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    不同除菌方式對豬小腸肝素效價、廢水蛋白含量及微生物菌群的影響

    2025-04-12 00:00:00全潤吳曉龍種正晨劉容旭張俊杰王語聰謝智鑫韓建春劉丹怡
    肉類研究 2025年3期

    摘 要:為減少豬小腸肝素提取過程中的微生物污染,采用微酸性電解水(slightly acidic electrolyzed water,SAEW)對豬小腸進行除菌處理,比較直接浸泡、超聲浸泡及噴霧3 種除菌方式對豬小腸減菌率、肝素效價及肝素廢水蛋白含量的影響,以篩選最佳除菌方式,利用16S rRNA高通量測序分析最佳除菌方式處理后豬小腸微生物菌群的組成和變化。結(jié)果表明,在最佳除菌條件下,3 種除菌方式的除菌效果差異不明顯。其中,噴霧除菌對肝素效價和廢水蛋白含量影響較小,故選作豬小腸肝素提取前的除菌方式。16S rRNA高通量測序結(jié)果表明,有效氯質(zhì)量濃度達到75 mg/L后,SAEW噴霧除菌能有效殺滅乳球菌屬(Lactococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)和嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)等豬小腸優(yōu)勢菌屬,減少豬小腸肝素微生物污染。

    關(guān)鍵詞:微酸性電解水;肝素;噴霧除菌;微生物菌群

    Effect of Different Sterilization Treatments on Heparin Titer, Protein Content in Wastewater and Microflora in Porcine Small Intestine

    QUAN Run1, WU Xiaolong1, CHONG Zhengchen1, LIU Rongxu2, ZHANG Junjie3, WANG Yucong1,

    XIE Zhixin1, HAN Jianchun1,2,*, LIU Danyi2,*

    (1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Heilongjiang Institute of Green Food Science, Harbin" "150028, China; 3. Heilongjiang Hanheng Environmental Protection Technology Co. Ltd., Harbin 150000, China)

    Abstract: To reduce microbial contamination during heparin extraction from porcine small intestines, this study employed slightly acidic electrolyzed water (SAEW). The sterilization effects of three SAEW treatments: direct immersion, ultrasonic-assisted immersion and spraying were evaluated as well as their influences on the bacterial reduction rate," heparin titer and the protein content of wastewater to screen the best sterilization treatment. 16S rRNA high-throughput sequencing was used to analyze the composition and changes of microflora in porcine small intestine after the best sterilization treatment. The results showed that under optimal conditions, there was no significant difference in the sterilization effect of the three methods. Of these, spray treatment had the least effect on the heparin titer and the protein content of wastewater, and was thus selected for sterilization before heparin extraction. High-throughput 16S rRNA gene sequencing revealed that spraying SAEW to an available chlorine concentration of 75 mg/L killed the dominant genera in the porcine small intestine, such as Lactococcus, Vagococcus and Psychrobacter, reducing the microbial contamination of porcine small intestinal heparin.

    Keywords: slightly acidic electrolyzed water; heparin; spray sterilization; microbial flora

    DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20240926-254

    中圖分類號:TS251.9" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼:A 文章編號:1001-8123(2025)03-0018-11

    引文格式:

    全潤, 吳曉龍, 種正晨, 等. 不同除菌方式對豬小腸肝素效價、廢水蛋白含量及微生物菌群的影響[J]. 肉類研究, 2025, 39(3): 18-28. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20240926-254." " http://www.rlyj.net.cn

    QUAN Run, WU Xiaolong, CHONG Zhengchen, et al. Effect of different sterilization treatments on heparin titer, protein content in wastewater and microflora in porcine small intestine[J]. Meat Research, 2025, 39(3): 18-28. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20240926-254." " http://www.rlyj.net.cn

    豬小腸是消化與吸收的主要器官,同時也是非特異性免疫反應(yīng)的重要場所,這決定了小腸黏膜含有特殊的生理活性成分,如堿性磷酸酶、硫酸皮膚素、肝素和小腸黏膜蛋白(肽)等[1-2]。其中,肝素是由動物結(jié)締組織肥大細胞產(chǎn)生的黏多糖,具有抗凝血性,作為抗凝劑應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)[3]。肝素多以新鮮豬小腸為原料進行生產(chǎn),然而豬小腸內(nèi)含有大量微生物,若保存不當會導(dǎo)致小腸中肝素組分被微生物及其代謝產(chǎn)物(酶)分解,進而造成得率下降,微生物代謝產(chǎn)生的毒素也會污染肝素廢水蛋白,造成不必要的損失。然而,目前國內(nèi)外對于豬小腸除菌技術(shù)研究甚少。因此,開發(fā)合理的除菌方法對提升肝素品質(zhì)和回收肝素廢水蛋白具有重要意義。

