植物非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系及其應(yīng)用

關(guān)鍵詞植物遺傳轉(zhuǎn)化；非組培；農(nóng)桿菌；基因編輯；基因型不依賴

高效穩(wěn)定的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系是解析基因功能、定向改良植物性狀的重要工具和關(guān)鍵手段［1-2］。常規(guī)雜交育種存在生殖隔離、育種周期長(zhǎng)等障礙，而利用基于植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因編輯技術(shù)，可以定向操作基因，改良性狀，有效規(guī)避上述問(wèn)題，加速育種進(jìn)程［3-4］?，F(xiàn)有的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法［4］、花器官侵染法［4］、病毒載體傳遞法［5-8］、粒子轟擊法［1］、花粉管通道法［1］、納米傳遞法等［9］。其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化由于效率高、拷貝數(shù)低、可靠性高，應(yīng)用最廣泛［4］。用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌主要有根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌2種類型，分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，將T-DNA插入到植物基因組，2類農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的器官類型不同，其中發(fā)根農(nóng)桿菌主要誘導(dǎo)再生陽(yáng)性根，而根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)再生陽(yáng)性芽［10］。由于植物細(xì)胞具有多能性和全能性，多種細(xì)胞具備發(fā)育成各種器官和完整植株的潛能［11］。傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料多為離體植物組織，包括無(wú)菌種子、幼胚、葉片、上胚軸、下胚軸、愈傷組織等［1］。然而該方法受多種因素限制，首先需要建立高效穩(wěn)定的離體再生體系，其次該方法對(duì)植物基因型也有一定的偏好性，且轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程昂貴、復(fù)雜、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化效率低。目前在37萬(wàn)個(gè)植物物種中，僅0.1%建立了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，大量植物仍未建立組培條件下根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系［12］。擬南芥利用浸花法進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化，有效避免了繁瑣的組培過(guò)程，為非組培遺傳轉(zhuǎn)化提供了重要參考［13］。早期發(fā)現(xiàn)在非組培條件下利用發(fā)根農(nóng)桿菌懸浮液注射菜豆葉結(jié)節(jié)處，可以形成大量的毛狀根，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)70%～90%，該方法為發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化提供了重要參考［14］。近年隨著基因編輯技術(shù)快速發(fā)展，利用遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯技術(shù)創(chuàng)制優(yōu)良新種質(zhì)取得了顯著成效［15］。雖然植物細(xì)胞具有多能性和全能性，但并非所有細(xì)胞都能再生，生殖器官或分生組織由于細(xì)胞分化程度低而具有較強(qiáng)再生能力［16-17］。非組培條件下生長(zhǎng)的植物，其腋芽分生組織、莖分生組織都具有強(qiáng)再生能力，可作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。近年非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法不斷被建立和優(yōu)化［4］。本文總結(jié)了近年來(lái)建立的非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系及其在植物基因編輯中的應(yīng)用，并展望非組培遺傳轉(zhuǎn)化的發(fā)展趨勢(shì)，旨在為更多物種建立高效、簡(jiǎn)便、基因型不依賴的非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系提供參考。

1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的非組培遺傳轉(zhuǎn)化主要借助植物有性和無(wú)性繁殖方式，利用植物自身再生能力，獲得轉(zhuǎn)基因再生器官或再生植株，其遺傳轉(zhuǎn)化效率高，在植物中應(yīng)用廣泛［4］。目前常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的非組培遺傳轉(zhuǎn)化主要包括：花器官侵染法、切-浸-芽（cutdip-budding，CDB）遞送法、依賴再生活力的活體注射遞送法（regenerativeactivity-dependentinplantain?jectiondelivery，RAPID）、種子侵染法、發(fā)育調(diào)控基因（developmentregulatory，DR）輔助轉(zhuǎn)化法和病毒遞送法。

1.1 花器官侵染法

花器官侵染法最早在擬南芥中建立，其做法是將開(kāi)花早期的擬南芥花序浸泡在農(nóng)桿菌菌液中，并進(jìn)行真空滲透處理，農(nóng)桿菌進(jìn)入子房將攜帶目的基因的T-DNA插入卵細(xì)胞基因組，借助有性生殖方式直接獲得轉(zhuǎn)基因種子（圖1A）。該方法無(wú)需組織培養(yǎng)和再生步驟，操作簡(jiǎn)單，周期短［13］。在擬南芥中利用該方法創(chuàng)制了大量（gt;2萬(wàn)）T-DNA插入系，構(gòu)建了多個(gè)突變體庫(kù)，突變位點(diǎn)幾乎覆蓋擬南芥基因組中的全部基因，為正向遺傳學(xué)研究和基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證提供了可靠材料［18-19］。我國(guó)研究人員利用噴霧法代替花序浸泡，成功創(chuàng)制了2萬(wàn)個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系，構(gòu)建了攜帶激活標(biāo)簽的功能獲得型擬南芥突變體庫(kù)［20］。噴霧法代替浸花法，為大規(guī)模轉(zhuǎn)化提供了便利，且轉(zhuǎn)化效率相當(dāng)［21］?；ㄐ蚯秩痉ǔ龖?yīng)用于十字花科植物北方小油菜［22］、甘藍(lán)型油菜［23-24］、蘿卜［25］、芥菜［26］、白菜［27］和鹽芥［28］外，也被應(yīng)用于重要的農(nóng)作物小麥［29-30］和大豆［31］，以及經(jīng)濟(jì)作物苜蓿［32］等。盡管浸花法遺傳轉(zhuǎn)化體系已在多個(gè)物種中被建立，但由于其轉(zhuǎn)化效率較低，普遍在0.01%～4%之間［18-32］（表1），且受植物發(fā)育時(shí)期影響較大，多數(shù)植物以初花期最佳，轉(zhuǎn)基因后代需自交篩選獲得純合體，耗時(shí)較長(zhǎng)，因此該方法適用于生長(zhǎng)周期短且自交親和植物?；ㄆ鞴偾秩痉ǔㄐ蛲?，花藥、花粉、花梗和柱頭也被用作農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的外植體。報(bào)春花以花梗作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，由于活體再生能力差，仍需通過(guò)組織培養(yǎng)途徑獲得轉(zhuǎn)基因再生植株［33］。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花器官浸染法目前仍是擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最廣泛的方法，該方法為非組培遺傳轉(zhuǎn)化提供了重要借鑒，為后期非組培遺傳轉(zhuǎn)化的快速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

