利用CO2合成揮發(fā)性脂肪酸的同型產(chǎn)乙酸反應的影響因素

關鍵詞同型產(chǎn)乙酸反應；厭氧發(fā)酵；CO2資源化；pH；碳源

將CO2回收并加以利用，對于改善生態(tài)環(huán)境具有重大意義。CO2可以通過捕集、封存、固定、再利用等方法進行處理，如與H2、CO等一起可以通過化學轉化法合成乙酸［1-2］或乙醇［3］，實現(xiàn)固碳和減排。但相比于化學轉化法，微生物轉化技術在降低能耗，減少成本方面則更具有吸引力［3-4］。

同型產(chǎn)乙酸菌是一類能夠利用H2、CO2進行自養(yǎng)生長且能利用外來有機物異養(yǎng)生長的兼性厭氧微生物［5-6］，其在利用富含CO2和H2的生物氣、工業(yè)合成氣（CO/CO2/H2）和木質(zhì)纖維素時表現(xiàn)出極強的發(fā)酵潛力［7-8］，是生物法生產(chǎn)乙酸的合適菌種，在不同的代謝條件下，反應還會生成丙酮酸、丁酸和乙醇［9-10］等基本的化工原料［11］。利用同型產(chǎn)乙酸菌處理有機廢水或廢氣，能夠在農(nóng)業(yè)廢棄物減量化的同時實現(xiàn)資源的高值化利用。

根據(jù)同型產(chǎn)乙酸菌可利用CO2和H2生成乙酸的代謝特性，已有一些學者對其利用合成氣以及發(fā)酵效率提升等方面進行了研究。Kim等［12］發(fā)現(xiàn)，通過控制氣體壓力可以使Closteidiumljungdahlii利用混合氣體（CO、CO2、H2）產(chǎn)生不同的末端代謝產(chǎn)物，并證實投加硅納米顆粒可以提高氣體的溶解度，從而提高產(chǎn)物產(chǎn)量。朱慧等［13］以Clostridiumsp.菌株BXX為發(fā)酵菌種，利用H2/CO2為底物進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)生成乙酸的轉化率達到了104.00%。這表明同型產(chǎn)乙酸菌利用H2與CO2混合氣體自養(yǎng)合成乙酸的方法是可行的，然而對于純菌種的培養(yǎng)與分離成本相比于混菌發(fā)酵更高。

目前針對利用合成氣進行同型產(chǎn)乙酸厭氧發(fā)酵的研究大部分使用的是純菌種［14-16］，但由于純菌種的培養(yǎng)條件較為嚴格，大規(guī)模工業(yè)應用成本較高，因此近年來研究熱點已逐步轉向使用混菌發(fā)酵。Zhang等［17］利用中空纖維膜反應器進行了合成氣（VH2∶VCO2=3∶2）混菌發(fā)酵，結果表明，當pH=6.0、膜面積為0.11m2時，反應器中的氫氣可以完全被利用，代謝產(chǎn)物如乙酸、丁酸、己酸和辛酸的最高質(zhì)量濃度分別達到7.4、1.8、0.98和0.42g/L；當中空纖維膜的膜面積擴大至0.28m2，pH值控制在4.5～4.8時，乙酸產(chǎn)量最高可達12.5g/L［18］。隨著不同菌種的代謝機制不斷被闡明，合成氣厭氧發(fā)酵產(chǎn)乙酸技術也會向實際應用更進一步。

同型產(chǎn)乙酸菌作為一種自養(yǎng)和異養(yǎng)都存在的微生物，其反應途徑存在一定差異，利用外來有機物進行異養(yǎng)生長時會對其自養(yǎng)生長產(chǎn)生一定的影響［19］。目前針對多種碳源同時存在時對同型產(chǎn)乙酸影響的相關研究較少。BP神經(jīng)網(wǎng)絡是目前應用最廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡模型之一，它可以學習和儲存大量的輸入輸出模型之間的映射關系，并且不需要對映射之間的方程關系進行事先輸入。尹鵬等［20］通過BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型的建立，結合遺傳算法對釀酒酵母的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。馬鳳英等［21］針對秸稈發(fā)酵制備燃料乙醇的過程中乙醇濃度實時檢測困難的問題，建立了一種考慮時滯的神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型，可以更精確的對乙醇濃度進行實時軟測量。

