金盞花提取液對(duì)皮膚損傷的舒緩作用

目的：探究金盞花提取液保護(hù)皮膚損傷的舒緩作用。

方法：采用醇-水梯度提取法制備金盞花提取液，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）分析物質(zhì)成分。建立光誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞損傷模型、LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞及斑馬魚(yú)損傷模型及C48/80誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒模型，檢測(cè)細(xì)胞或組織損傷后的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）及炎癥因子等指標(biāo)。

結(jié)果：金盞花提取液能降低角質(zhì)細(xì)胞光損傷后炎癥因子（PGE2、IL-6、COX2）的產(chǎn)生（P<0.001）；能通過(guò)MyD88信號(hào)通路降低LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子（IL-1β、IL-8）的產(chǎn)生（P<0.001）；能抑制C48/80刺激肥大細(xì)胞引起的脫顆粒現(xiàn)象（P<0.01）；能降低LPS刺激斑馬魚(yú)ROS的產(chǎn)生（P<0.001）。

結(jié)論：金盞花提取液具有保護(hù)皮膚損傷的舒緩作用。

關(guān)鍵詞：金盞花提取液；炎癥因子；氧化應(yīng)激；舒緩作用

金盞花（Calendula officinalis L.）為菊科金盞花屬植物，含有類黃酮、三萜類化合物、糖苷、皂苷、類胡蘿卜素、揮發(fā)油、氨基酸、類固醇、甾醇和奎寧等成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎及抗病毒等作用，它還應(yīng)用于治療各種皮膚疾病，包括皮膚炎癥、開(kāi)放性傷口和出血的撕裂傷[1]。

作為身體的外部屏障，皮膚不可避免地長(zhǎng)期暴露在外部環(huán)境中，紫外線輻射、病原體或化學(xué)刺激物接觸等都可以導(dǎo)致皮膚炎癥[2-3]。炎癥因子能夠加速氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧自由基會(huì)損傷細(xì)胞和降解結(jié)構(gòu)成分，如膠原蛋白和彈性蛋白，炎癥因子與氧自由基能夠協(xié)同引起DNA的損傷，最終導(dǎo)致皮膚衰老[4]。

為研究金盞花提取液對(duì)皮膚炎癥的舒緩作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外線（UV）誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞、脂多糖（LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞與斑馬魚(yú)、C48/80誘導(dǎo)肥大細(xì)胞構(gòu)建皮膚損傷模型，檢測(cè)金盞花提取液對(duì)角質(zhì)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌、斑馬魚(yú)ROS含量與肥大細(xì)胞脫顆粒的影響。結(jié)果表明，金盞花提取液對(duì)光誘導(dǎo)損傷角質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子（PGE2、IL-6、COX2）與LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎癥因子（IL-1β、IL-8）表達(dá)有顯著抑制作用，且實(shí)驗(yàn)表明，金盞花提取液通過(guò)MyD88炎癥通路調(diào)控炎癥水平。此外，金盞花提取液還能夠使LPS誘導(dǎo)斑馬魚(yú)產(chǎn)生ROS的含量與C48/80誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒率顯著下降。因此，金盞花提取液具有保護(hù)皮膚損傷的舒緩作用。

Part 1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

試劑：金盞花提取液（上海輝文生物技術(shù)股份有限公司）；角質(zhì)形成細(xì)胞（中科院細(xì)胞庫(kù)）；巨噬細(xì)胞（中科院細(xì)胞庫(kù)）；肥大細(xì)胞（中科院細(xì)胞庫(kù)）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；FBS （gibco）；雙抗（gibco）；PBS（生工）；地塞米松（sigma）；LPS （sigma）；BSA （Beyotime）；TritonX 100 （Beyotime）；COX2 （abcam）；MyD88 Antibody（Thermo）；二抗（abcam）；DAPI （abcam）；三卡因（aladdin）；胚胎培養(yǎng)液（上海費(fèi)曦）；C48/80 （Sigma）；色甘酸鈉（Sigma）；PGE2 ELISA Kit （elabscience）；Human IL-6 ELISA Kit （elabscience）；Mouse IL-1β ELISA Kit（elabscience）；Mouse IL-8 ELISA Kit （酶聯(lián)生物）；ROS檢測(cè)試劑盒（Beyotime）。

