豬骨源抗氧化肽分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化作用機(jī)制

摘 要：以豬骨粉為原料制備豬骨源抗氧化肽，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化豬骨抗氧化肽酶解工藝參數(shù)，利用超濾、葡聚糖凝膠色譜分離純化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）結(jié)合PeptideRanker數(shù)據(jù)庫鑒定并篩選抗氧化活性較高的肽段，借助分子對接技術(shù)分析該肽段與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）結(jié)合方式。結(jié)果表明：酶解最優(yōu)工藝參數(shù)為酶解pH 6.8、溫度50 ℃、風(fēng)味蛋白酶添加量6 000 U/g、酶解時間4 h、底物質(zhì)量濃度4 g/100 mL；酶解后的粗肽液經(jīng)超濾和Sephadex G-25逐級分離得到3 個組分（F-1、F-2、F-3），其中F-2組分抗氧化活性最高，2，2’-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）陽離子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率分別達(dá)（94.57±1.08）%和（79.08±0.61）%；經(jīng)LC-MS/MS鑒定，F(xiàn)-2組分含有232 個肽段，經(jīng)PeptideRanker預(yù)測得到的3 條肽段分別為GPVGAAGP、APGPVGP、QPGPAGPG，其疏水性氨基酸占比在80%以上，說明可能具有較高的抗氧化活性；3 條肽段以氫鍵和疏水相互作用與Keap1結(jié)合，釋放核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）進(jìn)入細(xì)胞核，激活Keap1-Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件通路，從而發(fā)揮抗氧化作用。因此，GPVGAAGP、APGPVGP、QPGPAGPG可作為新型抗氧化劑，本研究旨在為豬骨源抗氧化肽的開發(fā)利用提供理論參考。

關(guān)鍵詞：豬骨；酶解；抗氧化肽；分子對接

Isolation， Purification， Structural Identification and Action Mechanism of

Antioxidant Peptides Derived from Porcine Bones

CHEN Lulu1， LEI Yang1， HAO Yangxue2， Lü Yangyong1， WEI Shan1， ZHAO Fengguang1， HU Yuansen1，3，*

（1. School of Biological Engineering， Henan University of Technology， Zhengzhou 450001， China;

2. Henan Yuxin Sugar Alcohol Co. Ltd.， Anyang 456171， China; 3. Food Laboratory of Zhongyuan， Luohe 462300， China）

Abstract： The enzymatic preparation of antioxidant peptides from porcine bone meal was optimized by the combined use of single factor experiments and response surface methodology. The antioxidant peptides were separated and purified by successive ultrafiltration and Sephadex G-25 column chromatography， and the peptides with high antioxidant activity were selected and identified using liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） combined with PeptideRanker. The binding of the peptides to the protein Kelch-like ECH-associated protein 1 （Keap1） was analyzed by molecular docking technology. The results showed that the optimal process parameters were as follows： pH 6.8， 50 ℃，"6 000 U/g flavourzyme， 4 h hydrolysis， and 4 g/100 mL substrate concentration." Among three fractions （F-1， F-2， and F-3） obtained from successive ultrafiltration and Sephadex G-25 column chromatography， F-2 had the highest antioxidant activity， which scavenged （94.57 ± 1.08）% of 2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoliline-6-sulfonic acid） （ABTS） cationic radical and"（79.08 ± 0.61）% of 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical. LC-MS/MS identified 232 peptides from F-2， and three peptides， GPVGAAGP， APGPVGP and QPGPAGPG， were predicted by PeptideRanker， hydrophobic amino acids accounting for more than 80% of their total amino acids， indicating that they may have high antioxidant activity. The three peptides bound to Keap1 protein by hydrogen bonding and hydrophobic interaction， causing the release of nuclear factor erythroid 2 related factor 2 （Nrf2） into the nucleus and the activation of the Keap1-Nrf2/antioxidant response element pathway to exert antioxidant effects. Therefore， GPVGAAGP， APGPVGP and QPGPAGPG can be used as new antioxidants， and the findings from this research provide a theoretical basis for the development and utilization of porcine bone-derived antioxidant peptides.