1.2 切-浸-芽遞送法

花器官侵染法在外植體選擇上具有一定的局限性，研究人員開(kāi)發(fā)了以植物營(yíng)養(yǎng)器官為外植體的普適性更廣的遺傳轉(zhuǎn)化方法，稱為切-浸-芽（CDB）遞送法［12］，該方法主要是借助于植物無(wú)性繁殖方式進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。CDB遞送法最早在橡膠草中建立，該方法主要包括4步：切取根段-蘸菌-誘導(dǎo)生根-根誘導(dǎo)生芽，最終獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株（圖1B）［12］。橡膠草的根具有芽原基，當(dāng)根系與母體分離后，芽原基分化形成不定芽伸出地面形成完整植株。利用根進(jìn)行無(wú)性繁殖的草本植物繡球小冠花、塊根植物甘薯和木本植物臭椿、遼東楤木和臭茉莉等均能通過(guò)CDB法獲得轉(zhuǎn)基因植株［12］。CDB轉(zhuǎn)化效率雖在不同物種中存在較大差異，但在多個(gè)物種中均表現(xiàn)出極高的轉(zhuǎn)化效率，再生陽(yáng)性根的效率普遍在10%～90%之間，再生陽(yáng)性芽的效率在2%～80%（表1），相較于浸花法提高10倍左右，為高通量遺傳轉(zhuǎn)化提供了有利的技術(shù)保障［12］。CDB方式包括4個(gè)步驟，周期約為14周，耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，為了進(jìn)一步縮短轉(zhuǎn)化周期，研究者開(kāi)發(fā)了更加簡(jiǎn)便的3步侵染法，稱為極簡(jiǎn)切-浸-芽系統(tǒng)（extremelysimplifiedcut-dip-budding，ES-CDB）（圖1C），該方法直接以橡膠草的根作為外植體，蘸取固體培養(yǎng)基中的發(fā)根農(nóng)桿菌，放在濕潤(rùn)的蛭石上直接誘導(dǎo)不定芽，省略了誘導(dǎo)毛狀根的步驟，將遺傳轉(zhuǎn)化周期縮短至2周左右，ES-CDS相較于傳統(tǒng)CDB，更加簡(jiǎn)便且快速［34］。CDB在多個(gè)具有無(wú)性繁殖能力的物種中也得到了應(yīng)用，包括藥用植株荊芥、地黃、丹參和蒙古蒲公英［35］，以及多肉植物雙子葉長(zhǎng)壽花、玉樹(shù)和單子葉虎尾蘭［36］。自然界中有許多植物可利用根進(jìn)行無(wú)性繁殖，特別是具有根蘗繁殖能力的植物，例如菊科植物和木本植物尤為普遍，包括紫莖澤蘭、萬(wàn)壽菊、楊樹(shù)、棗樹(shù)等，盡管這些植物都已建立了遺傳轉(zhuǎn)化體系，但均需要經(jīng)歷組織培養(yǎng)過(guò)程，且部分物種存在轉(zhuǎn)化效率低的問(wèn)題［37-41］，因此有必要建立CBD遞送法，簡(jiǎn)化操作、提高效率、縮短周期。

發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CDB遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，在無(wú)性繁殖能力弱或不具有根蘗繁殖能力的植物中得到了廣泛的應(yīng)用，如木本果樹(shù)柑橘［42-44］、桃［45］、杜梨［46］、茶樹(shù)［47］以及十字花科的大白菜［48］等，這些植物通過(guò)CDB遞送法獲得了陽(yáng)性根，但由于其根系難再生芽，無(wú)法獲得完整的轉(zhuǎn)基因再生植株，嚴(yán)重阻礙了其在分子育種中的應(yīng)用。但對(duì)于根系生物學(xué)特性的研究，由于其不必獲得完整的再生轉(zhuǎn)基因植株，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性根，可應(yīng)用于研究根系的抗寒、抗旱等抗逆相關(guān)性狀［44］。在麻風(fēng)樹(shù)和柑橘中也利用類似于CDB的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)去除地上部頂端分生組織，在傷口處蘸取菌液，誘導(dǎo)分生組織再生陽(yáng)性芽，待陽(yáng)性芽長(zhǎng)大后觀察地上部表型，該方法也被稱為植物原位轉(zhuǎn)化法（圖1D）；可有效規(guī)避根再生芽的過(guò)程，比較適用于無(wú)根蘗繁殖能力且僅需觀察地上部性狀的木本果樹(shù)等［49-51］。CDB相比于浸花法，可以選擇根段、莖和葉片等多種營(yíng)養(yǎng)器官作為外植體，不經(jīng)歷有性生殖過(guò)程，后代無(wú)需多代自交，具有應(yīng)用范圍廣、周期短、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)；特別是針對(duì)難轉(zhuǎn)化的多年生木本植株具有極大的應(yīng)用潛力，且利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，再生根或再生芽來(lái)源于單細(xì)胞，有效避免了轉(zhuǎn)基因嵌合現(xiàn)象。

