株。球孢白僵菌殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)依賴充足的分生孢子產(chǎn)量，而突變菌株的產(chǎn)孢性能在適宜的培養(yǎng)條件下可以得到充分發(fā)揮。目前，固態(tài)發(fā)酵是生產(chǎn)上獲取球孢白僵菌分生孢子的主要方法，其優(yōu)勢(shì)在于能夠利用廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品作為基質(zhì)，這不僅降低了生產(chǎn)成本，而且促進(jìn)了農(nóng)業(yè)廢棄資源的循環(huán)利用^[9]。本研究選取球孢白僵菌作為原始菌株，采用紫外誘變技術(shù)，旨在選育出產(chǎn)孢量高、對(duì)昆蟲(chóng)毒力強(qiáng)且遺傳穩(wěn)定的突變菌株。同時(shí)，對(duì)突變菌株的固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，以進(jìn)一步提高突變菌株的產(chǎn)孢量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種 球孢白僵菌（Beauveria bassiana"Q2505），實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基，其組成為瓊脂20"g、土豆200"g、葡萄糖20"g和蒸餾水1 000"mL；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由麥麩、米糠、硝酸鉀和水構(gòu)成。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 HI-4A數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器（金壇市杰瑞爾電器有限公司），組合式搖床（太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)試驗(yàn)設(shè)備有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），光學(xué)顯微鏡（上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 球孢白僵菌菌懸液制備 先將球孢白僵菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，于26"℃恒溫條件下培養(yǎng)，直至產(chǎn)生分生孢子。采用0.1%吐溫80溶液將平板上的孢子洗脫至無(wú)菌燒杯中，并在搖床中以180 r/min轉(zhuǎn)速振蕩2"h以促進(jìn)孢子分散。孢子懸液用擦鏡紙過(guò)濾后，采用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)孢子懸液濃度至1.0×10⁷個(gè)/mL^[10]。

1.2.2 球孢白僵菌的紫外誘變 取5"mL球孢白僵菌原始菌株孢子懸液，置于無(wú)菌平皿中，并在磁力攪拌器上使孢子懸液均勻分散；采用30 W紫外燈（紫外燈距離平皿30"cm），分別對(duì)孢子懸液進(jìn)行0、2、4、6、8和10"min的照射處理。對(duì)于誘變處理0、2、4和6"min的孢子懸液，分別稀釋1 000倍和100倍；而誘變處理8和10"min的孢子懸液，分別稀釋100倍和10倍。稀釋后的孢子懸液混勻后，分別取100"μL均勻涂布于PDA固體培養(yǎng)基上。整個(gè)操作過(guò)程需在避光條件下進(jìn)行，涂布后的培養(yǎng)基在26"℃避光培養(yǎng)3"d，隨后計(jì)算致死率，并繪制致死率曲線。

1.2.3 突變菌株的篩選 對(duì)經(jīng)誘變處理的球孢白僵菌孢子進(jìn)行平板培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后重新接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出成熟孢子。隨后測(cè)量菌落直徑和面積，并測(cè)定單位面積的孢子產(chǎn)量。通過(guò)與原始菌株比較，篩選出菌落直徑和面積大且單位面積產(chǎn)孢量高的正向突變菌株。

1.2.4 突變菌株的毒力測(cè)定 取2"mL孢子濃度為1×10⁷個(gè)/mL的突變菌株與原始菌株，對(duì)2齡小菜蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行噴霧處理，以0.1%吐溫80無(wú)菌水作為對(duì)照；每組試驗(yàn)3次重復(fù)，每重復(fù)20頭幼蟲(chóng)。處理后的小菜蛾幼蟲(chóng)被置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)（12L∶12D，25"℃），于透明塑料盒中飼養(yǎng)，每日記錄小菜蛾幼蟲(chóng)的死亡情況。對(duì)死亡幼蟲(chóng)保濕培養(yǎng)5"d，檢查蟲(chóng)體是否出現(xiàn)白僵菌菌絲或孢子，從而確定幼蟲(chóng)的死亡是否由白僵菌感染所致。根據(jù)幼蟲(chóng)的每日死亡率，計(jì)算校正死亡率，并構(gòu)建死亡率與時(shí)間的回歸方程，計(jì)算出半致死時(shí)間^[11]。