Keywords： porcine bones; enzymatic hydrolysis; antioxidant peptides; molecular docking

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240809-203

中圖分類號：TS251.94" " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2025）03-0008-10

引文格式：

陳露露， 雷陽， 郝陽雪， 等. 豬骨源抗氧化肽分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化作用機(jī)制[J]. 肉類研究， 2025， 39（3）： 8-17. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240809-203." " http：//www.rlyj.net.cn

CHEN Lulu， LEI Yang， HAO Yangxue， et al. Isolation， purification， structural identification and action mechanism of antioxidant peptides derived from porcine bones[J]. Meat Research， 2025， 39（3）： 8-17. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240809-203." " http：//www.rlyj.net.cn

豬肉在我國肉食消費(fèi)結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位，據(jù)國家統(tǒng)計局官網(wǎng)報道，2023年我國豬肉產(chǎn)量達(dá)到5 794萬 t，伴隨豬骨產(chǎn)量也高達(dá)600多萬 t。但目前畜禽骨資源的整體利用率低于總產(chǎn)量的10%，大部分豬骨未能得到有效利用而被遺棄，不僅導(dǎo)致資源浪費(fèi)[1]，更因富含營養(yǎng)物質(zhì)的豬骨易于腐敗，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染問題[2]。豬骨富含多種氨基酸，主要包括Gly、Pro、Ala與Asp等主要氨基酸[3]。此外，豬骨經(jīng)加工后具有一定的抗氧化活性[4-5]，可以延緩皮膚老化、預(yù)防動脈粥樣硬化等，能夠顯著提高其附加值。

研究表明，機(jī)體衰老與其產(chǎn)生的活性氧密切相關(guān)?？寡趸瘎┛汕宄w內(nèi)過量的自由基，在減輕機(jī)體氧化損傷方面起著重要作用[6]。近年來，食源性生物活性肽憑借其結(jié)構(gòu)簡單、安全、易吸收及無免疫反應(yīng)等特點(diǎn)，在抗氧化劑的開發(fā)應(yīng)用中備受青睞。因此，從自然資源中篩選抗氧化肽成為研究熱點(diǎn)[7]。Bashir等[8]從日本鯖魚肌肉蛋白中制備的抗氧化肽具有較好的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性，可作為抗氧化劑來源。白玉等[9]通過復(fù)合酶解法從牛骨中制備抗氧化肽，并對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。Liu Qian等[10]

采用堿性蛋白酶水解豬血漿蛋白，結(jié)果顯示，酶解后的豬血漿蛋白抗氧化能力明顯提高。

分子對接技術(shù)可通過模擬小分子多肽與受體蛋白間的結(jié)合模式和結(jié)合自由能篩選最佳配體[11]。李紅梅等[12]采用分子對接技術(shù)研究抗氧化三肽SHW與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）的相互作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)SHW通過與Keap1蛋白活性口袋形成氫鍵和疏水相互作用影響Keap1-核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）信號通路。Igbokwe等[13]利用分子對接技術(shù)從薏仁中篩選具有抗氧化活性的多肽，發(fā)現(xiàn)8 個肽段與Keap1-Nrf2具有良好的結(jié)合作用，其中FFDR肽段具有增強(qiáng)Keap1-Nrf2信號通路抗氧化基因表達(dá)能力。因此，通過分子對接技術(shù)深入研究抗氧化肽與Keap1的結(jié)合能力，有望從分子水平闡明多肽抗氧化活性的潛在作用機(jī)制。

本研究以豬骨粉為原料進(jìn)行酶法制備抗氧化肽，以2，2’-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）陽離子自由基與DPPH自由基清除率及總還原能力為篩選指標(biāo)，采用超濾和凝膠色譜技術(shù)分離純化，篩選抗氧化能力較強(qiáng)的組分，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒定多肽的氨基酸序列，并采用分子對接技術(shù)檢測其與Keap1的結(jié)合能力，分析抗氧化作用機(jī)制，為進(jìn)一步解決豬骨資源浪費(fèi)及豬骨抗氧化肽的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬骨粉 西安本豐生物科技有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（150 U/mg）、木瓜蛋白酶（＞200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、胰蛋白酶（130 U/mg） 上海麥克林生化科技有限公司；ABTS、DPPH 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-CA水浴恒溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司；SN-MS-6D多聯(lián)磁力攪拌器 上海尚普儀器設(shè)備有限公司；G1-21M低溫高速離心機(jī) 上海安亭電子儀器有限公司；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Easy-nLC1200 LC儀、電噴霧-組合型離子阱Orbitrap MS儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 豬骨抗氧化肽制備