工業(yè)合成氣中含有大量的CO2，實現(xiàn)CO2的資源化利用對目前環(huán)境改善具有重大意義。本研究利用厭氧污泥進行同型產(chǎn)乙酸菌的富集培養(yǎng)，隨后分別以葡萄糖、CO2和H2為底物，研究碳源種類、H2/CO2比例對反應產(chǎn)物的影響規(guī)律，使用Matlab建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型，預測不同H2/CO2和pH條件下同型產(chǎn)乙酸反應揮發(fā)性脂肪酸（volatilefattyacids，VFAs）產(chǎn)量，為CO2的高效利用提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗厭氧污泥取自污水處理廠，為滅活污泥中的產(chǎn)甲烷菌，防止產(chǎn)生的H2、揮發(fā)性脂肪酸（volatilefattyacids，VFAs）被轉化為CH4，需要將污泥放置在高壓滅菌鍋內(nèi)121℃保溫30min。隨后對滅菌后的污泥進行30d的富集培養(yǎng)馴化，具體步驟為：取400mL污泥接種于1000mL的發(fā)酵瓶中，加入500mL基礎培養(yǎng)基進行同型產(chǎn)乙酸菌的富集培養(yǎng)，整個培養(yǎng)周期持續(xù)30d，富集培養(yǎng)溫度為（36±1）℃。為避免產(chǎn)甲烷菌滅活不徹底造成的干擾，在培養(yǎng)初期加入60mmol/L的2-溴乙基磺酸鈉（BES）抑制產(chǎn)甲烷菌的活性。富集分為3個階段：第一階段（第1天至第9天），加入4g/L的葡萄糖作為碳源以此來富集所有菌群；第二階段（第10天至第15天），加入2.5g/L的葡萄糖與1.3g/L甲酸鈉，逐步減少葡萄糖的添加量，使培養(yǎng)的微生物逐步適應甲酸鈉的碳源環(huán)境；第三階段（第16天至第30天），加入3.25g/L甲酸鈉以富集同型產(chǎn)乙酸菌［22］。培養(yǎng)后污泥的TS和VS分別為13.56%和8.95%。同型產(chǎn)乙酸菌培養(yǎng)基的營養(yǎng)元素組成及其添加質(zhì)量濃度如下：NH4Cl0.5g/L，MgCl20.3g/L，K2HPO40.25g/L，KH2PO40.25g/L，F(xiàn)eCl30.025g/L，NiSO40.016g/L，CaCl20.025g/L，ZnCl20.0115g/L，CoCl0.0105g/L，CuCl20.005g/L，MnCl20.015g/L。培養(yǎng)期結束后，對甲酸鈉進行檢測，此時甲酸鈉的利用率達到（97.93±0.37）%，代表菌種富集培養(yǎng)完全［22］。

1.2 試驗裝置與方案

同型產(chǎn)乙酸反應的試驗裝置如圖1所示。本試驗采用半連續(xù)式發(fā)酵，在標準大氣壓下考察pH值、H2/CO2比例和碳源組成對同型產(chǎn)乙酸反應產(chǎn)物濃度的影響。取80mL富集了同型產(chǎn)乙酸菌的污泥于500mL發(fā)酵瓶中，加入250mL純水，連接裝有不同比例H2和CO2的氣袋（容積為5L），氣體比例通過蠕動泵進行調(diào)配，氣泵每15min運行1次，將氣袋中的氣體泵入發(fā)酵瓶，以達到保持發(fā)酵瓶頂空氣體比例的目的。每24h更換1次氣袋，保持混合氣體的比例波動范圍在3%內(nèi)。利用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值，每24h進行1次取樣，對發(fā)酵體系中的pH、VFAs和氣體進行測定。