    微酸性電解水(slightly acidic electrolyzed water,SAEW)是使用無隔膜技術(shù),通過微弱的直流電壓電解氯化鈉溶液生成的pH值在5.0~6.5之間且具有強氧化特性的功能水[4]。SAEW能夠通過破壞微生物細胞膜結(jié)構(gòu)、改變細胞內(nèi)環(huán)境導(dǎo)致其死亡[5-6]。與其他消毒劑相比,SAEW具有殺菌高效、貯藏穩(wěn)定、無毒且無殘留等優(yōu)勢[7-8]。

    趙莉等[9]研究SAEW、臭氧化水、次氯酸鈉溶液和超聲處理對鮮食花生保鮮效果的影響,結(jié)果表明,SAEW和次氯酸鈉溶液能夠有效控制微生物生長,以SAEW更安全。姜曉東等[10]研究SAEW和冷鹽水預(yù)處理對虹鱒魚肉貯藏品質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)SAEW抑制魚肉微生物數(shù)量增長、維持魚肉品質(zhì)的效果優(yōu)于冷鹽水。

    在實際應(yīng)用中,除采用SAEW直接浸泡、清洗處理外,還常將其與超聲和噴霧等技術(shù)聯(lián)用,以提高除菌效果。超聲在液體介質(zhì)中傳播時形成縱波,其周期性壓力變化易引起空化效應(yīng)??栈瘹馀萏查g產(chǎn)生的局部高溫高壓可破壞細胞結(jié)構(gòu),有效殺滅液體中的部分微生物[11]。超聲處理能夠加速SAEW的有效氯進入微生物細胞膜,達到更好的除菌效果。Feng Yabin等[12]比較單獨使用超聲、SAEW和2 種方式聯(lián)合使用清洗葡萄的除菌效果,發(fā)現(xiàn)超聲與SAEW聯(lián)用的除菌效果最好。此外,噴霧SAEW已經(jīng)被證明是一種有效的微生物殺滅技術(shù)。與直接浸泡相比,噴霧處理可避免污染物直接污染SAEW,從而避免其除菌效果減弱,這種處理方式已經(jīng)被用于溫室除菌[13]。

    本研究以SAEW為殺菌劑,分別對豬小腸進行直接浸泡、超聲浸泡及噴霧處理,探究不同除菌方式的除菌效果以及對豬小腸肝素效價、廢水蛋白的影響,確定最佳除菌方式,并分析最佳除菌方式下豬小腸微生物菌群變化,以期為豬小腸肝素提取前的除菌處理提供理論與技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    豬小腸源自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)三花豬。

    胰蛋白酶(250 U/mg) 浙江福軒生物科技有限公司;肝素標準品(純度>98.5%) 上海哈靈生物科技有限公司;牛血清蛋白標準品(純度>98%) 北京博奧拓達科技有限公司;肝素試劑盒 上海瑞番生物科技有限公司;平板計數(shù)瓊脂 上海力辰儀器科技有限公司;氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    T15-100STD酸性電解水(acidic electrolyzed water,AEW)設(shè)備 丹麥Danish Clean Water公司;HI83224余氯測試儀 青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司;RWP微納米氣泡發(fā)生器 江蘇如克環(huán)保設(shè)備有限公司;JC-100電熱恒溫培養(yǎng)箱 青島精誠儀器儀表有限公司;LDZX-30KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;JD-CJ-2S單人雙面垂直凈化工作臺 蘇州金大凈化工程設(shè)備有限公司;FE28 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 SAEW制備

    以氯化鈉和水為原料,使用AEW設(shè)備制備AEW(有效氯質(zhì)量濃度(available chlorine concentration,ACC)為700 mg/L、pH 2.15),在1 h內(nèi)使用以保持其活性。使用余氯測試儀測定其ACC,使用pH計測定其pH值。通過稀釋AEW制備SAEW(pH 6)。

    1.3.2 豬小腸肝素提取

    參考王忠民[14]的方法,采用酶解法提取豬小腸肝素。首先,將除菌處理前后的豬小腸以1∶1 100(g/mL)

    溶于20 mmol/L Tris-HCl(含1%(m/m)吐溫-20,pH 8.5)中,4 ℃、10 000 r/min離心20 min,收集上清液,即得肝素廢水。將沉淀凍干后與適量去離子水混合,料液比為1∶10(g/mL),調(diào)節(jié)pH值為8.1,加入4 g/100 mL氯化鈉,轉(zhuǎn)入恒溫水浴鍋,溫度達到40 ℃時加入2 g/100 mL胰蛋白酶,隨后在37 ℃保溫2 h。提取結(jié)束后,將溫度升至86 ℃,滅活胰蛋白酶10 min,然后在4 ℃、10 000 r/min離心15 min,收集上清液,即得豬小腸肝素溶液。