儀器：高效液相色譜儀（Thermo）；質(zhì)譜儀（Thermo）；酶標(biāo)儀（Tecan）；倒置熒光顯微鏡（明美）；水浴鍋（SENCO）；旋渦震蕩儀（大龍）；電子秤（舜宇恒平）；移液器（大龍）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；紫外輻照燈（飛利浦）；輻照劑量?jī)x（泰瑪斯）；斑馬魚(yú)循環(huán)系統(tǒng)（杭州環(huán)特）；配魚(yú)缸（杭州環(huán)特）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金盞花提取液的制備及LC-MS組分分析

將干燥金盞花粉碎，按照1：10的料液比加入1，3-丙二醇溶液，于50℃保溫提取3 小時(shí)，過(guò)濾；按照1：40料液比在濾渣中加入70%乙醇，于50℃保溫提取4小時(shí)，過(guò)濾，按照相同料液比加入純水復(fù)提一次，將乙醇提取液與水提取液合并，濃縮至無(wú)乙醇，洗脫 AB-8 樹(shù)脂，收集純水洗液與 70%乙醇洗液，合并濃縮至無(wú)乙醇，將 1，3-丙二醇溶液提取液與濃縮洗液合并即得。

色譜條件：流速為0.3mL/min，進(jìn)樣量為10μl，流動(dòng)相采用0.1%甲酸/乙腈（B）-0.1%甲酸/水（A）。溶液的梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

質(zhì)譜條件：離子源溫度、毛細(xì)管溫度分別為310℃和 320℃，鞘氣流速、輔助氣流速分別為30單位和10單位，正、負(fù)離子模式噴霧電壓分別為2kV和2.8kV。分析采用數(shù)據(jù)以來(lái)掃描分析儀（DDA）。

1.2.2角質(zhì)細(xì)胞急性毒性檢測(cè)

將角質(zhì)細(xì)胞接種至96孔板，培養(yǎng)48-72h后待細(xì)胞生長(zhǎng)至30%，以高糖DMEM完全培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)體系，使空白組只含培養(yǎng)基，樣品組分別含15%、7.5%、5%、2.5%、1%和0.5%金盞花提取液，加樣后的96孔板放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)48h后，棄上清，加250μl預(yù)熱的DPBS清洗細(xì)胞一次，棄去DPBS后加入250μl含中性紅的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h，用DPBS清洗一次，每孔加入100μl中性紅解析液，振蕩器上避光孵育20-45min，形成均一的溶液。靜置5min后，于酶標(biāo)儀上540nm處讀取吸光度值。[5]

1.2.3光誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞模型及炎癥因子的檢測(cè)

將角質(zhì)細(xì)胞接種至24孔板，培養(yǎng)18-24h后待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%，對(duì)除空白外的實(shí)驗(yàn)組換液為PBS采用UV誘導(dǎo)，誘導(dǎo)完成后棄去上清，以高糖DMEM完全培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)體系，使空白組和模型組只含培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組含100μg/mL地塞米松，樣品組分別含0.5%和1%金盞花提取液，加樣后的24孔板放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

24h后按照ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清中炎癥因子（PGE2、IL-6）的含量。細(xì)胞用PBS洗滌，0.5%TritonX-100通透20min，10%BSA封閉1h；PBS洗滌，加入COX2抗體溶液至覆蓋細(xì)胞，4℃孵育過(guò)夜；PBS洗滌，加入100μl二抗溶液至覆蓋細(xì)胞，于37℃孵育1h；加入DAPI孵育10min，PBS洗滌，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，所得熒光圖片采用 Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞模型及炎癥因子的檢測(cè)

將巨噬細(xì)胞接種至24孔板，培養(yǎng)18-24h后待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%，以高糖DMEM完全培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)體系，除空白外的實(shí)驗(yàn)組加入1μg/mL LPS誘導(dǎo)6h，誘導(dǎo)完成后棄去上清，按照1.2.3的空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及樣品組分別給藥，培養(yǎng)24h后收集上清檢測(cè)炎癥因子（IL-1β、IL-8）及MyD88的含量，方法同1.2.3。