試驗采用全因素試驗，并進行3組重復試驗，每組發(fā)酵周期為10d。同型產(chǎn)乙酸的反應式：

由式（1）可以看出，H2與CO2的消耗體積比為2∶1，但由于所使用的底物為混合菌種，因此在體系內(nèi)會存在其他的耗H2反應，導致實際氣體消耗比會大于理論氣體消耗比。因此為了探究最優(yōu)的同型產(chǎn)乙酸菌自養(yǎng)合成乙酸時的頂空條件，設置了4種不同的H?/CO?體積比，分別為5∶1、4∶1、3∶1和2∶1，每種體積比均在pH值為5、7和9的條件下進行試驗。

1.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型的建立與訓練

采用Levenberg-Masrquardt算法，并使用train?lm函數(shù)，訓練步數(shù)為1000，訓練目標最小誤差為1.0×10?6。隨后利用xlsread函數(shù)讀取試驗所得數(shù)據(jù)，訓練數(shù)據(jù)占總樣本數(shù)據(jù)的70%左右。采集到的同型產(chǎn)乙酸反應試驗裝置的運行數(shù)據(jù)共60組（反應過程中隨時進行取樣），隨機選取其中的50組作為訓練數(shù)據(jù)，剩余的10組為驗證數(shù)據(jù)。采取mapmin?max函數(shù)進行歸一化處理，歸一化后的數(shù)據(jù)在（?1，1）范圍內(nèi)。建立的網(wǎng)絡模型輸入層節(jié)點數(shù)為3，輸出層節(jié)點數(shù)為1，隱含層為一層［23-24］，采用試錯法確定模型的最佳隱含層節(jié)點數(shù)為8，誤差大小為0.075665，說明擬合效果較好。使用newff函數(shù)建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡，本研究的模型訓練通過MatlabR2016b運行。

2 結果與分析

2.1 頂空H2/CO2體積比與pH對VFAs質(zhì)量濃度的影響

圖2為發(fā)酵液中VFAs在不同pH和H2/CO2體積比條件下的質(zhì)量濃度及產(chǎn)物分布，VFAs的整體趨勢為先上升后下降。試驗中生成的VFAs主要包括乙酸、丙酸和丁酸，除pH值為5、H2/CO2體積比為4∶1和5∶1的2個試驗組中乙酸的產(chǎn)量占總酸含量的60%之外，其他試驗組中的乙酸占比均超過70%。在pH值分別為5、7和9條件下，VFAs質(zhì)量濃度最高值分別出現(xiàn)在H2/CO2體積比為3∶1、4∶1和3∶1的試驗組中，這表明H2/CO2體積比在3∶1至4∶1時是在以氣體為碳源進行同型產(chǎn)乙酸反應合成VFAs時的最佳反應條件。在pH值為5，H2/CO2體積比為3∶1的情況下，VFAs質(zhì)量濃度最高，達到3369.89mg/L。此時，乙酸的含量在VFAs中占比最大，為76.1%。方差分析表明，pH對于同型產(chǎn)乙酸的影響比H2/CO2體積比的影響大，但二者均不顯著（Pgt;0.05）。主要原因在于隨著pH值的升高，CO2的溶解度上升，在溶于水后生成碳酸中和了堿性環(huán)境，導致實際H2/CO2體積比升高，同型產(chǎn)乙酸菌可利用的CO2量降低。而且，在同型產(chǎn)乙酸反應中，CO2的影響要大于H2的影響，因此，VFAs的產(chǎn)量隨著pH的升高只有增加的趨勢，pH的影響表現(xiàn)出不顯著，但若以pH為5、7進行方差分析，則pH值的影響較為顯著（P＜0.05）。由同型產(chǎn)乙酸反應式可知，乙酸是該反應的唯一產(chǎn)物，但本試驗中卻同時存在丙酸和丁酸的生成。這是因為在同型產(chǎn)乙酸反應過程中，除乙酸外，乙醛、硝酸鹽、亞硝酸鹽、質(zhì)子、丙酮酸等物質(zhì)都有可能成為同型產(chǎn)乙酸菌的最終電子受體［25］，并且有研究表明，一些同型產(chǎn)乙酸菌如E.limosum、B.methylotrophicum和C.pfennigii可以利用CO2轉化為丁酸［26-29］。因此，在本試驗中的最終產(chǎn)物中也會含有乙酸外的其他VFAs。

