熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)用于GⅠ型和GⅡ型諾如病毒的檢測效能

摘要：目的" 探究熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒（NV）的檢測效能。方法" 以2020年12月-2023年12月南昌市灣里管理局疾病預(yù)防控制中心收治的50例疑似NV感染患者為研究對象，采集其糞便樣本，依次應(yīng)用常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測方式進(jìn)行檢驗，比較兩種檢驗方式的陽性檢出率及檢測效能（檢測準(zhǔn)確性、敏感度、特異度）。結(jié)果" 熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的陽性檢出率高于常規(guī)RT-PCR檢測（P＜0.05）。熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的檢測準(zhǔn)確性、敏感度、特異度高于常規(guī)RT-PCR檢測（P＜0.05）。結(jié)論" 熒光定量RT-PCR在GⅠ型、GⅡ型諾如病毒診斷中具有較高檢測效能。

關(guān)鍵詞：諾如病毒；熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；GⅠ型；GⅡ型；檢測效能

中圖分類號：R445.1" " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.06.022

文章編號：1006-1959（2025）06-0127-04

Detection Efficiency of Fluorescence Quantitative Reverse Transcription

Polymerase Chain Reaction for GⅠ and GⅡ Norovirus

XIAO Chaoguang

（Inspection Unit， Nanchang Wanli Administration Center for Disease Control and Prevention， Nanchang 330004， Jiangxi， China）

Abstract： Objective" To explore the detection efficiency of fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） for GⅠ and GⅡ norovirus （NV）. Methods" From December 2020 to December 2023， 50 patients with suspected NV infection admitted to the Nanchang Wanli Administration Center for Disease Control and Prevention from December 2020 to December 2023 were selected as the research objects. Their fecal samples were collected and tested by conventional RT-PCR and fluorescence quantitative RT-PCR in turn. The positive detection rate and detection efficiency （detection accuracy， sensitivity， specificity） of the two test methods were compared. Results" The positive detection rate of GⅠ and GⅡ norovirus by fluorescence quantitative RT-PCR was higher than that by conventional RT-PCR （Plt;0.05）. The detection accuracy， sensitivity and specificity of GⅠ and GⅡ norovirus by fluorescence quantitative RT-PCR were higher than those by conventional RT-PCR （Plt;0.05）. Conclusion" Fluorescence quantitative RT-PCR has a high detection efficiency in the diagnosis of GⅠ and GⅡ norovirus.

Key words： Norovirus; Fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; GⅠ type; GⅡ type; Detection efficiency

諾如病毒（Norovirus， NV）是引發(fā)急性胃腸炎的主要病原體之一，以GⅠ型、GⅡ型最為常見，其傳播途徑廣、感染劑量低、病毒變異快，易引發(fā)諾如病毒感染聚集性疫情，對我國公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了一定威脅，病毒的準(zhǔn)確檢驗及快速管控是降低其傳播風(fēng)險的重要前提[1，2]。近年來，隨著諾如病毒全基因及部分序列的逐步測定，分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于該病毒的檢驗及臨床研究中，其中，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）為當(dāng)前常用病毒檢測方式，該技術(shù)可通過RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增等過程，獲取目的基因序列及其表達(dá)水平[3，4]。在此基礎(chǔ)上，熒光定量RT-PCR可將熒光基團加入其PCR擴增反應(yīng)體系中，利用其熒光信號的實時表達(dá)，實現(xiàn)病毒RNA的定量檢測[5，6]。為了進(jìn)一步探究熒光定量RT-PCR在NV檢測中的應(yīng)用價值，本研究結(jié)合2020年12月-2023年12月南昌市灣里管理局疾病預(yù)防控制中心收治的50例疑似NV感染患者，分析熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型NV的檢測效能，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料" 以2020年12月-2023年12月南昌市灣里管理局疾病預(yù)防控制中心收治的50例疑似NV感染患者為研究對象，男29例，女21例，年齡18～68歲，平均年齡（33.84±7.65）歲，以上受檢者均以惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等消化道癥狀為主訴就診，所有研究對象均知情且自愿參與本次研究。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn)" 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床初步診斷為疑似NV感染；②可按要求采集糞便樣本；③取樣前未服用抗病毒藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他消化道疾病者；②伴全身感染者；③遺傳代謝疾病史者；④糞便樣本采集不合格者。