參照張周莉[14]的方法并稍作修改。豬骨粉∶水＝1∶1（m/m），調(diào)節(jié)至各蛋白酶最適pH值和溫度，加入蛋白酶（5 000 U/g）進(jìn)行酶解，酶解完成后調(diào)節(jié)pH值至7，100 ℃滅酶10 min，冷卻，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥，即得豬骨抗氧化肽粗肽粉。

1.3.2 蛋白酶篩選

分別在木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶最適溫度及pH值（表1）條件下進(jìn)行酶解，固定底物質(zhì)量濃度4 g/100 mL、酶解時間4 h、酶添加量5 000 U/g，以水解度（degree of hydrolysis，DH）、ABTS陽離子自由基清除率及多肽得率為指標(biāo)篩選酶解效果最佳的蛋白酶。

1.3.3 DH測定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》測定總氮含量。氨基酸態(tài)氮含量測定參考Rao等[15]的方法并稍作修改。取5 mL豬骨酶解液與25 mL蒸餾水混勻，調(diào)節(jié)pH值至8.2，加入10 mL 37%（m/m）中性甲醛，采用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)pH值至9.2，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（V1）。同時以蒸餾水為空白對照，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（V2）。按照

式（1）計算氨基酸態(tài)氮含量，然后按照式（2）計算DH：

式中：ρ為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度/（mol/L）；5為酶解液體積/mL。

1.3.4 DPPH自由基清除率測定

參照尹國友等[16]的方法，用95%（V/V）乙醇溶液配制0.20 mmol/L DPPH溶液，將100 μL DPPH溶液和100 μL樣品溶液（1 mg/mL）混勻后，在室溫條件下避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度（A1）；對照組采用100 μL

95%（V/V）乙醇溶液代替DPPH溶液，測定吸光度（A2）；

空白組采用100 μL蒸餾水代替樣品溶液，測定吸光度（A0）。按照式（3）計算DPPH自由基清除率：

1.3.5 ABTS陽離子自由基清除率測定

參考Carrillo等[17]的方法并稍作修改。將7 mmol/L

ABTS試劑與等體積的2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合為ABTS母液，4 ℃避光條件下反應(yīng)24 h，備用。使用前采用去離子水稀釋ABTS母液至734 nm處吸光度達(dá)0.70±0.02，即得ABTS工作液。將20 μL樣品溶液和180 μL ABTS母液混勻，室溫下避光反應(yīng)5 min后在734 nm處測定吸光度（A1），等體積蒸餾水代替樣品溶液為空白組，測定吸光度（A0）。按照式（4）計算ABTS陽離子自由基清除率：

1.3.6 總還原能力測定

參考Xiao Fan等[18]的方法并加以修改。將1 mL樣品溶液（1 mg/mL）與等體積0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和10 mg/mL鐵氰化鉀溶液混勻，50 ℃水浴20 min，加入1 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，8 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入1 mL去離子水和0.5 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵溶液，在700 nm處測定吸光度，吸光度越大表明其總還原能力越強(qiáng)。

1.3.7 多肽得率測定

參考沈曉勇等[19]的方法，取1 mL酶解液與等體積15 g/100 mL三氯乙酸溶液混勻，靜置10 min后8 000 r/min離心5 min，采用雙縮脲法測定上清液中的蛋白含量。按照式（5）計算多肽得率：

1.3.8 單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)報道，考察酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解pH（6.00、6.50、7.00、7.50、8.00）、加酶量（2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g）、

酶解時間（2、3、4、5、6 h）對酶解液ABTS陽離子自由基清除率、DH的影響。

1.3.9 響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以ABTS陽離子自由基清除率為指標(biāo)，利用Design-Expert v8.0.6.1軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到制備抗氧化肽的最佳酶解條件，試驗(yàn)因素水平見表2。