在不同條件下，丙酸和丁酸的濃度不同。3個pH水平下，VH2∶VCO2=5∶1時的丁酸產(chǎn)量在VFAs總量中的占比相較其他2組氣體比例下都是最高的，分別是26.3%、18.8%和17.2%，此時乙酸含量占比最低，分別為58.5%、70.0%和75.7%。這是因為當H2與乙酸共存時，易發(fā)生逆β氧化反應，乙酸發(fā)生碳鏈延長生成丁酸［30］，當氫分壓增高時，從熱力學角度來看，反應會向耗氫的方向移動，即促進同型產(chǎn)乙酸反應的進行，因此在發(fā)酵液中會產(chǎn)生更多的乙酸與頂空H2進行碳鏈延長生成丁酸［31］。同時，由于抑制了產(chǎn)甲烷菌的活性，H2和乙酸的部分消耗途徑受到了抑制，導致產(chǎn)物積累，所以也造成丁酸的增多。雖然H2分壓的升高會促進同型產(chǎn)乙酸反應，但體系內(nèi)H2分壓過高，也會使發(fā)酵初期乙酸積累較快，從而加速發(fā)酵液的酸化，導致菌種由于環(huán)境中pH值的劇烈變化而活性下降，最終導致發(fā)酵過早停止，這也解釋了試驗中當H2/CO2體積比為5∶1時，VFAs產(chǎn)量相比于其他頂空環(huán)境較低的原因。pH=5時的丁酸占比要高于其他pH值條件下的丁酸占比。這是由于在低pH值條件下，為了保證細胞內(nèi)的pH值在適宜范圍內(nèi)，使有機體能夠進行正常的合成代謝，產(chǎn)酸菌通常會通過反饋抑制，增加丁酸以及中性末端產(chǎn)物的產(chǎn)量［32］。

2.2 氣體消耗量對VFAs產(chǎn)量的影響

圖3顯示的是不同pH值和H2/CO2體積比條件下同型產(chǎn)乙酸反應的氣體消耗量。由圖3可以看出，氣體消耗情況與VFAs產(chǎn)量變化趨勢相符，H2消耗量為1.25～1.77L/d，CO2消耗量為0.25～0.43L/d。整體而言，在H2/CO2體積比為3∶1條件下氣體消耗量較高，分別為2.2、1.71和2.03L/d。在pH=5、H2/CO2體積比為3∶1時，H2和CO2的消耗量均達到最大值，分別為1.77和0.43L/d。pH=9時各組的氣體消耗總量要略大于其他2個pH值下的消耗總量。這與前文VFAs的產(chǎn)量趨勢相對應。由公式（1）可知，同型產(chǎn)乙酸反應利用H2和CO2生成乙酸的理論消耗比為2∶1，但經(jīng)過本試驗研究發(fā)現(xiàn)4組不同氣體比例的試驗中除了H2/CO2為5∶1組外，其他3組消耗的H2和CO2消耗比例都穩(wěn)定在4∶1左右。其中，氣體消耗比最小值出現(xiàn)在pH=5、H2/CO2體積比3∶1時，為4.12；最大值出現(xiàn)在pH=7、VH2∶VCO2=5∶1時，為5.40，遠遠高于理論值。原因可能在于混合菌種中存在多種同型產(chǎn)乙酸菌，不同的菌種對于H2與CO2利用的程度不同，其中一些耗氫菌種消耗掉了一部分H2，使得實際的氣體消耗比例大于2∶1［6］。