1.2.5 LPS誘導(dǎo)斑馬魚(yú)模型檢測(cè)ROS

收集野生型AB品系成年斑馬魚(yú)交配所得的胚胎，將孵育48hpf的斑馬魚(yú)幼魚(yú)健康個(gè)體分組放至24孔板中，空白組加入1mL胚胎培養(yǎng)液，其余組加入10μg/mL的1mL胚胎培養(yǎng)液，于28℃生化培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)，誘導(dǎo)24h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，空白組與模型組加入1mL胚胎培養(yǎng)液，其余組分別加入含0.5%、1%金盞花提取液的1mL胚胎培養(yǎng)液，于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

用試劑盒中的染色探針?lè)跤?h，孵育結(jié)束后用PBS沖洗并在0.003%的三卡因（MS-222）麻醉液中麻醉，單個(gè)斑馬魚(yú)幼魚(yú)熒光強(qiáng)度用酶標(biāo)儀進(jìn)行量化，使用熒光顯微鏡觀察染色幼魚(yú)的圖像。

1.2.6 C48/80誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒模型

收集肥大細(xì)胞，以無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)體系，將細(xì)胞稀釋至6×104/mL，按照細(xì)胞溶液與樣品溶液為1：1的比例接種至24孔板，使得每孔約3×104個(gè)細(xì)胞，空白組只含基礎(chǔ)培養(yǎng)體系，模型組含25μg/mL C48/80，陽(yáng)性對(duì)照組含25μg/mL C48/80與1mg/mL色甘酸鈉，樣品組含25μg/mL C48/80與對(duì)應(yīng)濃度（0.5%及1%）的金盞花提取液。培養(yǎng)30min，冰浴終止反應(yīng)。在顯微鏡下觀察各組細(xì)胞脫顆粒情況并拍照。采用 ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

圖片數(shù)據(jù)采用ImageJ軟件分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用GraphPad Prism8軟件進(jìn)行ANOVA方差分析。

Part 2結(jié)果

2.1 金盞花提取液的LC-MS組分分析結(jié)果

LCMS數(shù)據(jù)（見(jiàn)圖1、圖2）經(jīng)Compound discover軟件分析比對(duì)，保留匹配度較高的化學(xué)成分，峰面積占比高于1 %的化學(xué)成分見(jiàn)表2。其中，金盞花提取液的主要活性成分為金盞花苷E，可通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生及抑制LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，為金盞花提取液具有舒緩功效提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[7-8] 。

2.2角質(zhì)細(xì)胞急性毒性結(jié)果

金盞花提取液在1%和0.5%濃度下的細(xì)胞活力均高于90%，可見(jiàn)無(wú)細(xì)胞毒性，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)在該濃度下進(jìn)行（見(jiàn)表3）。[5-6]

2.3光誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞模型檢測(cè)炎癥因子

皮膚過(guò)度暴露于紫外線輻射可導(dǎo)致皮膚老化和皮膚病，UVB可以到達(dá)表皮和真皮表層，對(duì)皮膚造成直接傷害，UVA可以深入滲透到表皮和真皮的基底層，并誘導(dǎo)與活性氧（ROS）過(guò)量產(chǎn)生相關(guān)的細(xì)胞損傷和光老化。作為皮膚最外層的屏障，角質(zhì)形成細(xì)胞是紫外線輻射的主要目標(biāo)。UVA 和 UVB 照射都會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥，從而破壞皮膚屏障并在皮膚上產(chǎn)生皺紋，從而導(dǎo)致皮膚損傷。[9]

角質(zhì)細(xì)胞受到刺激后可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，在皮膚的免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[10]。白細(xì)胞介素6（IL-6） 在感染和組織損傷時(shí)迅速產(chǎn)生，可通過(guò)免疫反應(yīng)促進(jìn)宿主防御[11]。前列腺素E2（Prostaglandin E2， PGE2）是花生四烯酸在環(huán)氧合酶（COX）催化下產(chǎn)生，能夠引發(fā)疼痛、發(fā)熱及炎癥等多種反應(yīng)[12-13]。