1.3 依賴再生力的活體注射遞送法

依賴再生力的活體注射遞送法（RAPID）也屬于植物原位轉(zhuǎn)化的一種，主要依賴于植物細(xì)胞本身的再生能力，該方法根據(jù)植物分生組織再生能力強(qiáng)的特點(diǎn)，在去除原有分生組織基礎(chǔ)上，利用注射器將農(nóng)桿菌遞送至分生組織周?chē)@得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性芽或陽(yáng)性根［52］。注射侵染后的莖切面觀察發(fā)現(xiàn)新生組織（轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性芽或陽(yáng)性根）起始于韌皮部的分生組織［53］。該方法與CDB方法類似，借助于植物無(wú)性繁殖方式，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性芽或陽(yáng)性根形成完整的轉(zhuǎn)基因植株［12，53］。在甘薯中，通過(guò)莖節(jié)的上端或下端注射根癌農(nóng)桿菌，直至菌液從其他針孔或切口處流出，以保證農(nóng)桿菌被遞送至韌皮部，韌皮部的分生組織被感染后再生陽(yáng)性根或陽(yáng)性芽，切取再生陽(yáng)性根或芽，利用莖扦插或塊根無(wú)性繁殖方式獲得再生植株（圖1E）［53］。該方法在甘薯6種不同基因型品種中都具有較高的轉(zhuǎn)化效率（12.5%～37.5%）（表1），表現(xiàn)出基因型不依賴潛力。該方法在馬鈴薯、月桂草、三七和百合等多種植物均成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株［53-54］。在煙草、金魚(yú)草和番茄中，注射農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染，再生陽(yáng)性芽效率較低，利用Wuschel（WUS）或PLETHORAs（PLT5）等發(fā)育調(diào)控基因協(xié)助轉(zhuǎn)化，可顯著提高獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性芽的效率［52，55］。在甘薯中比較RAPID與傳統(tǒng)的組培遺傳轉(zhuǎn)化方法，發(fā)現(xiàn)RAPID轉(zhuǎn)化周期僅需3～10周，組培方法需24～40周，轉(zhuǎn)化周期至少縮短75%；RAPID轉(zhuǎn)化效率為28%～40%，組培方法則為0.004%～0.2%，轉(zhuǎn)化效率至少提高100倍；可見(jiàn)，RAPID相比組培方法更簡(jiǎn)便和高效。相較于CDB只是將農(nóng)桿菌涂在傷口處，RAPID的農(nóng)桿菌在后續(xù)共培養(yǎng)過(guò)程中再遞送至分生組織，且利用注射器施加外壓將菌液直接遞送至植物分生組織，侵染效果更佳。

1.4 種子侵染法

基因型依賴是植物遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用于分子育種的主要障礙，盡管在許多物種中已建立了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但僅在少數(shù)基因型中適用，打破基因型依賴是遺傳轉(zhuǎn)化廣泛應(yīng)用于分子育種的前提［56］。植物種子中的胚包含有初生分生組織，具有發(fā)育成完整植株的能力，常作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料［4］。以萌發(fā)種子作外植體的非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法最早在擬南芥中建立，將萌發(fā)的擬南芥種子與農(nóng)桿菌菌液共同浸泡24h，將侵染后的種子轉(zhuǎn)移到濕潤(rùn)的蛭石進(jìn)行培養(yǎng)，可獲得轉(zhuǎn)基因植株并收獲轉(zhuǎn)基因種子，該方法操作簡(jiǎn)便且有效避免了漫長(zhǎng)的組織培養(yǎng)過(guò)程，但其轉(zhuǎn)化效率最高僅有0.32%，顯著低于擬南芥浸花法（4%），未成為擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化的主流方法［57］。但該方法相較于花器官侵染法不受花發(fā)育時(shí)期的影響，相較于切-浸-芽方法可應(yīng)用于再生能力弱的植物。對(duì)于大多數(shù)通過(guò)種子繁殖的植物特別是農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物，種子作為遺傳轉(zhuǎn)化外植體可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模侵染（一次可侵染幾千到幾萬(wàn)顆種子）［57］，方便構(gòu)建突變體庫(kù)，創(chuàng)制大量轉(zhuǎn)基因新種質(zhì)，培育優(yōu)良新品種。在菌液浸泡種子時(shí)，利用超聲波和真空滲透處理可有效提高種子的轉(zhuǎn)化效率，在花生［58］、大豆［59］、棉花［60］和柑橘［44］等植物中都有應(yīng)用，且都表現(xiàn)出不受基因型限制的潛力（圖1F）。以花生萌發(fā)后的半種子（胚和一半胚乳）作為外植體，通過(guò)超聲處理和真空滲透法結(jié)合，顯著提高轉(zhuǎn)化效率至31.3%～38.6%（表1），相較于早期擬南芥種子侵染法效率提高100倍左右，且該方法對(duì)花生5種基因型均適用，不受基因型限制［58］。利用該方法在50多個(gè)品質(zhì)優(yōu)良的商業(yè)化大豆品種中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，均獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)30%左右（表1），充分表明該方法在大豆中不受基因型依賴，可用于遺傳改良［59］。在檸檬、枳殼、甜橙和柚子4個(gè)不同基因型的柑橘中，以萌發(fā)的種子作為外植體，利用發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染，并抽真空10min，可獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性根，轉(zhuǎn)化效率均高于50%，其中檸檬和柚子的轉(zhuǎn)化效率高達(dá)90%以上［44］（表1）。該遺傳轉(zhuǎn)化方法在多個(gè)物種中都表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化效率高和基因型不依賴的特性，被命名為不依賴基因型的轉(zhuǎn)化方法（GIFT）。然而該方法并非適用于所有的物種，例如在單子葉植物玉米［61］、高粱［62］，以及果樹(shù)葡萄［63］中利用未成熟的胚或敗育的胚作為外植體，在無(wú)外界輔助條件下，仍難獲得高效的轉(zhuǎn)化效率。此外，對(duì)于高度雜合的植物，后代會(huì)出現(xiàn)性狀分離，所以不同轉(zhuǎn)基因植株之間的性狀分離會(huì)影響轉(zhuǎn)基因植物表型分析的準(zhǔn)確性。盡管GIFT存在一些弊端，但由于其具有操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化外植體基數(shù)大，不受再生能力和基因型限制等優(yōu)勢(shì)，在植物遺傳改良和分子育種中具有廣泛的應(yīng)用前景。