1.3.10 超濾分離

采用分子質(zhì)量為10 kDa和3 kDa的超濾管對豬骨酶解液進(jìn)行超濾，得到分子質(zhì)量范圍為＞10 kDa、3～10 kDa、＜3 kDa 3 個組分，將收集到的各組分粗肽液進(jìn)行冷凍干燥備用。

1.3.11 凝膠色譜分離

參考Feng Yanxia等[20]的方法稍作修改。采用Sephadex G-25柱進(jìn)行凝膠層析。將超濾后抗氧化活性最強(qiáng)的組分溶解于超純水，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，加入2 mL樣品后用去離子水洗脫，每5 min收集1 次，在280 nm處測定吸光度，室溫下采用自動收集器收集濾液，并根據(jù)色譜峰混合后冷凍干燥。

1.3.12 LC-MS/MS鑒定

委托北京百泰派克生物科技有限公司對上述所得抗氧化活性最好的組分進(jìn)行肽段鑒定。質(zhì)譜測試原始文件采用PEAKS Studio 10.6軟件進(jìn)行分析，得到肽段序列結(jié)果。

LC條件：洗脫流速600 nL/min；洗脫緩沖液由A相（0.1%（V/V）甲醇溶液）和B相（0.2%（V/V）甲醇乙腈溶液）組成；洗脫條件：0～2 min，8% B；2～45 min，8%～28% B；45～55 min，28%～40% B；55～56 min，40%～95% B；56～66 min，95% B。

MS條件：一級質(zhì)譜條件：分辨率70 000，最大注射時間100 ms，自動增益控制目標(biāo)3×106；二級質(zhì)譜條件：分辨率17 500，最大注射時間50 ms，自動增益控制目標(biāo)1×105。

1.3.13 抗氧化肽篩選

利用PeptideRanker對LC-MS/MS鑒定的肽段進(jìn)行生物活性評分，評分越高，表明肽段的抗氧化活性越強(qiáng)。使用PepDraw工具預(yù)測肽段的凈電荷和疏水性，Innovagen工具預(yù)測肽段的相對分子質(zhì)量，AnOxPePred 1.0工具（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/AnOxPePred-1.0/）預(yù)測活性肽的抗氧化活性[21]。

1.3.14 分子對接

通過檢索PDB（Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲取Keap1（PDB ID：4L7B）的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，使用PyMOL 2.3.0去除蛋白結(jié)晶水、氫原子及原有受體所攜帶的配體，利用Chem Draw 7.0構(gòu)建多肽3D結(jié)構(gòu)并進(jìn)行能量最小化，將小分子導(dǎo)入到AutoDock工具進(jìn)行加全氫、計算電荷等前處理，采用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行對接，然后通過Discovery Studio 2019和LigPlot v2.2.8將對接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，通過SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P＜0.05表示差異顯著，采用Design-Expert v8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，并采用Origin 2019b軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳蛋白酶篩選結(jié)果

酶可以將蛋白質(zhì)水解成小分子物質(zhì)，DH是衡量酶解效果的重要指標(biāo)之一[22]。不同蛋白酶作用于同一底物時，因酶切位點(diǎn)差異可導(dǎo)致酶解后多肽結(jié)構(gòu)各有特點(diǎn)，因此不同蛋白酶酶解所得多肽的抗氧化活性存在差異[23]。

由圖1可知，5 種蛋白酶作用于底物時，DH均隨酶解時間延長而增大，酶解結(jié)束時，各組DH存在較大差異，風(fēng)味蛋白酶組DH最高，達(dá)到（32.93±0.26）%。同樣，風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的多肽得率和ABTS陽離子自由基清除率顯著高于其他組（P＜0.05），分別為（51.39±0.72）%和（80.04±0.39）%，其次為堿性蛋白酶和中性蛋白酶，胰蛋白酶酶解效果最差。Wang Jiao等[24]利用風(fēng)味蛋白酶對金槍魚蛋白進(jìn)行酶解，其DPPH自由基清除率顯著高于其他組，與本研究結(jié)果較為一致。因此，選擇風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行后續(xù)研究。