    1.3.3 除菌方式篩選

    豬小腸清洗干凈后,采用SAEW按照料液比

    1∶6(g/mL)浸泡豬小腸,或采用SAEW對豬小腸進行均勻噴霧,以豬小腸菌落總數(shù)與所提取肝素效價為指標篩選除菌條件與方式。

    1.3.3.1 直接浸泡

    豬小腸分別在ACC為0、25、50、75、100 mg/L的SAEW中浸泡120 s,確定最佳除菌ACC。豬小腸在ACC為75 mg/L的SAEW中分別浸泡0、60、120、180、240 s,確定最佳浸泡時間。

    1.3.3.2 超聲浸泡

    豬小腸分別在ACC為0、25、50、75、100 mg/L的SAEW中超聲浸泡120 s,超聲功率50 W,確定最佳除菌ACC。豬小腸在ACC為50 mg/L的SAEW中分別超聲浸泡0、60、120、180、240 s,超聲功率50 W,確定最佳超聲浸泡時間。在0、25、50、75、100 W超聲功率下,豬小腸在ACC為50 mg/L的SAEW中超聲浸泡120 s,確定最佳超聲功率。

    1.3.3.3 噴霧處理

    采用ACC為0、25、50、75、100 mg/L的SAEW對豬小腸均勻噴霧180 s,噴霧壓力100 MPa,確定最佳除菌ACC。采用ACC為75 mg/L的SAEW噴霧0、90、180、270、360 s,噴霧壓力100 MPa,確定最佳噴霧時間。在噴霧壓力80、90、100、110、120 MPa下,采用ACC為75 mg/L的SAEW噴霧180 s,確定最佳噴霧壓力。

    1.3.4 菌落總數(shù)測定

    根據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》測定豬小腸菌落總數(shù)。減菌率按下式計算:

    式中:N1為處理前的豬小腸菌落總數(shù)/(CFU/g);N2為處理后豬小腸菌落總數(shù)/(CFU/g)。

    1.3.5 肝素效價測定

    參考郭明珠[15]的天青A比色法測定豬小腸肝素效價,采用肝素試劑盒測定3 種除菌方式處理后豬小腸肝素效價。取肝素標準品(2 500 U)配制肝素標準溶液

    (2 U/mL),取肝素標準溶液配制一系列濃度梯度(0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4 U/mL)的標準溶液,分別加入0.5 mL天青顯色工作液(天青顯色液中加入5 倍體積的蒸餾水),在505 nm處測定吸光度并計算肝素效價,以吸光度為縱坐標,肝素效價(U/mL)為橫坐標繪制標準曲線。標準曲線方程為y=0.099 6x+0.015 4

    (R2=0.992)。將豬小腸肝素溶液按照一定比例稀釋后,在505 nm處測定吸光度,由標準曲線方程計算肝素效價。

    1.3.6 肝素廢水蛋白含量與組成測定

    采用雙縮脲法[16]測定肝素廢水蛋白含量。準確配制10 mg/mL牛血清蛋白標準溶液,并稀釋為一系列質(zhì)量濃度梯度(0、2、4、6、8、10 mg/mL)的標準溶液,分別向1 mL標準溶液中加入4 mL雙縮脲試劑混勻靜置20 min,在540 nm處測定吸光度,繪制標準曲線。標準曲線方程為y=0.047 3x+0.006 5(R2=0.999 3)。將除菌處理前后的肝素廢水按照一定比例稀釋后,向1 mL樣品中加入4 mL雙縮脲試劑,并混勻靜置20 min。在540 nm處測定吸光度,由標準曲線方程計算蛋白含量。

    參照唐嘉誠等[17]的方法并略作調(diào)整,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)測定肝素廢水蛋白組成。首先,將豬小腸清洗、翻面,刮取豬腸內(nèi)表面黏膜,真空冷凍干燥后精細研磨,作為未經(jīng)肝素提取的腸黏膜樣品。采用12%分離膠和6%濃縮膠將樣品蛋白和上樣緩沖液混合后,95 ℃加熱5 min使蛋白質(zhì)完全變性。每個樣品取10 μL進行凝膠電泳。電泳在恒壓120 V下進行,直至指示劑到達凝膠底1~2 cm處停止電泳。采用考馬斯亮藍R-250染色2 h,用脫色液脫色,直至蛋白條帶清晰可見。使用凝膠成像儀拍攝蛋白條帶,然后使用ImageJ軟件進行灰度分析。