1.5 發(fā)育調(diào)控（DR）基因輔助轉(zhuǎn)化法

盡管依靠植物無(wú)性繁殖的特點(diǎn)和自身的強(qiáng)再生能力，在多個(gè)物種中建立了非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系，但自然界仍有許多植物由于再生能力弱，而無(wú)法建立高效的非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系。植物發(fā)育調(diào)控基因輔助轉(zhuǎn)化，可以打破基因型限制，顯著提高了植物的再生能力和轉(zhuǎn)化效率［55-56，64］。利用發(fā)育相關(guān)基因輔助轉(zhuǎn)化，許多難轉(zhuǎn)化的單子葉植物或基因型建立了高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體系，例如高粱、水稻和玉米等［64］。隨后，大量發(fā)育調(diào)控基因被報(bào)道可以提高轉(zhuǎn)化效率，包括Babyboom（BBM）［64］、WUS［64］、WUSCHELRE?LATEDHOMEOBOX5（WOX5）［65］、PTL［55］、iso?pentenyltransferase（ipt）［52］、WOUNDINDUCEDDEDIFFERENTIATION1（WIND1）［55］、EN?HANCEDSHOOTREGENERATION（ESR1）、growthregulatorfactor?GRFinteractingprotein（GRF?GIF）［56，61］等。在難轉(zhuǎn)化的玉米自交系中過(guò)量表達(dá)ZmBBM和ZmWUS，成功獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株，轉(zhuǎn)化效率超40%［64］。在單子葉植株高粱未成熟胚、甘蔗愈傷組織和水稻愈傷組織中異源表達(dá)ZmBBM和ZmWUS，也可以提高轉(zhuǎn)化效率［64］。BBM和WUS單獨(dú)或同時(shí)過(guò)表達(dá)，已被廣泛應(yīng)用在多個(gè)物種中以提高轉(zhuǎn)化效率，例如果樹(shù)葡萄［63］和禾本科植物畫(huà)眉草、柳枝稷、美洲千尾草、狐尾草、先鋒春小麥、黑麥、大麥等［66］。過(guò)量表達(dá)WOX5可以顯著提高蘋(píng)果和獼猴桃遺傳轉(zhuǎn)化再生效率和轉(zhuǎn)化效率［65］。然而，持續(xù)過(guò)表達(dá)BBM和WUS2會(huì)產(chǎn)生葉片扭曲、降低育性等影響植物正常發(fā)育的不利性狀［67-68］。為解決以上問(wèn)題，可通過(guò)切除輔助轉(zhuǎn)化的發(fā)育相關(guān)基因或?qū)⑤o助轉(zhuǎn)化的基因和轉(zhuǎn)化的目標(biāo)基因分別插入不同載體，篩選獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)化基因卻不攜帶輔助轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)基因植株［67］，但以上方法均存在一定隨機(jī)性和工作量大等問(wèn)題。而GRF-GIF嵌合基因或GRF5在促進(jìn)遺傳轉(zhuǎn)化的同時(shí)不會(huì)使植物發(fā)育異常，在多個(gè)物種中被報(bào)道，包括小麥［69］、柑橘［69］、大麻［70］、高粱［62］、大豆［71］，且BBM-GRF-GIF（BGG）組合在提高玉米轉(zhuǎn)化效率的同時(shí)也未引起發(fā)育異常［72］。因此，GRF-GIF嵌合基因具備輔助難轉(zhuǎn)化植物遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)良屬性。以上研究多在組培條件下促進(jìn)轉(zhuǎn)化效率的提升。在非組培條件下，將WUS2與細(xì)胞分裂素生物合成基因異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（ipt）組合，即過(guò)量表達(dá)Wus2-ipt組合顯著提高煙草再生芽能力［52］（表1）；在金魚(yú)草和番茄中，利用農(nóng)桿菌在莖尖分生組織處注射攜帶PLT5、WIND1和ESR1基因的過(guò)量表達(dá)載體，顯著促進(jìn)了傷口部位愈傷組織形成和芽再生［55］。PTL5在組培條件下促進(jìn)甘藍(lán)的再生和遺傳轉(zhuǎn)化，以及甜椒體胚的形成，表明發(fā)育調(diào)控因子在組培和非組培的應(yīng)用具有普適性［55］（表1），其他發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因也可嘗試應(yīng)用于提高非組培遺傳轉(zhuǎn)化效率。

1.6 病毒遞送法

病毒遞送法是基于RNA病毒防御機(jī)制開(kāi)發(fā)出來(lái)的病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virusinducedgenesilenc?ing，VIGS），通過(guò)將目的基因序列重組至病毒載體，遞送至植物組織，引起植物內(nèi)源同源mRNA降解或表觀修飾，誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默，引起表型變化［6］。VIGS無(wú)需組培操作，可以使用幼苗、葉片、果實(shí)等作為受體材料，通過(guò)農(nóng)桿菌攜帶病毒載體進(jìn)入植物組織和細(xì)胞并瞬時(shí)表達(dá)，在植物中被廣泛應(yīng)用于基因功能瞬時(shí)驗(yàn)證［73-74］。辣椒、桃等轉(zhuǎn)基因頑拗植物目前尚未構(gòu)建出農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系以獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，常采用VIGS系統(tǒng)驗(yàn)證基因功能［73，75］。對(duì)于童期長(zhǎng)的果樹(shù)，研究調(diào)控果實(shí)品質(zhì)基因的功能也常采用VIGS瞬時(shí)驗(yàn)證方法［76］。病毒遞送效率明顯高于傳統(tǒng)質(zhì)粒，但大多數(shù)病毒無(wú)法感染生殖細(xì)胞或分生組織，因而無(wú)法穩(wěn)定遺傳給后代，僅用于瞬時(shí)表達(dá)研究。將FT（floweringlocusT）基因融合至煙草脆裂病毒載體（tobaccorattlevirus，TRV）或棉花葉皺病毒（cottonleafcrumplevirus，CLCrV），可以引導(dǎo)病毒RNA載體移動(dòng)至頂端分生組織和花器官，可利用病毒遞送法無(wú)需經(jīng)過(guò)組織培育即可獲得轉(zhuǎn)基因苗［5，77］。病毒遞送相較于雙元載體，其遞送效率更高，不產(chǎn)生外源基因插入，利用FT基因輔助轉(zhuǎn)化能產(chǎn)生可遺傳變異，有潛力用于創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因可穩(wěn)定遺傳的基因編輯植株。

2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)非組培遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的非組培遺傳轉(zhuǎn)化具有操作簡(jiǎn)便、周期短、效率高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基因功能驗(yàn)證和分子育種［12］。然而，目前仍有許多物種未建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系，或轉(zhuǎn)化效率較低。農(nóng)桿菌介導(dǎo)非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系能否成功主要受外植體、農(nóng)桿菌、侵染方式和篩選方法等多種因素影響。了解農(nóng)桿菌介導(dǎo)的非組培遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素，將為更多物種建立高效非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系提供參考。

2.1 外植體類型與狀態(tài)