字母不同表示組間差異顯著（P＜0.05）。圖2同。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

如圖2所示，隨著酶解溫度的升高，DH和ABTS陽離子自由基清除率呈先增高后下降的變化趨勢，這是由于溫度對蛋白酶活性產(chǎn)生影響[25]。酶解溫度為50 ℃時，ABTS陽離子自由基清除率達(dá)到最大值81.33%。因此選擇酶解溫度為50 ℃。

隨著pH值的增加，DH和ABTS陽離子自由基清除率也呈先升后降的趨勢，當(dāng)pH 6.5時，DH和ABTS陽離子自由基清除率分別達(dá)到最大值，這可能是由于風(fēng)味蛋白酶在弱酸環(huán)境下活性更高，而pH值升高會導(dǎo)致蛋白變性，進(jìn)而降低酶解效率[26]。因此選擇pH值為6.5。

酶解時間為4 h時，ABTS陽離子自由基清除率達(dá)到最大值。隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，底物中可切割結(jié)合位點(diǎn)減少，延長酶解時間并不能顯著提高DH及ABTS陽離子自由基清除率[27]。因此選擇酶解時間為4 h。

隨著加酶量的增大，ABTS陽離子自由基清除率呈先升后降趨勢，當(dāng)加酶量達(dá)到6 000 U/g后，DH增幅變緩，可能是因?yàn)榻Y(jié)合位點(diǎn)趨于飽和，繼續(xù)增加酶量并不能大幅提高DH[28]。因此選擇加酶量為6 000 U/g。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶解pH值（C）及加酶量（D）4 個因素作為自變量，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計原則建立4因素3水平試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表3。

運(yùn)用Design Expert v8.0.6軟件，通過擬合進(jìn)行二次多元回歸分析，得到回歸方程為：Y＝87.35－0.34A－0.47B＋1.10C＋0.71D＋0.65AB＋1.08AC－0.39AD－0.74BC＋0.28BD＋0.99CD－2.19A2－2.08B2－2.77C2－0.81D2。響應(yīng)面分析結(jié)果如表4所示，二次多元回歸方程失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.283 2＞0.05），回歸模型顯著（P＜0.000 1），說明模型與實(shí)際結(jié)果擬合程度較好。回歸相關(guān)系數(shù)R2＝0.893 4，表明模型擬合度較好。各因素對ABTS陽離子自由基清除率的影響順序?yàn)椋好附鈖H值＞加酶量＞酶解溫度＞酶解時間。

等高線趨于橢圓表示兩因素交互作用顯著，等高線趨于圓形則表示交互作用不顯著[29]，響應(yīng)曲面陡峭程度反映酶解條件對ABTS陽離子自由基清除率的影響。由圖3可知，酶解時間和酶解pH值的響應(yīng)面陡峭程度最大，表明其交互作用最顯著。求解回歸方程可得最佳酶解工藝條件為：酶解溫度49.86 ℃、酶解時間3.92 h 、pH 6.82、加酶量6 000.65 U/g，此時ABTS陽離子自由基清除率預(yù)測值為87.79%。根據(jù)實(shí)際操作將酶解工藝條件調(diào)整為：酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h、pH 6.80、加酶量6 000 U/g，此條件下，ABTS陽離子自由基清除率為（88.03±0.62）%，與預(yù)測值較為接近。

2.4 不同超濾組分抗氧化活性分析

酶解液經(jīng)超濾分離得到3 個組分，分別為分子質(zhì)量＞10 kDa、3～10 kDa及＜3 kDa。如表5所示，分子質(zhì)量＜3 kDa組分抗氧化活性最強(qiáng)，其ABTS陽離子自由基清除率、DPPH自由基清除率和總還原能力分別為（92.83±0.53）%、（74.10±0.81）%和0.09±0.03。

