1株沼澤綠蛙源蛙病毒的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

關(guān)鍵詞沼澤綠蛙；蛙病毒；FV3；蛙病毒主要衣殼蛋白基因；病理損傷

沼澤綠蛙（Ranagrylio），又名美國青蛙，屬兩棲綱、無尾目、蛙科，原產(chǎn)于北美洲，1987年引進(jìn)我國，由于其生長速度快、易飼養(yǎng)管理等優(yōu)點(diǎn)迅速推廣到全國范圍［1］。沼澤綠蛙營養(yǎng)豐富，其肉質(zhì)具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇的特點(diǎn)，已成為我國淡水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)動物之一［2］。2021年中國淡水蛙類養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)17萬t，較2020年增長26%［3］，隨著蛙類養(yǎng)殖規(guī)模的快速發(fā)展與養(yǎng)殖密度的加大，疾病逐漸成為制約蛙類養(yǎng)殖的重要因素之一，不斷有蛙病毒（ranavirus）［4-6］、米爾伊麗莎白菌（Elizabethkingiameningoseptica）［7］、嗜水氣單胞菌（Aeromonashy?drophila）［5］、熒光假單胞菌（Pseudomonasbaderia）［8］與多種寄生蟲［9］感染致病的報道，其中蛙病毒感染常常造成嚴(yán)重危害。

蛙病毒屬于虹彩病毒科，是一類大型雙鏈DNA病毒，主要危害魚類、兩棲動物和爬行動物。自1966年從北方豹蛙（Lithobatespipiens）中分離出第1株蛙病毒FV3以來［10］，其宿主范圍逐漸擴(kuò)大，到目前為止已知蛙病毒可感染53個科的175種變溫脊椎動物［4］?；谕懿《?6個核心基因的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)蛙病毒屬分為FV3樣病毒、CMTV樣病毒、ATV樣病毒和SGIV樣病毒4個類群。不同類群的病毒感染宿主范圍有所不同，SGIV樣病毒主要感染魚類，CMTV樣病毒偏好感染兩棲類，ATV樣病毒既感染兩棲類也感染魚類，F(xiàn)V3樣病毒則對兩棲類、魚類、爬行類3類動物均可感染［4］。但最近的研究也發(fā)現(xiàn)蛙病毒屬應(yīng)還有不同于上述4個類群基因特征的新類群［11］。四川是蛙類養(yǎng)殖與消費(fèi)大省，盡管目前已有蛙病毒感染黑斑蛙致病的報道［6］，但對沼澤綠蛙尚無確切的危害證據(jù)，為此，本研究對2021年8月四川某養(yǎng)殖場的沼澤綠蛙以體表潰瘍、出血及高死亡率為特征的疑似蛙病毒感染的病例進(jìn)行病理學(xué)檢查和病原分離，并結(jié)合電鏡觀察、PCR檢測和系統(tǒng)發(fā)育分析對分離病原進(jìn)行鑒定，以期明確其病因。

1 材料與方法

1.1 病料與主要試劑

患病沼澤綠蛙由四川德陽某養(yǎng)殖場送檢，體質(zhì)量150～250g。M199和胎牛血清（FBS）購自Hy?Clone公司，DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司，Mix-reactionbuffer、DNAMarker等購自寶生物工程（大連）有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 患病蛙病癥及細(xì)菌學(xué)檢查

仔細(xì)檢查病蛙的外部情況后，無菌環(huán)境下進(jìn)行剖檢并拍照記錄。將腹水、肝、脾、腎組織劃線接種BHI瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24～48h，觀察細(xì)菌生長情況。

1.3 組織病理學(xué)檢查

將病蛙的肌肉、肝、脾、腎、肺與腸等組織置于4%的福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eoslin，H.E）染色，中性樹膠封片后光學(xué)顯微鏡下觀察其主要病變并拍照。

1.4 病毒分離和滴度測定

參考牟維豪等［6］的方法，取病蛙肝、脾、腎組織勻漿后，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，取1mL勻漿接種鯉魚上皮瘤（epitheliomapapulosumcyprini，EPC）細(xì)胞，25℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察直至出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（cy?topathiceffect，CPE）。同時設(shè)置正常細(xì)胞為對照組。待出現(xiàn)80%CPE時，-80℃和4℃反復(fù)凍融3次，8000r/min離心30min取上清即為病毒液，-80℃保存?zhèn)溆?。采用Reed-Muench法計(jì)算病毒半數(shù)感染量（TCID50）。

1.5 透射電鏡觀察

參照張麗娟等［12］的方法，用細(xì)胞刮刀收集接種病毒后70%細(xì)胞出現(xiàn)CPE的EPC細(xì)胞，10000r/min離心10min棄上清，3%戊二醛固定后，按常規(guī)方法經(jīng)脫水、包埋后切片，進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.6 蛙病毒MCP基因的特異性PCR檢測