    1.3.7 微生物組學(xué)分析

    分別采用ACC 0、25、50、75、100 mg/L的SAEW在110 MPa噴霧壓力下處理豬小腸270 s,收集豬小腸樣品并提取DNA,采用聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增技術(shù)對微生物16S rDNA V3~V4可變區(qū)進行PCR擴增,上游引物:338F:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’,下游引物:806R:5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

    委托北京奧維森基因科技有限公司進行測序,得到原始數(shù)據(jù)后利用Pear軟件進行質(zhì)控、去除錯位堿基和引物、過濾拼接。對相似度≥97%的有效片段進行操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類,與已建立的數(shù)據(jù)庫對比并進行分類注釋,從而實現(xiàn)基于OTU的多樣性分析。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    所有指標均進行3 次重復(fù)測定,使用SPSS 2019軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),采用最小顯著差異(least significant difference,LSD)法對各處理組數(shù)據(jù)進行多重比較,

    P<0.05為差異顯著,結(jié)果以平均值±標準差表示,使用Origin 2021軟件繪制相關(guān)圖表。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 直接浸泡對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    2.1.1 直接浸泡ACC對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    由圖1a可知,直接浸泡可有效地除去豬小腸中的細菌,隨著SAEW ACC的增加,豬小腸菌落總數(shù)顯著降低(P<0.05),除菌效果顯著增強。Tantratian等[18]使用不同ACC SAEW清洗新鮮牡蠣,除菌效果也隨著ACC的增加逐漸增強,與本研究結(jié)果一致。這是由于SAEW主要通過有效氯成分破壞細菌細胞膜結(jié)構(gòu)、影響細胞的代謝過程導(dǎo)致細菌死亡[19],ACC越高,SAEW的除菌效果越強。與ACC 0 mg/L相比,ACC達到75 mg/L時,菌落總數(shù)減少2.61(lg(CFU/g)),減菌率達(99.75±0.06)%,繼續(xù)增加ACC,減菌率增加不顯著(P>0.05)。因此,ACC達到一定水平時,即可取得較為理想的除菌效果,考慮到實際生產(chǎn)成本,選擇ACC 75 mg/L的SAEW進行直接浸泡除菌處理。

    如圖1b所示,隨著SAEW ACC的增加,肝素效價顯著降低(P<0.05)。SAEW的有效氯成分能夠破壞細胞膜結(jié)構(gòu),促進細胞內(nèi)活性成分釋放[20],導(dǎo)致更多肝素溶解于SAEW,進而降低肝素提取率。當ACC達到75 mg/L時,肝素效價為(9.26±0.18)U/mL,與0 mg/L相比,降低1.74 U/mL。

    2.1.2 直接浸泡時間對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    由圖2a可知,隨著浸泡時間的延長,豬小腸菌落總數(shù)顯著減少(P<0.05),除菌效果顯著增強,但減菌率在浸泡時間達到120 s后增加不顯著(P>0.05),減菌率達到(99.77±0.04)%。與浸泡0 s相比,浸泡180、240 s時菌落總數(shù)分別減少2.89、3.03(lg(CFU/g)),減菌率分別為(99.87±0.04)%和(99.90±0.03)%,除菌效果好且減菌率相當。浸泡時間過長時,SAEW會與豬小腸中的其他污染物發(fā)生相互作用,消耗SAEW中的有效氯成分[21],但殺菌效果已不顯著。因此,直接浸泡120 s即可實現(xiàn)豬小腸充分除菌。

    由圖2b可知,隨著浸泡時間的延長,肝素效價顯著降低(P<0.05)。一方面,SAEW能破壞細胞形態(tài)與結(jié)構(gòu),促進細胞內(nèi)容物釋放[22]。另一方面,SAEW作為一種pH 5.0~6.5的功能水,其微酸性對肝素活性結(jié)構(gòu)影響較小,可能導(dǎo)致少部分肝素-蛋白結(jié)合物溶解于SAEW[23-24]。

    浸泡時間越長,豬小腸與SAEW接觸時間越長,這將促進更多肝素溶解于SAEW。直接浸泡120 s的肝素效價為(9.57±0.09)U/mL,與浸泡0 s相比(未經(jīng)除菌處理),肝素效價減少1.98 U/mL。繼續(xù)延長浸泡時間,肝素效價降低不顯著(P>0.05),表明SAEW浸泡處理對肝素提取的影響有限,但處理時間延長可導(dǎo)致SAEW有效氯成分減少[25],SAEW對細菌細胞的破壞作用也隨之降低。