1.2.5 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 將篩選得到的突變菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，連續(xù)傳代培養(yǎng)5代，測(cè)定每代產(chǎn)孢量，分析突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6 突變菌株的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化 采用麥麩與米糠混合基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵制備球孢白僵菌孢子。先將麥麩與米糠按一定比例混勻，并加入適量的水和硝酸鉀，混合物經(jīng)115"℃立式壓力蒸汽滅菌鍋滅菌30"min，冷卻至室溫，在超凈臺(tái)中接種球孢白僵菌菌懸液。接種后用接種鏟將其混勻，并用封口膜封口，然后置于搖床中，在26"℃條件下培養(yǎng)5"d。

（1）固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)比例優(yōu)化。確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中硝酸鉀含量0.2%，含水量50%，接種量10%，培養(yǎng)溫度26"℃，變換培養(yǎng)基質(zhì)中麥麩與米糠的質(zhì)量比，使其分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，經(jīng)培養(yǎng)后測(cè)定產(chǎn)孢量，以確定最佳基質(zhì)比例。

（2）硝酸鉀含量?jī)?yōu)化。確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中基質(zhì)質(zhì)量比1∶1，接種量10%，含水量50%，培養(yǎng)溫度26"℃，改變硝酸鉀的含量，使其分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5和0.6%，經(jīng)培養(yǎng)后測(cè)定產(chǎn)孢量，以確定最佳硝酸鉀含量。

（3）接種量?jī)?yōu)化。確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中基質(zhì)質(zhì)量比1∶1，硝酸鉀含量0.3%，含水量50%，培養(yǎng)溫度26"℃，改變接種量，使其分別為4%、6%、8%、10%和20%，經(jīng)培養(yǎng)后測(cè)定產(chǎn)孢量，以確定最佳接種量。

（4）含水量?jī)?yōu)化。確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中基質(zhì)質(zhì)量比1∶1，硝酸鉀含量0.3%，接種量10%，改變含水量，使其分別為10%、20%、40%、50%和60%，經(jīng)培養(yǎng)后測(cè)定產(chǎn)孢量，以確定最佳含水量。

1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化 基于單因素試驗(yàn)中含水量影響不明顯，因此，采用基質(zhì)比、接種量和無(wú)機(jī)鹽含量三因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化突變菌株的發(fā)酵條件，其具體因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

1.2.8 產(chǎn)孢量測(cè)定 取培育5"d的固態(tài)基質(zhì)1.0"g，置于裝有30"mL 0.1%吐溫80溶液的離心管中，置于180 r/min搖床中振蕩2"h，使孢子均勻分散；用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾多余基質(zhì)和殘?jiān)玫芥咦討乙?，采用血球?jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖，利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌的誘變選育

2.1.1 紫外誘變致死率 將初始濃度為1.0×10⁷個(gè)/mL的孢子菌懸液置于30 W紫外燈下分別照射處理0、2、4、6、8和10"min，其結(jié)果如圖1～2所示。隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸升高，當(dāng)照射6"min時(shí)，致死率幾乎達(dá)到100%。因此，根據(jù)致死率在90%左右為最佳誘變時(shí)間，將球孢白僵菌的紫外誘變時(shí)間確定為4"min。

2.1.2 球孢白僵菌紫外誘變篩選 經(jīng)紫外誘變處理后，挑取誘變后長(zhǎng)出的球孢白僵菌菌落，并將其接種至PDA平板上培養(yǎng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，共有12株突變菌株的菌落直徑超過(guò)原始菌株，將其編號(hào)為S1～S12，原始菌株編號(hào)為S0。突變菌株的菌落直徑、面積及產(chǎn)孢量如表2所示。篩選的12株突變菌株中，S2、S4和S9的菌落直徑、面積和單位面積產(chǎn)孢量均較大（圖3），其中S2菌株的單位面積產(chǎn)孢量最高，是原始菌株的3.05倍。

2.1.3 突變菌株對(duì)小菜蛾的毒力作用 原始菌株S0及突變菌株S2、S4和S9處理的供試小菜蛾校正致死率分別為78.42%、85.25%、83.17%和82.67%；半致死時(shí)間分別為6.56、5.43、5.78和5.84"d（表3）；其中菌株S2處理的小菜蛾的校正致死率最高，且半致死時(shí)間最短，較原始菌株分別提高了8.7%和縮短了17.2%。表明突變菌株S2對(duì)小菜蛾的毒力效果最好。因此，選取S2突變菌株進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。