1.3方法

1.3.1 RNA提取" 采用西安天隆CqEx-DNA/RNA病毒（CDC）核酸提取試劑盒對糞便樣本進(jìn)行處理，按試劑盒說明書提取RNA，隨后取50 μl DEPC水溶液用于RNA沉淀的溶解，靜置2 min后，離心處理（4000 r/min，20 min），隨后取上清液分為兩份，開始以下檢測。

1.3.2常規(guī)RT-PCR" 取逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海伯杰醫(yī)療科技股份有限公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，其過程嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系共25 μl，包括2.5 μl 反應(yīng)緩沖液（10×PCR Buffer）、0.5 U 耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、3 μl脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、3 μl互補脫氧核糖核酸（cDNA）與2.5 μl引物混合物，剩余取滅菌蒸餾水補足。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性處理3 min→94 ℃變性處理30 s→54 ℃退火處理30 s→72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.3.3熒光定量RT-PCR" 逆轉(zhuǎn)錄步驟同上，PCR反應(yīng)體系為20 μl，包括10 μl 2×Premix Ex Taq、0.4 μl 50×ROX Reference Dye Ⅱ、2 μl cDNA、3.2 μl引物混合物、0.8 μl探針，剩余取滅菌蒸餾水補足。反應(yīng)條件：50 ℃處理2 min→95 ℃預(yù)變性處理30 s→95 ℃變性處理5 s→60 ℃退火處理34 s，共40個循環(huán)，于60 ℃條件下收集其熒光信號，獲取CT值，繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4觀察指標(biāo)" ①比較兩種檢驗方式的陽性檢出率；②以最終診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種檢驗方式的檢測效能，包括診斷準(zhǔn)確性、敏感度與特異度。診斷準(zhǔn)確性=（真陽性+真陰性）/總例數(shù)×100%；敏感度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法nbsp; 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（x±s）表示，組間行t檢驗對比，計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間行χ2檢驗分析，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩種檢驗方式的陽性檢出率比較" 熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的陽性檢出率高于常規(guī)RT-PCR檢測（χ2=4.105，P=0.043），見表1。

2.2兩種檢驗方式的檢測效能比較" 熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的檢測準(zhǔn)確性、敏感度、特異度高于常規(guī)RT-PCR檢測（P＜0.05），見表2、表3。

3討論

諾如病毒是人類杯狀病毒科諾如病毒屬的原型代表株，為單股正鏈RNA病毒，具有較高的傳染性及傳播能力，易引起非細(xì)菌性腹瀉爆發(fā)，導(dǎo)致公共衛(wèi)生安全問題，在此背景下，尋求特異、靈敏、快速的檢測方法對諾如病毒感染的防控具有重要意義[7，8]。目前，病原學(xué)檢查為諾如病毒診斷金標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)以RT-PCR等分子生物學(xué)檢測方法最為常見，其中，常規(guī)RT-PCR檢測技術(shù)可充分利用RNA逆轉(zhuǎn)錄與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等步驟，完成特定RNA序列的復(fù)制與擴增，實現(xiàn)病毒的定性、定量檢驗[9，10]。常規(guī)RT-PCR檢測方案成本較低、應(yīng)用廣泛，但其操作繁瑣、敏感性中等，存在一定污染風(fēng)險及非特異性擴增問題，應(yīng)用局限性明顯[11，12]。熒光定量RT-PCR則是基于RT-PCR檢測體系制定的精確化分析手段，可利用熒光基團的加入，憑借其熒光信號的累積情況，反映PCR擴增體系中循環(huán)擴增產(chǎn)物的變化，以此實現(xiàn)PCR進(jìn)程的實時監(jiān)測，完成目標(biāo)分子的定量檢測[13，14]。近年來，該技術(shù)已日益成熟，其操作簡單、敏感性高，可增加定量檢測的精確性，在基因表達(dá)分析及病毒載量檢測中具有較高應(yīng)用價值[15，16]。