2.3 碳源種類對同型產(chǎn)乙酸反應的影響

同型產(chǎn)乙酸菌既可以運用其獨特的機制利用H2和CO2進行自養(yǎng)生長，同時也可以通過大多數(shù)菌種的普遍特性利用有機物進行異養(yǎng)生長，但是2種生長方式所經(jīng)歷的代謝途徑存在差異［6］，因此添加外來有機物會影響到同型產(chǎn)乙酸菌利用合成氣進行自養(yǎng)生長以及產(chǎn)酸的性能。為了探究不同碳源種類以及混合碳源對于同型產(chǎn)乙酸反應的影響，本試驗采用發(fā)酵條件較好的頂空VH2∶VCO2=3∶1為氣相環(huán)境同時加入2g/L的葡萄糖作為外加碳源進行厭氧發(fā)酵。如圖4所示，當H2、CO2與葡萄糖共同作為碳源時，發(fā)酵液中VFAs組分仍然為乙酸、丙酸和丁酸，與只有H2、CO2作為碳源時相同（圖2）。相比于僅有氣體作為碳源，VFAs的產(chǎn)量隨著pH值的升高而逐漸增加，從2638.91mg/L（pH=5）升至3277.80mg/L（pH=9），在pH=5時，混合碳源的VFAs產(chǎn)量低于以氣體為碳源的產(chǎn)量，降低約19%，但隨著pH值的升高，在pH=9時，混合碳源的VFAs產(chǎn)量與以氣體為碳源時幾乎相同。原因可能在于葡萄糖的水解會使發(fā)酵液快速酸化，當pH=5時，體系中pH降低過快，導致含有葡萄糖碳源的反應停止，因此VFAs產(chǎn)量相比于只以H2、CO2為碳源時少［33］。而在高pH值的環(huán)境下，反應初期，葡萄糖水解造成的pH下降得到相應的緩沖，使發(fā)酵能夠繼續(xù)進行，同時由于補充了外加碳源，從而導致VFAs產(chǎn)量提升。3個pH水平下乙酸與丙酸的質(zhì)量濃度差別不大，分別在2058.92～2229.80、235.19～247.47mg/L，但丁酸產(chǎn)量相差較大。當pH值上升到9時，丁酸的產(chǎn)量有明顯的升高，達到800.51mg/L，比pH=5和pH=7時的產(chǎn)量分別提高了126.8%和75.9%。這是因為pH值升高也會使逆β反應活躍進行，增強了乙酸的碳鏈增長反應，從而生成更多的丁酸［30］。

圖5為2種碳源共存的情況下，葡萄糖與氣體在不同pH值下的消耗量與殘留量。由圖5A中可以看出，在3種pH值水平下，反應結束時葡萄糖基本消耗殆盡，殘留量僅有66.57、94.23和153.31mg/L。結合圖3可知，此時的氣體消耗量比只以H2/CO2為底物碳源時的消耗量少，氣體消耗量在pH值條件為5、7、9時分別降低43.1%、62.5%和84.2%。說明外加葡萄糖會在一定程度上影響同型產(chǎn)乙酸菌的代謝活動。

為了深入探究同型產(chǎn)乙酸菌在添加外源有機物時對合成氣利用的影響情況，在葡萄糖和H2/CO2氣體共存時，選擇pH=7時的同型產(chǎn)乙酸反應試驗進行實時監(jiān)測，每隔1h取樣1次，得到氣體消耗和葡萄糖利用情況如圖6所示。

由圖6可知，在2種碳源共存的情況下，同型產(chǎn)乙酸反應前期（反應0～5h），葡萄糖的質(zhì)量濃度隨著反應的進行逐漸降低，此時氣體的消耗量基本為0。表明在2種碳源共存條件下同型產(chǎn)乙酸菌在發(fā)酵前期會以葡萄糖為主要碳源進行異養(yǎng)生長。考慮到葡萄糖的水解反應會產(chǎn)生H2和CO2（C6H12O6+2H2O→2CH3COOH+2CO2+4H2=?206kJ/mol），可以認為氣體的產(chǎn)生與消耗處于平衡狀態(tài)。當反應進行5～6h后，葡萄糖質(zhì)量濃度降低1.00～0.85g/L后，同型產(chǎn)乙酸菌開始大量利用氣體進行乙酸的合成，此時菌體的自養(yǎng)途徑與異養(yǎng)途徑同時進行。結合圖5可知，在氣體與葡萄糖共存時，氣體消耗量較少的原因在于頂空中的氣體并沒有完全參與反應的全過程，并且在葡萄糖被利用的同時會生成VFAs，使發(fā)酵液pH值降低，從而導致CO2溶解度下降，氣體利用不完全。