2.1.4 S2突變菌株的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性對(duì)其后續(xù)的生產(chǎn)利用具有重要的影響。通過(guò)對(duì)S2突變菌株進(jìn)行連續(xù)5代的傳代試驗(yàn)，其單位面積產(chǎn)孢量如表4所示。S2突變菌株的平均產(chǎn)孢量穩(wěn)定在4.74×10⁹個(gè)/cm²水平，表明其具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2 S2突變菌株的固態(tài)發(fā)酵單因素條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基質(zhì)比 麥麩和米糠作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，對(duì)微生物的生長(zhǎng)起著重要作用，能夠?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)提供必要的碳源和氮源^[12]。不同麥麩與米糠質(zhì)量比對(duì)S2突變菌株產(chǎn)孢量的影響如圖4所示。隨著米糠質(zhì)量的增加，產(chǎn)孢量逐漸增加，當(dāng)麥麩與米糠質(zhì)量比達(dá)到1∶1時(shí)，產(chǎn)孢量達(dá)到峰值，為9.91×10⁸個(gè)/g；然而，若繼續(xù)提高米糠的含量，其產(chǎn)孢量則呈下降趨勢(shì)。

2.2.2 硝酸鉀含量""""在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加微量的硝酸鉀、碳酸鈣等無(wú)機(jī)鹽，有利于提高真菌發(fā)酵的菌絲活力和產(chǎn)孢量^[13]。由圖5可知，隨著硝酸鉀含量的增加，S2突變菌株的產(chǎn)孢量逐漸增加，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽含量達(dá)到0.3%時(shí)，S2突變菌株的產(chǎn)孢量達(dá)到峰值，為9.96×10⁸個(gè)/g。然而，隨著硝酸鉀含量的繼續(xù)增加，其產(chǎn)孢量則呈下降趨勢(shì)。

2.2.3 接種量 發(fā)酵培養(yǎng)基中接種量對(duì)微生物生長(zhǎng)速度具有重要影響，適宜的接種量能夠促進(jìn)微生物快速繁殖^[14]。由圖6可知，當(dāng)接種量為4%、6%、8%和10%時(shí)，S2突變菌株的產(chǎn)孢量分別為2.05×10⁸、4.04×10⁸、7.93×10⁸和9.98×10⁸個(gè)/g。表明，隨著接種量的增加其產(chǎn)孢量逐漸增加，當(dāng)接種量超過(guò)10%時(shí)，產(chǎn)孢量出現(xiàn)下降。

2.2.4 含水量 發(fā)酵基質(zhì)含水量影響微生物的生長(zhǎng)和代謝。由圖7可知，當(dāng)含水量低于20%時(shí)，發(fā)酵基質(zhì)中的水分不足以支持真菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致無(wú)法形成孢子。隨著含水量的提高，產(chǎn)孢量逐漸增加，當(dāng)含水量達(dá)到50%時(shí)，產(chǎn)孢量達(dá)到峰值，為10.01×10⁸個(gè)/g。然而，當(dāng)含水量進(jìn)一步增加時(shí)，產(chǎn)孢量則呈下降趨勢(shì)，這一現(xiàn)象表明，含水量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)中麥麩和米糠結(jié)塊和黏性增大，從而影響通氣量，導(dǎo)致最終產(chǎn)孢量減少。

2.3 S2突變菌株發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn) S2突變菌株發(fā)酵條件的三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表5中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，其回歸模型分析結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，整體模型極顯著（P=0.000 4）；其中麥麩和米糠基質(zhì)比的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)產(chǎn)孢量的影響在0.01水平上均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；麥麩和米糠基質(zhì)比與無(wú)機(jī)鹽含量交互作用、無(wú)機(jī)鹽含量與接種量交互作用、無(wú)機(jī)鹽含量的二次方以及接種量的二次方對(duì)產(chǎn)孢量的影響在0.05水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)回歸分析，得到以產(chǎn)孢量為響應(yīng)值（Y）與麥麩和米糠質(zhì)量比（A）、無(wú)機(jī)鹽含量（B）、接種量（C）之間的回歸方程式，Y=3.42－0.31A+0.034B－0.04C+0.13AB+0.061AC+0.15BC－0.40A²－0.14B²－0.16C²。

由回歸方程得到的響應(yīng)面圖及等高線（圖8），可以直觀地反映麥麩和米糠質(zhì)量比、無(wú)機(jī)鹽含量和接種量3個(gè)因素交互作用對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量的影響。根據(jù)響應(yīng)面圖并結(jié)合表6可以看出，3個(gè)因素對(duì)產(chǎn)孢量的影響大小順序?yàn)辂滬熋卓焚|(zhì)量比gt;接種量gt;無(wú)機(jī)鹽含量。