本研究結(jié)果顯示，熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的陽性檢出率高于常規(guī)RT-PCR檢測（P＜0.05），提示熒光定量RT-PCR在GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的篩查中具有更高檢測價值。分析認(rèn)為，常規(guī)RT-PCR檢測為非特異性測定方式，僅可反映病毒核酸的總載量，無法實現(xiàn)擴增反應(yīng)的實時檢測，存在定量不準(zhǔn)確等問題，易引發(fā)漏檢、誤檢等情況[17]。相較之下，熒光定量PCR加入了熒光信號采集系統(tǒng)與計算機分析處理系統(tǒng)，可借助熒光信號監(jiān)測擴增循環(huán)產(chǎn)物的積累情況，實時掌握擴增進(jìn)程的同時，通過熒光曲線及Cq 值等參數(shù)，完成目標(biāo)病毒的定量檢測，其精確性更高，檢出效果更佳[18，19]。本研究顯示，熒光定量RT-PCR對GⅠ型、GⅡ型諾如病毒的檢測準(zhǔn)確性、敏感度、特異度高于常規(guī)RT-PCR檢測（P＜0.05），表明熒光定量RT-PCR對諾如病毒的診斷效能優(yōu)于常規(guī)RT-PCR檢測。究其原因，常規(guī)RT-PCR檢測技術(shù)僅可對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進(jìn)行分析，無法完成起始模板的準(zhǔn)確定量，其對病毒RNA質(zhì)量的依賴性較高，易受到逆轉(zhuǎn)錄酶及PCR引物等因素的影響，隨著循環(huán)次數(shù)的增多，其產(chǎn)物的擴增偏離模板劑量較不可控，檢測效能較為有限[20，21]。熒光定量RT-PCR則可充分利用擴增循環(huán)中的熒光表達(dá)，測定PCR的最終產(chǎn)物量，用于諾如病毒的檢測，其操作過程均于封閉體系下完成，大大降低了污染概率，且解決了常規(guī)RT-PCR只能終點檢測的局限性問題，其熒光信號檢測可覆蓋每輪循環(huán)，避免了擴增偏離引起的檢測誤差，有效降低了反應(yīng)的非特異性，具有更高的檢測準(zhǔn)確性、敏感度及特異度[22，23]。

綜上所述，熒光定量RT-PCR在GⅠ型、GⅡ型諾如病毒診斷中具有較高檢測效能，可為其病毒感染的診斷提供可靠參考信息，值得臨床應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊艷歌，吳占文，李濤，等. GI和GII諾如病毒ERA的可視化快速檢測[J].華南理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2023，51（12）：140-151.

[2]Dey SK，Sharif N.Evaluation of a rapid immunochromatography（IC） diagnosis kit for the detection of rotavirus and norovirus in diarrheal stool specimens in Bangladesh[J].International Journal of Infectious Diseases，2021，101（S1）：180-203.

[3]付瑤，劉海婷，施俊超，等.反轉(zhuǎn)錄酶在微小RNA實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)中的作用[J].實用檢驗醫(yī)師雜志，2023，15（2）：193-197.

[4]Chhabra P，Browne H，Huynh T，et al.Single-step RT-PCR assay for dual genotyping of GI and GII norovirus strains[J].J Clin Virol，2021，134：104689.

[5]Bonura F，Urone N，Bonura C，et al.Recombinant GII.P16 genotype challenges RT-PCR-based typing in region A of norovirus genome[J].J Infect，2021，83（1）：69-75.

[6]王娉，田卓，齊欣，等.聚乙二醇沉淀富集和預(yù)擴增反轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)高靈敏檢測小漿果中低濃度甲型肝炎病毒[J].分析化學(xué)，2022，50（8）：1168-1178.