    2.2 超聲浸泡對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    2.2.1 超聲浸泡ACC對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    由圖3a可知,隨著SAEW ACC的增加,豬小腸菌落總數(shù)顯著減少(P<0.05),除菌效果顯著提高。Liu Xiaofang等[26]使用SAEW聯(lián)用超聲處理金槍魚,也發(fā)現(xiàn)ACC越高,除菌效果越好,與本研究結(jié)果一致。與ACC 0 mg/L相比,ACC 50 mg/L時菌落總數(shù)減少2.74(lg(CFU/g)),減菌率為(99.71±0.06)%,除菌效果優(yōu)于直接浸泡方式。這可能是由于超聲的空化效應(yīng)導(dǎo)致細菌的細胞壁和細胞膜破裂,有效氯成分可加快通過細菌細胞膜進入細胞,發(fā)揮殺菌作用[27-28]。繼續(xù)增加ACC,減菌率增加不顯著(P>0.05)。綜上,選擇ACC 50 mg/L的SAEW進行超聲浸泡除菌處理。

    由圖3b可知,ACC為0 mg/L時,超聲浸泡豬小腸肝素效價為(10.88±0.19)U/mL,而直接浸泡豬小腸肝素效價為(11.00±0.07)U/mL,2 種除菌處理方式對肝素效價影響差異不明顯。隨著ACC的增加,SAEW對豬小腸細胞的破壞作用增強,肝素效價顯著降低(P<0.05)。當ACC達到50 mg/L時,肝素效價為(9.37±0.15)U/mL,而直接浸泡肝素效價為(9.64±0.06)U/mL,超聲浸泡除菌會損耗更多的肝素。

    2.2.2 超聲時間對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    超聲波能夠增加微生物細胞膜通透性,甚至破壞細胞膜結(jié)構(gòu),進而促進SAEW的有效氯成分滲透到微生物細胞內(nèi)部,導(dǎo)致微生物死亡,而超聲時間和超聲功率是影響超聲波破壞細胞膜程度的關(guān)鍵因素[29]。由圖4a可知,隨著超聲時間的延長,豬小腸菌落總數(shù)顯著減少(P<0.05),超聲時間120 s時,豬小腸菌落總數(shù)減少2.76(lg(CFU/g)),減菌率為(99.82±0.03)%。繼續(xù)延長超聲時間至180、240 s時菌落總數(shù)分別減少2.96、3.09(lg(CFU/g)),菌落總數(shù)減少量高于直接浸泡處理,除菌效果更好,但是減菌率增加不顯著(P>0.05)。綜上,選擇超聲時間為120 s。

    由圖4b可知,隨著超聲時間的延長,肝素效價顯著降低(P<0.05)。與超聲0 s相比,超聲浸泡120 s時,肝素效價為(9.24±0.07)U/mL,減少2.69 U/mL,減少量高于直接浸泡(1.98 U/mL),這可能是由于超聲可破壞細胞膜,超聲時間延長可增加細胞膜破壞程度[30],進而促進SAEW的有效氯成分滲透,導(dǎo)致更多肝素-蛋白結(jié)合物溶解于SAEW。

    2.2.3 超聲功率對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    超聲波主要通過空化效應(yīng)、機械效應(yīng)、熱效應(yīng)及自由基效應(yīng)改變細胞膜通透性和破壞細胞膜結(jié)構(gòu)[31]。由圖5a可知,與超聲功率0 W相比,超聲功率25、50 W時菌落總數(shù)分別減少0.02、0.04(lg(CFU/g))(P>0.05),超聲功率達到75 W后,菌落總數(shù)減少0.31(lg(CFU/g))且減菌率達到(99.77%±0.04)%(P<0.05)。超聲功率越高,細胞膜結(jié)構(gòu)破壞程度越高,進而促進SAEW的有效氯成分進入細胞,核酸和蛋白質(zhì)等細胞膜內(nèi)成分釋放[32]。因此,選擇超聲功率為75 W。

    超聲功率增加會導(dǎo)致空化氣泡數(shù)量增多,空化作用增強,細胞破壞程度增加[33],進而導(dǎo)致更多肝素-蛋白結(jié)合物溶出。由圖5b可知,超聲功率75 W時,肝素效價為(9.23±0.10)U/mL,與超聲功率0 W相比減少0.33 U/mL,與未經(jīng)除菌處理相比減少2.80 U/mL,表明超聲能促進肝素溶解于SAEW。Zhang Liping等[34]研究發(fā)現(xiàn),300 W超聲處理2 h對豬小腸肝素提取效果較好。超聲處理產(chǎn)生的局部高壓與高溫能夠破壞豬小腸細胞膜,增加肝素提取得率,因此,超聲浸泡處理可能導(dǎo)致更多肝素溶于SAEW而損耗,進而降低肝素效價。但總體上,0~100 W超聲處理對肝素效價影響較小,可能是由于低超聲功率對豬小腸的破壞程度較小。