2.3.2 最佳培養(yǎng)條件的確定及驗(yàn)證 由上述回歸模型可以得出，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為麥麩和米糠質(zhì)量比為1.34∶1.00，無(wú)機(jī)鹽含量為0.26%，接種量為9.32%，預(yù)測(cè)在此培養(yǎng)條件下的S2突變菌株產(chǎn)孢量為12.196×10⁸個(gè)/g。在培養(yǎng)溫度26"℃，含水量50%的條件下，對(duì)上述優(yōu)化的培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，三組平行試驗(yàn)得到S2突變菌株的產(chǎn)孢量平均值為11.762×10⁸個(gè)/g，其與預(yù)測(cè)值擬合度達(dá)到96.44%，表明優(yōu)化模型可靠。

3 結(jié)論與討論

紫外誘變技術(shù)的主要生物學(xué)效應(yīng)是引發(fā)DNA結(jié)構(gòu)的變化，特別是導(dǎo)致DNA鏈斷裂^[15]。然而，其主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，阻礙堿基間的正常配對(duì)，從而誘發(fā)微生物基因的突變^[16]。靳磊等^[17]采用紫外誘變技術(shù)處理球孢白僵菌403001的孢子，獲得了毒力較高且性能穩(wěn)定的突變菌株403001-38。本研究通過(guò)紫外誘變獲得的球孢白僵菌突變菌株S2較原始菌株產(chǎn)孢量提高了3倍，此外，突變菌株對(duì)小菜蛾毒力較原始菌株強(qiáng)，半致死時(shí)間較短，且表現(xiàn)出較高的遺傳穩(wěn)定性。這表明采用紫外誘變技術(shù)選育高性能的球孢白僵菌具有實(shí)際可行性。

在工業(yè)生產(chǎn)上，生防制劑的生產(chǎn)需要考慮成本效益。本研究利用農(nóng)業(yè)廢棄物，如麥麩和米糠作為發(fā)酵培養(yǎng)基，不僅降低了生產(chǎn)成本，還促進(jìn)了農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用^[18]。麥麩和米糠作為球孢白僵菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)的優(yōu)勢(shì)在于其富含淀粉和蛋白質(zhì)，能夠?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)提供必要的碳源和氮源；另外，米糠還能改善發(fā)酵基質(zhì)通氣量，避免因麥麩加水后黏性過(guò)大而導(dǎo)致的發(fā)酵基質(zhì)通氣量不足，從而影響產(chǎn)孢量^[19-20]。在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加微量的硝酸鉀，不僅調(diào)節(jié)了基質(zhì)pH，還有效防止培養(yǎng)物基質(zhì)的黏連，增加菌絲的生長(zhǎng)空間^[21]。然而，過(guò)高的硝酸鉀含量會(huì)影響細(xì)胞的有絲分裂，從而影響菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量^[22]。接種量顯著影響微生物進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的速度，接種量不足會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，生產(chǎn)成本增加^[11]；而接種量過(guò)大可能導(dǎo)致培養(yǎng)基質(zhì)無(wú)法提供足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而減少孢子產(chǎn)量^[23]。較低的基質(zhì)含水量會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳輸，阻礙微生物生長(zhǎng)，影響酶的穩(wěn)定性和基質(zhì)膨脹，進(jìn)而影響真菌生長(zhǎng)；而較高的含水量會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵基質(zhì)顆粒結(jié)塊、通氣不暢以及基質(zhì)黏性增加，進(jìn)而影響真菌的生長(zhǎng)^[24]。

本研究通過(guò)紫外誘變技術(shù)篩選出產(chǎn)孢量高、致病力強(qiáng)且遺傳穩(wěn)定的球孢白僵菌突變菌株S2，并對(duì)其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化。該突變菌株的最佳固態(tài)發(fā)酵工藝條件為麥麩和米糠基質(zhì)比1.34∶1.00，無(wú)機(jī)鹽含量0.26%，接種量9.32%，含水量50%，培養(yǎng)溫度26"℃；在此條件下實(shí)際產(chǎn)孢量為11.762×10⁸個(gè)/g。本研究結(jié)果為球孢白僵菌殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：何""艷）

基金項(xiàng)目"安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院委托項(xiàng)目“毒力綠（白）僵菌菌株的ARTP誘變選育及殺蟲(chóng)懸浮劑研制”（KH10000633）。

作者簡(jiǎn)介"錢森和（1978—），男，安徽懷寧人，博士，副教授，從事生物技術(shù)與工程研究。

通信作者"侯樹(shù)敏（1970—），男，安徽阜陽(yáng)人，碩士，研究員，從事油菜蟲(chóng)害防控及抗蟲(chóng)育種研究。