取病蛙的組織磨樣液、收取的病毒液按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA作為模板。參考Mao等［13］合成針對蛙病毒主要衣殼蛋白（majornucleo?capsidprotein，MCP）基因高度保守片段的特異性引物（F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；R：5′-GTCTCTGGAGAAGAA-3′），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段為500bp。PCR反應(yīng)體系（25μL）為：12.5μLTaq聚合酶，8.5μLddH2O，1μL上游引物，1μL下游引物，2μL模板DNA。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，54℃退火15s，72℃延伸15s，共30個循環(huán)；最后，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 MCP基因開放閱讀框全長的克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Huang等［14］設(shè)計(jì)的擴(kuò)增蛙病毒MCP基因ORF區(qū)全長序列引物（F：5′-ACAGTCACCGTG?TATCTTA-3′，R：5′-GGAAAAGACTTTGC?GCTGAA-3′），預(yù)期擴(kuò)增片段為1500bp。提取的病毒液DNA為模板，PCR反應(yīng)體系同本文“1.6”。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，54℃退火15s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；最后，72℃延伸5min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將符合預(yù)期片段1500bp大小的PCR產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果上傳至GenBank，并下載NCBI中其他虹彩病毒MCP基因序列，使用Mega7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病蛙病癥與細(xì)菌學(xué)檢查

病蛙表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、行為遲緩，眼球突起，角膜渾濁，下頜、腹部等體表分布出血點(diǎn)，頭部、腿部皮膚出現(xiàn)嚴(yán)重潰瘍（圖1A、B），四肢腫脹。剖檢見腹腔內(nèi)紅色積液（圖1C），肝、脾、腎腫大（圖1D、E），肺與胃腸充血。患病蛙的腹水、肝、脾、腎劃線接種BHI平板，28℃培養(yǎng)48h后未觀察到細(xì)菌生長。

2.2 組織病理學(xué)檢查

組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)患病蛙肌肉、肝臟、脾臟、腎臟等組織均發(fā)生明顯變性、壞死與炎癥反應(yīng)（圖2）。肌肉纖維變性腫脹，部分肌纖維肌漿凝固或溶解，大量淋巴細(xì)胞浸潤；肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹、壞死，并伴有炎性細(xì)胞浸潤（圖2B）；脾淋巴細(xì)胞顯著減少（圖2D）；腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞與系膜細(xì)胞壞死，腎小球萎縮甚至消失，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死、管內(nèi)有大量滲出物，腎間質(zhì)出血、炎性細(xì)胞浸潤，甚至發(fā)生灶性壞死（圖2F）；腸上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，固有膜內(nèi)多量淋巴細(xì)胞浸潤（圖2H）；肺囊上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，固有膜與肌層有大量以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤（圖2J）。同時在肝、脾、腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)均發(fā)現(xiàn)嗜堿性胞漿包涵體（圖2B、D）。

2.3 病毒分離與滴度測定結(jié)果

25℃培養(yǎng)EPC細(xì)胞，對照組細(xì)胞正常生長（圖3A），病蛙組織研磨液接種EPC細(xì)胞，25℃培養(yǎng)4d后部分細(xì)胞變圓皺縮，開始脫落；7d后接毒細(xì)胞大量死亡脫落，呈破魚網(wǎng)狀（圖3B）。收毒后再次接種EPC細(xì)胞，25℃培養(yǎng)3d后出現(xiàn)相同的CPE。將病毒液10-1～10-11稀釋后加入96孔板，培養(yǎng)7d。采用Reed-Muech法計(jì)算其病毒滴度為104.12TCID50/0.1mL。

2.4 電鏡觀察

將表現(xiàn)出典型CPE的EPC細(xì)胞制備超薄切片進(jìn)行透射電鏡觀察?？梢姶罅刻幱诓煌瑫r期、對角線直徑為（165±8）nm的病毒顆粒。胞漿內(nèi)大量成熟的病毒粒子聚集呈晶格狀排列（圖4A）或游離分布（圖4B），部分病毒粒子通過出芽的方式從細(xì)胞膜釋放并獲得外膜（圖4B），蛙病毒感染EPC細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞壞死，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚（圖4C），細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生濃縮、核邊移（圖4D）。上述觀察結(jié)果與蛙病毒粒子特征一致，推測其是蛙病毒屬成員。

2.5 蛙病毒MCP基因的特異性PCR檢測結(jié)果

針對病蛙的組織勻漿與收取的病毒液基于蛙病毒MCP基因的特異性PCR檢測結(jié)果顯示患病蛙的組織勻漿、收取的病毒液均擴(kuò)增出約500bp預(yù)期大小片段（圖5A），表明本分離株為虹彩病毒科蛙病毒屬成員。