    2.3 噴霧處理對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    2.3.1 噴霧ACC對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    由圖6a可知,隨著SAEW ACC的增加,豬小腸菌落總數(shù)顯著減少(P<0.05)。但是,相同ACC下噴霧的除菌效果不及直接浸泡和超聲浸泡除菌方式。這可能是因為浸泡方式可使SAEW與豬小腸充分接觸,有效氯成分能夠充分發(fā)揮殺菌作用。這與Liu Chang等[35]的研究結(jié)果相似,浸泡比噴霧具有更大的接觸面積,浸泡除菌效果更好。但當ACC達到75 mg/L后,3 種除菌方式的除菌效果相差不大,噴霧、直接浸泡和超聲浸泡減菌率分別達到(99.55±0.04)%、(99.75±0.06)%和(99.82±0.03)%。繼續(xù)增加噴霧ACC,減菌率無顯著變化(P>0.05)。因此,選擇ACC為75 mg/L的SAEW進行噴霧處理。

    由圖6b可知,隨著噴霧ACC的增加,肝素效價逐漸降低。與ACC為0 mg/L相比,噴霧ACC為75 mg/L時,肝素效價為(11.41±0.01)U/mL,降低0.07 U/mL。噴霧處理的肝素效價遠高于直接浸泡的(9.26±0.18)U/mL和超聲浸泡的(9.11±0.48)U/mL,表明噴霧除菌方式的肝素損耗最小。與浸泡相比,噴霧能夠減少SAEW與豬小腸接觸,進而避免肝素溶于SAEW而損耗。

    2.3.2 噴霧時間對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    由圖7a可知,與噴霧時間0 s相比,其余噴霧時間的菌落總數(shù)均顯著減少(P<0.05),減菌率顯著升高(P<0.05),除菌效果顯著增加。Yuan Xingyun等[36]在不同噴霧時間,采用不同ACC的SAEW處理雞蛋,發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌等細菌的減少量與噴霧時間成正比,與本研究結(jié)果一致。延長噴霧時間有助于SAEW與豬小腸充分接觸,其有效氯成分可充分作用于豬小腸中的細菌,達到更好的除菌效果。但當處理時間大于270 s后,減菌率升高不顯著(P>0.05)。噴霧時間過長,SAEW可能與豬小腸污染物繼續(xù)反應(yīng),消耗有效氯成分,導(dǎo)致除菌效果減弱。因此,選擇噴霧時間為270 s。

    由圖7b可知,隨著噴霧時間的延長,肝素效價顯著降低(P<0.05)。與噴霧時間0 s相比,噴霧時間270 s時,肝素效價為(11.23±0.10)U/mL,減少0.34 U/mL。噴霧除菌過程中,噴霧時間是決定SAEW噴灑量、SAEW與豬小腸接觸時間的關(guān)鍵因素,增加噴灑量和接觸時間可加強SAEW對豬小腸的殺菌作用,但可導(dǎo)致肝素效價降低。然而,與浸泡相比,噴霧時間對肝素效價的影響較小,這可能是由于浸泡處理使SAEW與豬小腸的接觸更充分,肝素-蛋白結(jié)合物因溶于浸泡液而導(dǎo)致肝素損耗更多。

    2.3.3 噴霧壓力對豬小腸除菌效果及肝素效價的影響

    噴霧壓力影響SAEW噴灑量及與豬小腸的接觸面積,噴霧壓力越大,噴灑出的SAEW粒徑越小[37],在相同面積下,豬小腸能夠接觸更多SAEW,有效氯成分能夠更充分作用于豬小腸中的細菌,達到更好的除菌效果。由圖8a可知,隨著噴霧壓力的增大,菌落總數(shù)顯著減少(P<0.05),當噴霧壓力為110 MPa時,減菌率為(99.76±0.03)%,繼續(xù)升高噴霧壓力,減菌率升高不顯著(P>0.05)。所以,選擇噴霧壓力為110 MPa。

    由圖8b可知,噴霧壓力大于90 MPa后,肝素效價顯著減少(P<0.05),表明噴霧壓力能夠顯著影響肝素提取。噴霧壓力110 MPa時,肝素效價為(11.09±0.11)U/mL,與噴霧壓力80 MPa相比減少0.48 U/mL,與未經(jīng)除菌處理相比減少0.84 U/mL。Zheng Weichao等[38]研究發(fā)現(xiàn),噴霧壓力越大,SAEW噴霧粒徑越小,這導(dǎo)致SAEW單位面積接觸量增加。另外,有效氯損耗也與粒徑有關(guān),粒徑越小,損耗越小。所以,噴霧壓力越大,豬小腸接觸SAEW越多,肝素損失越多。