非組培遺傳轉(zhuǎn)化使用的外植體類型分為生殖器官和營(yíng)養(yǎng)器官2種，其中花器官侵染法是利用生殖器官并借助有性生殖過(guò)程完成轉(zhuǎn)化，種子侵染法是利用生殖器官但借助發(fā)育過(guò)程完成轉(zhuǎn)化，而CDB、RAPID和病毒遞送都是利用營(yíng)養(yǎng)器官并借助無(wú)性繁殖過(guò)程完成轉(zhuǎn)化。用于非組培遺傳轉(zhuǎn)化的外植體種類廣泛，包括種子、根、莖（葉芽分生組織和莖基部）、葉、花和果實(shí)等，一般選擇植物再生能力強(qiáng)的器官或部位作為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。浸花法以花器官作為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，在十字花科植物尤其擬南芥中應(yīng)用較多，轉(zhuǎn)化效率0.1%～4%。以種子作為外植體，多選用萌發(fā)的種子，并使用超聲波和真空滲透處理，轉(zhuǎn)化效率在30%以上［78］。利用根作為外植體通常使用具有根蘗繁殖能力的植物［12］。莖是非組培條件遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最廣泛的外植體之一，利用頂芽、腋芽分生組織和莖基部的再生能力獲得轉(zhuǎn)化植株。大豆［59］和馬鞭草［79］通過(guò)頂芽侵染，金魚(yú)草和番茄通過(guò)腋芽注射均獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性芽［55］，甘薯［53］和金魚(yú)草［53］通過(guò)腋芽注射獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性根。農(nóng)桿菌侵染莖基部后誘導(dǎo)獲得陽(yáng)性毛狀根或不定芽應(yīng)用最廣泛，在多種一年生草本和多年生木本植物中被應(yīng)用［12，42，46，48］。利用VIGS進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化也常使用葉片作為外植體，但由于多數(shù)葉片分化程度高，再生能力差，難以通過(guò)非組培途徑獲得再生芽或根［73］。但多肉植物葉片具有強(qiáng)再生能力，自然條件下可進(jìn)行插葉繁殖，由此建立了以葉片作為外植體的多肉植物非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系［36］。外植體類型的選擇，主要依據(jù)植物繁殖方式，選擇分化程度低，再生能力強(qiáng)的器官或組織作為非組培遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。對(duì)于以有性繁殖為主的糧食作物或經(jīng)濟(jì)作物可選擇花器官或種子作為外植體，對(duì)于以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主的多年生木本或草本植物則可選擇根、莖和葉片等營(yíng)養(yǎng)器官作為外植體。

外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)和發(fā)育階段也對(duì)轉(zhuǎn)化效率具有重要影響，一般情況下隨著植物年齡的增強(qiáng)，植物分裂能力降低，分化程度升高，再生能力發(fā)生不可逆減弱，盡管一些外源的刺激或處理可以使植物表現(xiàn)出幼齡期表型，但難以恢復(fù)到幼齡期狀態(tài)［80］。幼嫩材料具有較好的再生效果，能顯著提高植物的再生率。然而幼嫩植物本身對(duì)逆境抵抗能力差，因此過(guò)于幼嫩的植物受到農(nóng)桿菌侵染，容易褐化或死亡。因此，選擇幼嫩且生活力強(qiáng)的外植作為受體材料尤為重要。例如橡膠草選擇播種后3周左右幼苗，甘薯選擇塊根定植15d的莖作為遺傳轉(zhuǎn)化外植體［12］。

2.2 菌株類型

植物遺傳轉(zhuǎn)化常見(jiàn)的農(nóng)桿菌類型主要包括根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，其中根癌農(nóng)桿菌有GV3101、EHA105、EHA101、AGL1和LBA4404菌株，發(fā)根農(nóng)桿菌有K599、C85C1、MSU440、Ar.A4、Ar.Qual和Ar.1193菌株。這些菌株在基因型上存在一定差異，對(duì)不同物種具有一定的偏好性，侵染效率也有較大差異。甘薯RAPID方法中使用4種根癌農(nóng)桿菌GV3101、EHA105、EHA101、AGL1和1種發(fā)根農(nóng)桿菌K599分別注射至甘薯莖分生組織，比較發(fā)現(xiàn)AGL1菌株轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)28%，K599轉(zhuǎn)化效率小于2%［53］。而采用CDB方法進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化都使用K599菌株［12，35］，在甘薯中轉(zhuǎn)化效率均在90%以上，最高可達(dá)100%［81］。甘薯RAPID法和CDB法均使用了K599菌株，但轉(zhuǎn)化效率卻相差極大，表明對(duì)于同一個(gè)物種，侵染方式和外植體不同，菌株侵染效果也可能存在差異［12，35，53］。目前非組培條件下常用的菌株為K599發(fā)根農(nóng)桿菌菌株，該菌株宿主范圍較廣、轉(zhuǎn)化效率高。

2.3 菌液濃度和侵染時(shí)間

農(nóng)桿菌菌液濃度過(guò)高或侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，都會(huì)引起細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，導(dǎo)致外植體壞死、轉(zhuǎn)化效率降低，但侵染濃度過(guò)低或時(shí)間過(guò)短又會(huì)使外植體與農(nóng)桿菌接觸不充分，導(dǎo)致侵染效果變差，因此選擇合適的侵染濃度和時(shí)間很重要。當(dāng)菌液懸浮液OD600nm值為0.5時(shí)，對(duì)甘薯的侵染效果最好，轉(zhuǎn)化效率為25%，而當(dāng)OD600nm值為0.01時(shí)，侵染效果不佳，未獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性根［53］。一般情況下侵染液OD600nm值為0.6～1.0時(shí)，侵染效果最佳。侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不僅會(huì)使農(nóng)桿菌在外植體中過(guò)度殘留，也會(huì)對(duì)植物組織造成損傷，引起細(xì)胞壞死；但侵染時(shí)間過(guò)短，則會(huì)導(dǎo)致農(nóng)桿菌與植物組織接觸不完全，轉(zhuǎn)化效率過(guò)低。最佳侵染時(shí)間因外植體的類型不同而有所差異，例如柳樹(shù)葉片外植體的侵染時(shí)間為10～20min時(shí)，陽(yáng)性率最高為41.3%～44.4%，莖段的侵染時(shí)間大多在10～30min；芽苗侵染15min；種子侵染30min效果較好［82］。侵染時(shí)間與外植體類型和外植體狀態(tài)有關(guān)，但一般侵染時(shí)間在10～30min時(shí)，陽(yáng)性率較高，且不易造成組織壞死。