分子質(zhì)量較小的多肽抗氧化活性更高可能是由于小分子肽因體積小更易被人體吸收，或更易與自由基發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)自由基轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的物質(zhì)[30]。Phongthai等[31]將米糠蛋白水解物分別通過3、5、10 kDa超濾膜，也發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量＜3 kDa組分具有最好的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除活性；Wali等[32]從蝎蛋白中提取抗氧化肽，也發(fā)現(xiàn)超濾所得中分子質(zhì)量＜3 kDa組分具有較高的抗氧化活性；蔡金秀等[33]采用超濾法分離馬面魚皮膠原蛋白抗氧化肽，得到的3 個組分抗氧化活性由大到小分別為＜5 kDa、5～10 kDa、＞10 kDa組分，以上結(jié)果均與本研究結(jié)果相一致。因此，選擇＜3 kDa豬骨酶解物組分進(jìn)行下一步的葡聚糖凝膠分離純化。

2.5 葡聚糖凝膠分離純化與抗氧化活性分析

凝膠色譜根據(jù)被分離物質(zhì)的分子質(zhì)量實(shí)現(xiàn)分離純化，小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠微孔中，而大分子物質(zhì)直接通過填料的間隙而被洗脫下來[34]。將分子質(zhì)量＜3 kDa豬骨抗氧化粗肽進(jìn)行葡聚糖凝膠分離，其在Sephadex G-25柱上的洗脫曲線如圖4所示。經(jīng)凝膠分離后，收集到3 個組分，分別記為F-1、F-2、F-3，峰尖分別在46、88、120 min出現(xiàn)，其中F-1組分出峰時間早，其分子質(zhì)量最大，而F-3組分出峰時間最晚，分子質(zhì)量最小。

如表6所示，F(xiàn)-2組分抗氧化活性最高，其ABTS陽離子自由基清除率為（94.57±1.08）%、DPPH自由基清除率為（79.08±0.61）%、總還原能力為1.24±0.06；其次是F-3組分。由此可見，多肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量有關(guān)，但分子質(zhì)量越小的多肽其抗氧化活性不一定越強(qiáng)，這與Wu Huichun等[35]的研究結(jié)果一致，鯖魚蛋白酶解液中分子質(zhì)量1 400 Da多肽的抗氧化活性高于分子質(zhì)量900 Da和200 Da多肽。Xing Lujuan等[36]通過葡聚糖凝膠色譜分離宣威火腿多肽得到的4 個組分中，第3個組分的羥自由基清除率為35.06%，顯著高于其他組分。在葡聚糖凝膠柱中保留時間最長的組分其抗氧化活性較弱可能是由于洗脫液中存在大量游離氨基酸和無抗氧化活性的小肽[37]，這也可能是F-3組分抗氧化活性較差的原因。綜上，選擇F-2組分對其進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)鑒定與活性預(yù)測。

2.6 抗氧化肽結(jié)構(gòu)鑒定與活性預(yù)測分析

采用LC-MS/MS從F-2組分中共鑒定出232 條多肽序列，肽段分子質(zhì)量在565～2 234 Da之間。根據(jù)PeptideRanker肽段評分結(jié)果篩選得到3 條肽段，分別為Gly-Pro-Val-Gly-Arg-Arg-Gly-Pro、Gly-Arg-Pro-Gly-Pro-Val-Gly-Pro、Gln-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro。多肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量、氨基酸組成及疏水性密切

相關(guān)[38]。如表7所示，3 條多肽分子質(zhì)量均較低，由7～8 個氨基酸組成，與Ma等[39]研究結(jié)果相一致。

多肽的生物活性與其所含特定氨基酸的比例和氨基酸位置有關(guān)[40]。例如，疏水性氨基酸比例較高的多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，因?yàn)槭杷园被嵊欣谔岣唠亩卧谥|(zhì)體系中的溶解度，并且能夠加強(qiáng)肽段與脂溶性自由基相互作用[41]。Mendis等[42]從巨型魷魚皮明膠中分離抗氧化肽時也發(fā)現(xiàn)，疏水性氨基酸含量高的多肽抗氧化活性更好。同樣地，Agrawal等[43]發(fā)現(xiàn)珍珠粟蛋白抗氧化肽的高抗氧化活性與其多肽序列中的疏水性氨基酸Gly、Leu和Pro有關(guān)。Ranathunga等[44]發(fā)現(xiàn)，星康吉鰻（Conger myriaster）蛋白水解物中純化的抗氧化肽由Leu、Gly和Val等疏水性氨基酸殘基組成，約占序列的55%，表明疏水性氨基酸占比對其抗氧化作用影響較大。綜上，疏水性氨基酸比例影響多肽抗氧化活性，GPVGAAGP、GAPGPVGP和QPGPAGP 3 條多肽的疏水性氨基酸占比均在80%以上，推測肽段中的Gly、Pro、Val、Arg可能通過促進(jìn)其與脂質(zhì)分子相互作用清除自由基，表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。