    2.4 不同除菌方式對豬小腸肝素廢水蛋白含量與組成的影響

    2.4.1 不同除菌方式對豬小腸肝素廢水蛋白含量的影響

    由圖9可知,不同除菌方式對于肝素廢水蛋白含量存在顯著影響(P<0.05)。與未經(jīng)除菌處理組對比,直接浸泡和超聲浸泡對廢水蛋白含量影響較大,蛋白質(zhì)量濃度分別降低4.09、4.13 mg/mL;噴霧對廢水蛋白含量影響相對較小,蛋白質(zhì)量濃度降低0.38 mg/mL。豬小腸肝素廢水蛋白主要是一類水溶性糖蛋白[39],與噴霧對比,浸泡能夠使豬小腸與SAEW充分接觸,使更多蛋白溶于浸泡液,導(dǎo)致肝素廢水蛋白含量顯著減少(P<0.05)。因此,噴霧方式更利于肝素廢水蛋白回收。

    2.4.2 不同除菌方式對豬小腸肝素廢水蛋白組成的影響

    由圖10可知,未經(jīng)肝素提取處理的豬小腸黏膜原始樣條帶較為豐富,背景深,呈現(xiàn)彌散狀態(tài),但經(jīng)酶解提取肝素后,條帶數(shù)量明顯減少或消失。未經(jīng)除菌處理與經(jīng)3 種除菌方式處理后的肝素廢水樣品在分子質(zhì)量70 kDa處均有清晰條帶,說明3 種除菌方式對廢水蛋白組成無明顯影響,在實際生產(chǎn)過程中可能不會對酶解廢水中特定蛋白回收產(chǎn)生影響。綜上,在最佳除菌條件下,3 種除菌方式的除菌效果相當。但是,噴霧處理對肝素效價和肝素廢水蛋白含量影響相對較小。因此,豬小腸肝素提取前除菌處理采用噴霧除菌方式。

    2.5 噴霧處理對豬小腸菌群的影響

    采用16S rDNA高通量測序技術(shù)從不同ACC噴霧處理豬小腸微生物中共獲得1 065 506 條有效序列,平均每個樣品的序列數(shù)為71 034 條,測序深度在5 000~20 000之間。對測出的2 599 個OTU進行生物信息統(tǒng)計分析,獲得不同ACC噴霧處理豬小腸菌群組成。

    α-多樣性可衡量樣品中物種的多少、豐度和均勻度,其中,Chao1指數(shù)是衡量微生物豐度的關(guān)鍵指標之一,Shannon指數(shù)表示微生物多樣性。由圖11可知,與ACC 0 mg/L相比,ACC 25、50、75、100 mg/L處理豬小腸樣品的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著降低(P<0.05),表明SAEW噴霧處理對豬小腸菌群豐富度和多樣性存在顯著影響,增加ACC可有效降低豬小腸菌群多樣性和豐富度。但ACC 75 mg/L處理豬小腸樣品的Shannon指數(shù)高于ACC 50 mg/L處理豬小腸樣品,Shannon指數(shù)對豐度低的物種權(quán)重大,這可能導(dǎo)致ACC為75 mg/L時計算出的Shannon指數(shù)偏大。

    β-多樣性分析是了解不同群落物種組成差異的重要方法,用于研究群落之間的種多度關(guān)系?;贐ray-Curtis距離的主坐標分析(principal coordinate analysis,PCoA)是β-多樣性分析的非限制性排序。由圖12可知,ACC 0 mg/L處理豬小腸與ACC 25、50、75、100 mg/L處理豬小腸菌群組成存在顯著差異(P<0.05),與ACC 100 mg/L處理豬小腸菌群組成差異最大,說明ACC 100 mg/L處理對豬小腸菌群組成影響最大。

    目前,16S rRNA測序的片段通常只有300~500 bp,大多只在科水平和屬水平得到較高可信度的注釋,本研究在門水平和屬水平展示不同ACC SAEW噴霧處理豬小腸微生物群落的物種組成豐度。由圖13可知,ACC 0 mg/L時,豬小腸菌群主要由厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)構(gòu)成,兩者為豬小腸中常見的優(yōu)勢菌門[40-41]。此外,Li Chao等[42]發(fā)現(xiàn),中國萊蕪豬和市售三元雜交豬的腸道優(yōu)勢菌門也是厚壁菌門和變形菌門。當ACC達到25 mg/L時,變形菌門相對豐度明顯下降,而厚壁菌門和疣微菌門(Verrucomicrobiota)相對豐度升高,說明ACC 25 mg/L的SAEW能夠有效殺滅變形菌門細菌,但其對厚壁菌門的殺菌效果不如變形菌門;當ACC大于25 mg/L后,厚壁菌門相對豐度隨ACC的增加而減小,疣微菌門則大幅增加。這表明,適當ACC的SAEW能夠有效殺滅豬小腸中的優(yōu)勢菌門,但對疣微菌門的殺菌效果相對較差。