2.4 侵染方式

常見(jiàn)的侵染方式包括浸泡、真空滲透、注射、超聲損傷和蘸菌法等。以甘薯莖做為外植體，分別嘗試浸泡、真空滲透、注射多種方式進(jìn)行非組培遺傳轉(zhuǎn)化，僅注射法獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性根［53］。在傳統(tǒng)的組培遺傳轉(zhuǎn)化中，浸泡法應(yīng)用最廣泛，將外植體浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中，操作簡(jiǎn)便。但該方法侵染時(shí)間較長(zhǎng)，菌液進(jìn)入植物細(xì)胞效率較低，而且外植體長(zhǎng)時(shí)間浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中，容易造成細(xì)胞滲透壓失衡，出現(xiàn)組織壞死［52］。為促使菌液進(jìn)入植物細(xì)胞，常采取2種策略，一是通過(guò)真空滲透和注射施加外部壓力，在杜梨、柑橘和甘薯等植物中使用［46，52-53］，二是通過(guò)超聲波處理給植物制造微小傷口，在大豆、棉花和百合中使用［58-60］。蘸菌法主要利用發(fā)根和根癌農(nóng)桿菌可以在土壤中生存的特點(diǎn)，外植體蘸菌后插入基質(zhì)，待陽(yáng)性轉(zhuǎn)化根長(zhǎng)出［12，35-36，48］。在實(shí)際轉(zhuǎn)化過(guò)程中，可以使用單一的侵染方式或采用多種方式結(jié)合，減少對(duì)植物損傷的同時(shí)提高轉(zhuǎn)化效率［36］。使用CDB遺傳轉(zhuǎn)化法，外植體蘸菌處理后插入潮濕的蛭石，每個(gè)外植體再澆灌3～5mL菌液，提高轉(zhuǎn)化效率［12］。

2.5 篩選方式

轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性組織或器官的篩選方式主要包括抗性基因和可視化基因篩選，常用的抗性基因包括卡那霉素、潮霉素和抗除草劑基因［83］等；常用的可視化基因主要包括葡萄糖苷酶基因GUS、熒光素酶報(bào)告基因（LUC）、熒光蛋白基因（GFP、RFP、mCherry）和甜菜堿合成酶基因Ruby等［12，52-53］。在大豆非組培遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程利用乙酰乳酸合成酶基因（ALS）或5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因（EPSPS）作為篩選基因，通過(guò)噴施除草劑進(jìn)行抗性篩選［59］。盡管抗生素在一定程度上能抑制非陽(yáng)性組織生長(zhǎng)，但抗生素濃度過(guò)低對(duì)陽(yáng)性組織篩選效果差，濃度過(guò)高抑制植物生長(zhǎng)，因此利用抗性基因進(jìn)行陽(yáng)性篩選，必須先明確抗生素篩選濃度，且避免出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。為了解決這一問(wèn)題，可視化報(bào)告基因被廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化篩查。在甘薯中攜帶GUS基因的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性根被染成明顯的藍(lán)色［53］，在擬南芥和煙草中攜帶LUC基因的葉片使用化學(xué)試劑涂抹，在化學(xué)發(fā)光儀下有明顯的信號(hào)，但GUS染色或LUC處理后植物組織無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)而選擇綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白（RFP或mCherry）作為報(bào)告基因［35，54］，在相應(yīng)激發(fā)光下，可以看到明顯的綠色熒光或紅色熒光，該篩選方法對(duì)植物組織無(wú)損傷，且可以及時(shí)去除非陽(yáng)性組織，避免與陽(yáng)性組織競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)陽(yáng)性組織生長(zhǎng)；且便于統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率和篩選陽(yáng)性組織，目前大多數(shù)載體都會(huì)插入GFP、RFP或mCherry報(bào)告基因，用于轉(zhuǎn)基因篩選；該方法在杜梨［46］、大白菜［48］、長(zhǎng)壽花、玉樹(shù)以及單子葉虎尾蘭［36］和棉花［60］等多個(gè)物種中得到應(yīng)用。熒光蛋白做報(bào)告基因需熒光燈設(shè)備輔助篩選，且有些植物存在自發(fā)熒光，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。甜菜堿合成酶基因（Ruby）可以合成顏色紫紅色的甜菜堿，在遺傳轉(zhuǎn)化中用作報(bào)告基因，在轉(zhuǎn)化成功的組織或器官表現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的紫紅色，該報(bào)告基因相比于熒光蛋白，無(wú)需熒光燈照射，觀察起來(lái)更加方便，在甘薯［12，53］、金魚(yú)草［55］和番茄［55］等多個(gè)物種被用于構(gòu)建高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用可視化報(bào)告基因篩選遺傳轉(zhuǎn)化陽(yáng)性組織、器官和植株更為簡(jiǎn)單高效，在植物非組培遺傳轉(zhuǎn)化中被大量應(yīng)用。