與空白組相比，模型組炎癥因子的分泌顯著增加（p<0.001）；與模型組相比，陽(yáng)性組炎癥因子的分泌顯著降低（p<0.001）；0.5%及1%金盞花提取液組的炎癥因子均顯著降低（p<0.001），對(duì)PGE2的降低率分別為24.21%和32.72% （見(jiàn)圖3），對(duì)IL-6的降低率分別為23.56%和34.25% （見(jiàn)圖4），對(duì)COX2的降低率分別為33.63%、49.61% （見(jiàn)圖5、圖6）。

2.4 LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞模型檢測(cè)炎癥因子

白細(xì)胞介素-1β （IL-1β）由先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞（如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）受到刺激時(shí)產(chǎn)生，是一種促細(xì)胞炎癥因子，白細(xì)胞介素-8由巨噬細(xì)胞等各種組織細(xì)胞暴露于炎癥刺激（如白細(xì)胞介素-1）時(shí)釋放，二者對(duì)細(xì)胞炎癥的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要。[14-15]

與空白組相比，模型組炎癥因子的分泌顯著增加（p<0.001）；與模型組相比，陽(yáng)性組炎癥因子的分泌顯著降低（p<0.001）； 0.5%及1%金盞花提取液組的炎癥因子均顯著降低（p<0.001），對(duì)IL-1β的降低率分別為28.05%和35.56% （見(jiàn)圖7），對(duì)IL-8的降低率分別為24.28%和28.51% （見(jiàn)圖8）。

2.5 LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞模型炎癥通路研究

MyD88信號(hào)通路是機(jī)體炎癥體系中的重要途徑，廣泛存在于各種組織細(xì)胞中，參與多種疾病的發(fā)生與調(diào)控。MyD88是經(jīng)典炎癥通路TLR/MyD88/NF-κB中的重要節(jié)點(diǎn)，能被TLR （一種能夠識(shí)別多種類型病原并引起機(jī)體炎癥免疫應(yīng)答的蛋白）激活，且在LPS活化通路中起重要作用[16-17]。

與空白組相比，模型組MyD88的表達(dá)量顯著提高（p<0.001）；與模型組相比，0.5%和1%金盞花提取液組MyD88表達(dá)量顯著降低，降低率分別為16.52% （p<0.05）和26.57% （p<0.01） （見(jiàn)圖9、圖10）。

2.6 LPS誘導(dǎo)斑馬魚(yú)模型檢測(cè)ROS

LPS可誘導(dǎo)斑馬魚(yú)產(chǎn)生炎癥，使炎癥因子和ROS水平升高[17]，活性氧可激活無(wú)數(shù)信號(hào)通路，能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，使膠原蛋白的生成減少，加速皮膚老化并被認(rèn)為是內(nèi)在衰老的主要原因[18]。

與空白組相比，模型組中ROS含量顯著增加（p<0.001）。與模型組相比，0.5%和1%金盞花提取物均可以顯著降低ROS含量（p<0.001），下降率分別為29.07%和66.67%（見(jiàn)圖11、圖12）。

2.7 C48/80誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒模型

肥大細(xì)胞是一種分布在身體不同部位的免疫細(xì)胞，能夠釋放活性介質(zhì)以相應(yīng)不同的刺激，如C48/80可刺激肥大細(xì)胞釋放組胺引起細(xì)胞脫顆粒，其在超敏反應(yīng)及神經(jīng)性疼痛的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[20]。

0.5%及1%金盞花提取液均可以使肥大細(xì)胞脫顆粒率顯著下降，下降率分別為25.52%（p<0.01）及38.07% （p<0.001） （見(jiàn)圖13、圖14）。

Part 3結(jié)論

本研究采用多種炎癥損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討了金盞花提取液的抗炎舒緩作用。結(jié)果表明，金盞花提取物對(duì)LPS和C48/80等經(jīng)典刺激信號(hào)及紫外線造成的損傷具有一定程度的抗炎及舒緩作用，對(duì)MyD88通路的研究提示金盞花提取物的抗炎作用廣泛，為金盞花提取物的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了更深入與全面的參考依據(jù)。

作者介紹

第一作者 王璐君：助理工程師，供職于上海輝文生物技術(shù)股份有限公司

第二作者 劉玉晨：中級(jí)工程師，供職于上海輝文生物技術(shù)股份有限公司

通訊作者 費(fèi)維成：高級(jí)工程師，供職于上海輝文生物技術(shù)股份有限公司，郵箱：fwc95135@21wenda.com

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