2.4 同型產(chǎn)乙酸反應產(chǎn)酸預測模型的建立

借助人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型，使用Matlab建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型，對以H2/CO2氣體為底物的同型產(chǎn)乙酸反應生成的VFAs產(chǎn)量進行預測。

1）相關性分析。對所測數(shù)據(jù)進行相關性分析考察變量之間是否具有顯著相關性，確保以此數(shù)據(jù)進行建模的可行性。利用SPSS進行數(shù)據(jù)相關性分析的結果如表1所示。由表1可知，VFAs質(zhì)量濃度與pH值之間呈弱正相關性，而與H2/CO2呈現(xiàn)出負相關的趨勢，這表明同型產(chǎn)乙酸反應自養(yǎng)途徑中以H2與CO2為碳源時，CO2的占比更重要。表1表明，所取因素與同型產(chǎn)乙酸反應VFAs產(chǎn)量之間的相關性是真實存在的。

2）BP神經(jīng)網(wǎng)絡的應用。如圖7所示，網(wǎng)絡模型訓練的均方誤差為0.7278，模型的收斂情況較好。從圖7B可以看出，模型訓練輸出值與實際值呈線性相關，相關系數(shù)為0.93924，擬合效果較好，得出的相關方程為Y=0.85T+0.015（T與Y分別為歸一化后的實際值和預測值），與目標直線Y=T相近，表明該模型在所設定條件下的訓練效果較好。

圖8顯示的是本模型輸出的預測值與實際值的偏差情況，圖8中指標值為試驗中產(chǎn)酸量與模型預測產(chǎn)酸量，期望值為實際試驗值，可以看出擬合精度良好，R2=0.966。綜上所述，本研究所建立的同型產(chǎn)乙酸反應預測VFAs產(chǎn)量的BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型預測性能較好，具備一定的可信度，可以在后續(xù)試驗中用來進行不同H2/CO2體積比和pH條件下同型產(chǎn)乙酸反應VFAs產(chǎn)量的預測。

3 討論

目前，國內(nèi)外對于同型產(chǎn)乙酸的研究已經(jīng)具有一定規(guī)模，但是鮮見多碳源混菌的同型產(chǎn)乙酸的研究。本研究利用合成氣的部分成分作為碳源，對同型產(chǎn)乙酸菌利用其在不同pH條件下發(fā)生同型產(chǎn)乙酸反應進行了產(chǎn)物分布分析與調(diào)控手段優(yōu)化，并采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡構建同型產(chǎn)乙酸的預測模型，從而對未來工業(yè)上采用合成氣為碳源進行同型產(chǎn)乙酸反應提供了產(chǎn)量的預測與數(shù)據(jù)基礎。

研究結果表明：反應過程的pH值和碳源中的H2/CO2比例都會對同型產(chǎn)乙酸反應的VFAs產(chǎn)量產(chǎn)生影響。當H2/CO2體積比為3∶1或4∶1時，同型產(chǎn)乙酸菌的自養(yǎng)反應較為明顯，CO2利用率、VFAs合成率都較高，VFAs與CO2占比表現(xiàn)出一定的相關性，說明利用同型產(chǎn)乙酸菌進行CO2的固定和高值化利用是可行的。當發(fā)酵液中葡萄糖和H2/CO2混合氣體2種碳源共存的情況下，菌種首先會大量利用葡萄糖而后才會利用H2/CO2氣體碳源，出現(xiàn)明顯的先后順序，說明葡萄糖的存在會在一定程度上阻礙同型產(chǎn)乙酸菌對H2/CO2的利用。VFAs產(chǎn)量與pH呈現(xiàn)弱正相關性，而與H2/CO2比例呈現(xiàn)負相關趨勢。利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡可以較好地對同型產(chǎn)乙酸反應產(chǎn)酸進行預測，擬合性良好，基本可以滿足試驗的預測要求。