3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的非組培遺傳轉(zhuǎn)化在基因編輯中的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)在植物中快速發(fā)展，高效簡(jiǎn)便的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的非組培遺傳轉(zhuǎn)化被廣泛應(yīng)用于基因編輯［12，52-53，59］。植物缺失八氫番茄紅素脫氫酶基因（phytoenedesaturase，PDS），表現(xiàn)明顯的白化表型，因此在基因編輯體系建立時(shí)常采用該基因作為靶基因設(shè)計(jì)guideRNA（gRNA）；通過(guò)觀察植物白化現(xiàn)象，分析基因編輯效果，進(jìn)而構(gòu)建和優(yōu)化植物基因編輯體系。攜帶PDS基因gRNA的編輯載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系CDB、RAPID和GIFT進(jìn)行轉(zhuǎn)化，都獲得了白化芽或白化苗，且編輯效率可在T1代中穩(wěn)定遺傳，表明這些高效遺傳轉(zhuǎn)化體系能與基因編輯結(jié)合創(chuàng)制穩(wěn)定遺傳的新種質(zhì)［12，52-53，59］。在菊花中將CDB非組培遺傳轉(zhuǎn)化與表觀基因編輯CRISPR/dCas9結(jié)合，表觀調(diào)控花青素合成關(guān)鍵基因CmMYB6的啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)對(duì)菊花花色深淺雙向調(diào)控［84］。發(fā)育調(diào)控基因也被應(yīng)用于提高基因編輯效率，將WUS2-ipt構(gòu)建至攜帶PDS基因gRNA的CRISPR-Cas9載體，侵染煙草葉芽分生組織，再生白化芽，且基因編輯效果能傳遞給下一代［52］。GRF-GIF嵌合基因過(guò)量表達(dá)不引起發(fā)育異常表型，在遺傳轉(zhuǎn)化中被廣泛用于提高轉(zhuǎn)化效率。在組培條件下GRF-GIF嵌合基因也被重組至基因編輯載體，提高轉(zhuǎn)化效率和編輯效率。大麻［70］、西瓜［83］、玉米自交系［72］、高粱［62］和大豆［71］等植物均已通過(guò)該方法獲得了基因編輯植株。過(guò)表達(dá)不引起發(fā)育異常的發(fā)育調(diào)控基因GRF-GIF有望被應(yīng)用到更多的植物物種或基因型中，為基因編輯精準(zhǔn)創(chuàng)制新種質(zhì)提供技術(shù)支持。

病毒載體遞送基因編輯組件獲得非轉(zhuǎn)基因的基因編輯植株稱為病毒誘導(dǎo)的基因組編輯（virus-in?ducedgenomeediting，VIGE）。植物病毒載體具有遞送效率高、寄主范圍廣等特點(diǎn)，利用病毒誘導(dǎo)基因沉默在植物基因功能驗(yàn)證中被廣泛應(yīng)用［74］。傳統(tǒng)的病毒載體可以遞送小的核酸元件，通常在1kb以內(nèi)，而CRISPR-Cas9骨架大約4kb，超過(guò)了其容量限制。針對(duì)該問(wèn)題，首先創(chuàng)制出Cas9轉(zhuǎn)基因植物，再將gRNA重組至病毒載體，遞送至Cas9轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)而獲得基因編輯植株［5-6，85］。然而，對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化效率低的植物，難以創(chuàng)制Cas9轉(zhuǎn)基因植物，利用病毒載體直接遞送整個(gè)CRISPR-Cas組件可以有效避免外源基因插入，創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因的基因編輯植株，因此挖掘和開(kāi)發(fā)大容量病毒載體是將病毒載體廣泛應(yīng)用于基因編輯的關(guān)鍵。目前開(kāi)發(fā)的具有較大轉(zhuǎn)運(yùn)容量的病毒載體有馬鈴薯X病毒（PVX）、大麥黃條紋花葉病毒（BYSMV）、苦苣菜黃網(wǎng)病毒（SYNV）和番茄斑萎病毒（TSWV）等［86-87］。PVX是一種彎曲棒狀病毒，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將插入CRISPR-Cas9組件的PVX接種煙草葉片，通過(guò)組織培養(yǎng)獲得的再生芽60%具有編輯效果［88］。SYNV和BYSMV屬于植物負(fù)鏈RNA病毒，相較正鏈RNA病毒與DNA病毒具有更強(qiáng)大的承載能力和基因穩(wěn)定性。在煙草中利用SYNV和BYSMV攜帶CRISPR-Cas9相關(guān)組件，實(shí)現(xiàn)了煙草基因組編輯［9］。TSWV也是天然的大容量病毒載體，其宿主范圍廣，多達(dá)1000多個(gè)，在難轉(zhuǎn)化植物辣椒中利用TSWA載體攜帶CRISPR-Cas9組件，轉(zhuǎn)化辣椒組培苗，獲得的再生植株77.9%具有可遺傳突變［8，86］。由于病毒載體難以進(jìn)入分生組織，目前用病毒載體遞送CRISPR-Cas9等基因編輯組件多通過(guò)組培途徑再生基因編輯植株，鑒于FT基因可協(xié)助病毒載體移動(dòng)至分生組織［5］，利用FT基因輔助轉(zhuǎn)化結(jié)合大容量病毒載體遞送，可以創(chuàng)制非組培、可穩(wěn)定遺傳、非轉(zhuǎn)基因的基因編輯種質(zhì)。

4 其他非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法

4.1 花粉管通道法

花粉管通道法主要是利用植物授粉完成后形成花粉管，外源DNA或外源基因順著花粉管進(jìn)入不具有細(xì)胞壁或細(xì)胞壁不完整的胚囊，整合到卵細(xì)胞、合子或早期胚胎的轉(zhuǎn)化方式［89］。1983年花粉管通道法首先在棉花中建立［89］，由于該方法無(wú)需建立組培體系且不依賴基因型，在許多物種中被廣泛應(yīng)用，包括草本植物小麥［90-91］和玉米［92］以及木本植物月季［93］、石榴［93］和茶樹(shù)［94］等?；ǚ酃芡ǖ婪▽?dǎo)入外源DNA的方式主要分為3種，花粉粒攜帶法、子房注射法和柱頭切除法［95］。棉花中主要以子房注射法為主［96］，利用花粉管通道法已培育了大量轉(zhuǎn)基因棉花新品種［97］。水稻花粉管通道法起步較早，早在1985年利用該方法獲得具有紫色穎殼的轉(zhuǎn)基因水稻［98］。目前該方法在水稻遺傳改良中已應(yīng)用40多年，成功培育出多個(gè)具有早熟、晚熟、優(yōu)質(zhì)和抗性優(yōu)良的水稻新品系和新品種。小麥利用花粉管通道法獲得了抗蟲(chóng)、葉片衰老延緩和品質(zhì)改良的轉(zhuǎn)基因材料［99-100］。在玉米自交系中通過(guò)花粉管通道法轉(zhuǎn)化EPSPS基因，成功創(chuàng)制耐草甘膦玉米新種質(zhì)，轉(zhuǎn)化效率為1.03%［92］。花粉管通道法雖然在多個(gè)物種中用于遺傳育種，但要求的條件相對(duì)嚴(yán)苛，重復(fù)性差、效率低，且結(jié)果受環(huán)境因子影響明顯。