    不同ACC SAEW噴霧處理豬小腸微生物屬水平變化如圖14所示,ACC 0 mg/L時,豬小腸菌群主要為乳球菌屬(Lactococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)。Crespo-Piazuelo[43]和Gryaznova[44]等的研究發(fā)現(xiàn),乳桿菌屬(Lactobacillus)和梭菌屬(Clostridium)為豬小腸優(yōu)勢菌屬。這與本研究結(jié)果存在差異。ACC 0 mg/L時,豬小腸中的嗜冷桿菌屬是肉類冷凍貯藏過程中常見的菌屬[45],可能由于樣品冷凍時間過長導(dǎo)致其相對豐度增加。ACC達到25 mg/L時,SAEW對漫游球菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬均具有較好的殺菌效果,其中不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬屬于變形菌門;而乳球菌屬和衣原體屬(Chlamydia)相對豐度明顯升高。

    當ACC達到50 mg/L后,乳球菌屬和鏈球菌屬相對豐度降低,說明此時SAEW能夠有效殺滅豬小腸部分優(yōu)勢菌屬。ACC達到100 mg/L后,衣原體菌屬相對豐度達到75%左右,表明此時SAEW對衣原體菌屬的殺滅效果較弱。

    3 結(jié) 論

    本研究首先確定了直接浸泡、超聲浸泡和噴霧3 種除菌方式的最佳除菌條件。其中,直接浸泡(ACC 75 mg/L)120 s,減菌率為(99.75±0.06)%,與未經(jīng)除菌處理相比,肝素效價和廢水蛋白質(zhì)量濃度分別減少1.98 U/mL和4.09 mg/mL;超聲浸泡(ACC 50 mg/L、超聲功率75 W)120 s,減菌率為(99.77±0.04)%,與未經(jīng)除菌處理相比,肝素效價和蛋白質(zhì)量濃度分別減少2.80 U/mL和4.13 mg/mL;噴霧(AAC 75 mg/L、噴霧壓力110 MPa)270 s,減菌率為(99.76±0.03)%,與未經(jīng)除菌處理相比,肝素效價和蛋白質(zhì)量濃度分別減少0.84 U/mL和0.38 mg/mL。噴霧除菌效果好且對肝素效價和廢液蛋白含量影響小,選作豬小腸肝素提取前的除菌方式。

    對不同ACC SAEW噴霧處理的豬小腸微生物進行16S rRNA高通量測序分析發(fā)現(xiàn),噴霧處理后豬小腸初始菌群組成改變,其中厚壁菌門(乳球菌屬、漫游球菌屬、鏈球菌屬)和變形菌門(不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬)相對豐度明顯降低,但衣原體屬相對豐度明顯增加。其中,乳球菌屬、鏈球菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬中的部分菌種具有致病性,噴霧除菌可有效減少這些細菌對肝素的感染,提高豬小腸肝素安全性。鏈球菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬在感染過程中能夠分泌蛋白酶,降解宿主組織蛋白,噴霧除菌處理能夠有效殺滅這幾種細菌,進而有效減少微生物對豬小腸肝素廢水中蛋白質(zhì)的降解。本研究可為SAEW在豬小腸除菌與肝素提取中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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    [45] 左紅, 吳周林, 張佳敏, 等. 微酸性電解水處理對兔肉冷藏期間品質(zhì)及微生物菌群的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2024, 50(10): 127-133. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036381.

    收稿日期:2024-09-26

    基金項目:黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務(wù)費項目(CZKYF2024-1-C010);馬鈴薯淀粉加工副產(chǎn)物資源化技術(shù)研發(fā)項目(SKY20210601);家畜小腸高值化加工關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化示范項目(GA21B015)

    第一作者簡介:全潤(1999—)(ORCID: 0009-0002-6568-1559),男,碩士研究生,研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail: quanrun321@126.com

    *通信作者簡介:韓建春(1973—)(ORCID: 0000-0002-3805-6793),男,教授,博士,研究方向為副產(chǎn)物綜合利用。E-mail: hanjianchun@hotmail.com

    劉丹怡(1990—)(ORCID: 0000-0001-7576-7634),女,講師,博士,研究方向為副產(chǎn)物綜合利用。E-mail: liudanyi@126.com

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