[7]Quee FA，de Hoog MLA，Schuurman R，et al.Community burden and transmission of acute gastroenteritis caused by norovirus and rotavirus in the Netherlands （RotaFam）： a prospective household-based cohort study[J].Lancet Infect Dis，2020，20（5）：598-606.

[8]Han Y，Wang J，Zhang S，et al.Rapid detection of norovirus genogroup II in clinical and environmental samples using recombinase polymerase amplification[J].Anal Biochem，2020，605：113834.

[9]溫靜，鄭天馳，王希峰，等.2019年北京市大興區(qū)諾如病毒GI引起急性胃腸炎疫情的病原學(xué)分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2021，31（14）：1783-1786.

[10]卞蓮蓮，王一平，孫世洋，等.基于疊氮溴化丙錠-定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的甲型肝炎疫苗病毒滴度快速檢測方法[J].中國病毒病雜志，2020，10（6）：421-425.

[11]祝琳，佟靖軒，姚秀林，等.2017-2019年撫順市急性胃腸炎患者諾如病毒檢測結(jié)果分析[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2020，43（5）：337-339.

[12]趙躍麗，饒清，孫強明，等.糞便標(biāo)本中諾如病毒GⅡ拷貝數(shù)定量檢測方法的建立和應(yīng)用[J].中國感染控制雜志，2020，19（10）：864-870.

[13]紀(jì)蕾，劉光濤，劉彬輝，等.一起GⅠ、GⅡ型諾如病毒混合感染疫情的病原鑒定及基因特征分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2020，30（13）：1567-1570，1573.

[14]黃晨璐，許偉，胡乾坤，等.實時熒光核酸恒溫擴增試驗和定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)對血清乙型肝炎病毒RNA定量檢測的一致性評價[J].微生物與感染，2020，15（3）：158-165.

[15]賈添慧，董蕾，王永杰，等.牡蠣中GⅡ型諾如病毒巢式RT-PCR檢測方法的優(yōu)化與評價[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報，2021，30（2）：239-246.

[16]曲莉，王洪艷，李環(huán)，等.常規(guī)RT-PCR快速檢測諾如病毒方法的建立[J].北華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2020，21（2）：188-190.

[17]顏偉，張靜，吳杰，等. 2017-2018年濱州市病毒性腹瀉流行病學(xué)特征及病原學(xué)監(jiān)測分析[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2020，20（2）：264-266，278.

[18]Skyum F，Chen M，Mogensen CB.Evaluation of a new fast in-house Real-Time PCR assay for detecting both Norovirus and toxigenic Clostridium difficile using fecal sample and rectal swab[J].Am J Infect Control，2022，50（1）：67-71.

[19]Jahne MA，Brinkman NE，Keely SP，et al.Droplet digital PCR quantification of norovirus and adenovirus in decentralized wastewater and graywater collections： Implications for onsite reuse[J].Water Res，2020，169：115213.

[20]陳海麗，楊春憶，張萬菊，等.2015-2016年上海地區(qū)成人門診腹瀉病例中諾如病毒GⅡ型流行特征[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2020，34（2）：145-150.

[21]嚴(yán)寒秋，王永全，崔海洋，等.應(yīng)用2種RT-PCR方法檢測和分析北京市市場銷售牡蠣中諾如病毒基因特征[J].中華流行病學(xué)雜志，2022，43（1）：92-97.

[22]毛瑞，曹三成，王增國，等.673例急性腹瀉患兒諾如病毒GⅠ、GⅡ型感染快速篩查結(jié)果分析[J].傳染病信息，2023，36（4）：351-354.

[23]Kulis-Horn RK，Tiemann C.Evaluation of a laboratory-developed test for simultaneous detection of norovirus and rotavirus by real-time RT-PCR on the Panther Fusion system[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2020，39（1）：103-112.

收稿日期：2024-02-19；修回日期：2024-02-28

編輯/成森