4.2 粒子轟擊法

粒子轟擊又稱基因槍，其原理主要是利用高速氣體沖擊波將表面吸附包含目的基因DNA序列的金粉或鎢粉進(jìn)行射擊，使其穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞核，最終整合至基因組，完成轉(zhuǎn)基因。粒子轟擊不受基因型限制，適用的物種范圍更廣泛，尤其被廣泛應(yīng)用于難轉(zhuǎn)化的禾本作物水稻［101］、小麥［102］、玉米［103］、高粱［104］和甘蔗［105］等的遺傳改良。粒子轟擊介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，常使用愈傷組織、未成熟的胚作為受體材料，通過(guò)組織培養(yǎng)過(guò)程獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，在大麥中利用非組培條件下的種子作為外植體進(jìn)行基因瞬時(shí)表達(dá)分析［106］，但利用粒子轟擊進(jìn)行非組培條件下的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化鮮有報(bào)道。利用粒子轟擊遞送基因編輯CRISPR/Cpf1或ZFNs骨架至植物組織中已在水稻［101］和大豆［107］中被報(bào)道。盡管粒子轟擊具有不受基因型依賴、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但是其仍存在一些缺點(diǎn)，如設(shè)備昂貴導(dǎo)致轉(zhuǎn)化成本高、轟擊隨機(jī)性強(qiáng)使轉(zhuǎn)化效率低、且容易對(duì)植物組織造成損傷，這些因素都限制了粒子轟擊在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的廣泛應(yīng)用。

4.3 納米遞送法

納米顆粒在無(wú)外力的情況下能穿透植物細(xì)胞壁，使其成為外源分子遞送的理想材料。納米材料遞送外源分子或者核酸無(wú)需外力作用，只需要簡(jiǎn)單的注射或者噴灑即可實(shí)現(xiàn)納米基因載體的遞送和表達(dá)，且不受物種限制。近年嘗試將納米材料應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，在煙草、棉花、水稻等植物中作為核酸載體得以應(yīng)用［108］。納米材料遞送外源核酸分子進(jìn)入植物細(xì)胞，不像農(nóng)桿菌介導(dǎo)一般整合到基因組上遺傳給后代，所以常用于瞬時(shí)表達(dá)熒光蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位［109］或者遞送小干擾RNA（smallin?terferingRNA，siRNA）［110］、RNA干擾（RNAinter?ference，RNAi）［7］和雙鏈RNA（doublestrandRNA，dsRNA）［111］等非編碼RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默。利用納米材料遞送CRISPR-Cas基因編輯載體，可在無(wú)外源基因插入的情況下，在基因組上進(jìn)行基因編輯等修飾，并使基因編輯效果穩(wěn)定遺傳給后代，是創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因基因編輯材料的有效手段。在動(dòng)物細(xì)胞中，通過(guò)脂質(zhì)納米顆粒遞送穩(wěn)定的CRISPR-Cas9核糖核蛋白對(duì)肺和肝臟組織中致病的SFTPC基因進(jìn)行編輯，編輯效率高達(dá)19%［112］。利用納米材料遞送CRISPR-Cas組件在植物基因工程領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

5 總結(jié)與展望

高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯技術(shù)是分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵，盡管目前已建立了多個(gè)高效的非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系，且在基因編輯中得到應(yīng)用，但這些方法仍未在多種植物中推廣。限制植物遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵原因有植物再生能力差、遞送效率低和農(nóng)桿菌不敏感等問(wèn)題。結(jié)合目前已有的非組培遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)植物未來(lái)選擇合適的遺傳轉(zhuǎn)化方式進(jìn)行展望。

針對(duì)植物再生能力差的問(wèn)題，植物細(xì)胞都具有發(fā)育成完整植株的潛能，但隨著植物年齡的增長(zhǎng)和分化程度提高，再生能力不斷減弱。植物分生組織中存在著分生干細(xì)胞，這些細(xì)胞分化程度低，再生能力強(qiáng)，在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中應(yīng)充分利用植株分生組織再生能力強(qiáng)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化方法，例如選擇包含分生組織的莖尖作為外植體，或者利用注射器、真空滲透等方式，將農(nóng)桿菌滲透至分生組織，以提高轉(zhuǎn)化效率；針對(duì)無(wú)性繁殖能力強(qiáng)的植物，依據(jù)其無(wú)性繁殖規(guī)律，選擇莖基部或根作為受體材料，可以顯著提高轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)這2種方式都無(wú)法提高轉(zhuǎn)化效率時(shí)，可借助發(fā)育相關(guān)基因輔助遺傳轉(zhuǎn)化，特別是持續(xù)過(guò)量表達(dá)不會(huì)引起發(fā)育缺陷的GRF-GIF嵌合基因。不同植物發(fā)育調(diào)控基因促進(jìn)轉(zhuǎn)化的效果并不一樣，可以通過(guò)嘗試使用多種發(fā)育調(diào)控基因或組合成不同的嵌合序列進(jìn)行輔助轉(zhuǎn)化。

針對(duì)遞送效率低的問(wèn)題，在植物遺傳轉(zhuǎn)化中常使用的質(zhì)粒是由雙鏈DNA形成的環(huán)狀雙元載體，大小在1000kb左右，其遞送片段的效果遠(yuǎn)低于RNA病毒載體，因此選擇大容量病毒載體攜帶基因編輯組件進(jìn)入植物細(xì)胞進(jìn)行編輯，可有效解決編輯效果差的問(wèn)題。針對(duì)陽(yáng)性篩選的問(wèn)題，利用可視化的陽(yáng)性植物篩選標(biāo)記例如GFP熒光標(biāo)記或Ruby等，可以在無(wú)損情況下，無(wú)需復(fù)雜儀器，無(wú)損觀察轉(zhuǎn)基因效果，便于早期篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性組織。針對(duì)農(nóng)桿菌不敏感型植物，可結(jié)合納米材料遞送法和粒子轟擊法進(jìn)行基因型不依賴的遺傳轉(zhuǎn)化。綜上，通過(guò)強(qiáng)再生能力外植體選擇、發(fā)育基因輔助、病毒載體、可視化篩選編輯、粒子轟擊和納米材料遞送等方式，可以有效解決遺傳轉(zhuǎn)化困難的問(wèn)題。未來(lái)將高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因編輯結(jié)合，在植物中實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)分子設(shè)計(jì)育種。