2.7 分子對接相互作用分析

為進(jìn)一步從分子水平探究多肽的抗氧化作用機(jī)制，將GPVGAAGP、GAPGPVGP和QPGPAGP分別與Keap1蛋白進(jìn)行分子對接模擬[45]。研究[46]表明，抗氧化肽可以直接作用于Keap1-Nrf2結(jié)合位點(diǎn)，與Keap1蛋白結(jié)合并釋放Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而啟動抗氧化基因表達(dá)。結(jié)合能小于0說明小分子可以自由結(jié)合靶蛋白，并且結(jié)合能越小，越可能與靶蛋白結(jié)合[47]。由表8可知，GPVGAAGP、GAPGPVGP、QPGPAGP對Keap1蛋白的結(jié)合能分別為－2.76、－5.36、－1.96 kJ/mol，表明3 條多肽能夠自發(fā)地與Keap1蛋白結(jié)合。

3 條抗氧化肽與Keap1蛋白結(jié)合方式和結(jié)合殘基如圖5

所示。GPVGAAGP與Val467、Thr560、Val561殘基形成3 個氫鍵，長度分別為2.85、3.04、2.88 ?，與Arg326、Glu611、His612、Leu610等10 個殘基產(chǎn)生疏水相互作用；GAPGPVGP與His612、Glu611、Arg470殘基形成3 個氫鍵，長度分別為3.24、3.03、2.99 ?，存在5 種疏水相互作用；QPGPAGP與Arg470、Glu493殘基形成2 個氫鍵，長度分別為2.78、2.92 ?，存在4 種疏水相互作用，氫鍵和疏水相互作用對復(fù)合物形成至關(guān)重要[48]。QPGPAGP和GAPGPVGP與Keap1蛋白在Arg470形成共同的氫鍵結(jié)合位點(diǎn)。分子對接結(jié)果表明，3 條抗氧化肽均可能與Keap1蛋白結(jié)合釋放Nrf2，從而發(fā)揮抗氧化活性。

3 結(jié) 論

本研究以ABTS陽離子自由基清除率、DH等為指標(biāo)確定制備豬骨抗氧化肽的最佳工藝條件，在此工藝條件下，豬骨抗氧化肽ABTS陽離子自由基清除率為88.03%。通過超濾和凝膠色譜分離得到3 個組分（F-1、F-2、F-3），其中F-2組分具有較強(qiáng)的抗氧化活性，ABTS陽離子自由基清除率為94.57%，采用LC-MS/MS從F-2組分中鑒定得到232 條肽段。通過PeptideRanker篩選得到GPVGAAGP、GAPGPVGP和QPGPAGP肽段，其分子質(zhì)量分別為624.32、650.34、622.31 Da，疏水性氨基酸占比均在80%以上。分子對接結(jié)果表明，3 條多肽與Keap1蛋白通過氫鍵和疏水相互作用產(chǎn)生較好結(jié)合能力，說明其具備較強(qiáng)的抗氧化活性。由于分子對接是一種虛擬篩選方法，后續(xù)可以通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證多肽的抗氧化活性，深入研究其抗氧化作用機(jī)制。

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收稿日期：2024-08-09

基金項(xiàng)目：河南省自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（242300421556）；河南工業(yè)大學(xué)高層次人才科研啟動基金項(xiàng)目（2024BS003）；橫向技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目（062H2023SW062）

第一作者簡介：陳露露（1999—）（ORCID： 0009-0000-7977-2449），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾笄莞碑a(chǎn)物加工及高值化利用。E-mail： luuu0217@163.com

*通信作者簡介：胡元森（1976—）（ORCID： 0000-0002-5611-8783），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称访搁_發(fā)與應(yīng)用。E-mail： hys308@126.com