2.6 MCP基因的PCR擴(kuò)增測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增出預(yù)期1500bp大小的片段（圖5B），測序后上傳GenBank（登錄號：OQ632452）。該序列與GenBank中虹彩病毒科、蛙病毒屬的蛙虹彩病毒（Ranagrylioiridovirus，RGV，JQ654586）、中華鱉虹彩病毒（soft-shelledturtleiridovirus，SSTV，EU627010）等的MCP基因相似性高達(dá)99%。在采用Mega7.0基于MCP基因全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，分離株TSL210813與FV3類群的中華鱉虹彩病毒（SSTV，DQ335253、EU627010）、蛙虹彩病毒（RGV，JQ654586）、黑斑側(cè)褶蛙虹彩病毒（Ranani?gromaculataranavirus，RNRV，MF359927）的親緣關(guān)系較為接近，表明分離株TSL210813為蛙病毒屬FV3病毒類群（圖6）。

3 討論

蛙病毒病作為世界動物衛(wèi)生組織（worldorgani?sationforanimalhealth，OIE）法定報告疾病，是變溫脊椎動物中具有重要經(jīng)濟(jì)和生態(tài)意義的主要疫病之一［15］，其對兩棲類種群的危害尤其嚴(yán)重。報道兩棲類蛙病毒被懷疑是造成105種兩棲動物面臨物種滅絕的懷疑對象［16］，同時也是養(yǎng)殖蛙類健康的重要威脅［4］。在我國，自1996年張奇亞等［17］從患有傳染性潰瘍綜合征的沼澤綠蛙中分離出沼澤綠蛙病毒（Ra?nagryliovirus，RGV）以來，相繼有牛蛙（Ranacates?bianaShaw）［12］、黑斑蛙（Rananigromaculata）［6］等多種養(yǎng)殖蛙感染蛙病毒的報道。在早期報道中，蛙病毒暴發(fā)常見于蝌蚪和變態(tài)的幼蛙，在幾天內(nèi)可造成90%的死亡率［18］，成年蛙通過CD8T細(xì)胞和抗蛙病毒抗體等介導(dǎo)的先天性免疫和適應(yīng)性免疫在2～3周內(nèi)清除病毒而不發(fā)病［19］。近年來成年蛙感染蛙病毒發(fā)病死亡的報道增多，程曉云等［20］2016年從青年棘胸蛙中分離到蛙病毒，病蛙四肢腫脹或潰爛，腹部有發(fā)紅充血點(diǎn)，人工感染試驗(yàn)死亡率達(dá)80%，出現(xiàn)與自然患病個體相似的病癥表現(xiàn)。張麗娟等［12］從養(yǎng)殖場的成年牛蛙中分離出蛙病毒RGV-F，將RGV-F人工感染成年牛蛙4d后死亡率為94%，展現(xiàn)出較強(qiáng)致病性。結(jié)合本研究從養(yǎng)殖場成年發(fā)病蛙中分離得到蛙病毒株TSL210813，提示蛙病毒可能不再局限于危害某一特定生長時期的蛙。Hoverman等［21］發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖場中分離出的蛙病毒毒力明顯高于野生株，由此推測蛙病毒可能為適應(yīng)在養(yǎng)殖環(huán)境下宿主高密度、病原競爭與宿主的免疫而進(jìn)化出更強(qiáng)的毒力，從而導(dǎo)致其危害蛙的生長時期范圍擴(kuò)大。

各類兩棲動物感染蛙病毒最為一致的病理學(xué)變化是表皮潰瘍、真皮和多臟器出血、以腎小球和腎小管為特征的多組織壞死［18，22］。本研究中病蛙表現(xiàn)出頭部和腿部皮膚潰爛、體表點(diǎn)狀出血、四肢腫脹的特征，病理組織學(xué)觀察結(jié)果包括腸上皮細(xì)胞的壞死脫落，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，以及局限性壞死灶，一些病變細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嗜堿性包涵體，與近年報道蛙病毒感染成年蛙的病變特征基本一致［12，20，23］，因此，患病蛙體表潰瘍、全身性出血與病變細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嗜堿性包涵體等病變特征可作為蛙病毒感染蛙類的重要病理學(xué)診斷依據(jù)。蛙病毒不僅能夠通過水體、污染物、接觸感染動物在不同變溫脊椎動物之間傳播，而且能在一個地點(diǎn)同時感染多個物種［23］。Teacher等［24］報道蛙病毒病反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致林蛙種群豐富度下降81%。我國已有四川［6］、福建［12］、浙江［20］等多地大規(guī)模暴發(fā)蛙病毒病，且有黑龍江野外林蛙感染蛙病毒流行率達(dá)42%的報道［25］。鑒于蛙病毒在我國易感宿主的種類眾多且分布廣泛，其傳播可能會對水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種及野生珍稀物種的保護(hù)造成嚴(yán)重影響，因此需要對暴發(fā)蛙病毒的養(yǎng)殖場進(jìn)行嚴(yán)格消毒，加強(qiáng)防范養(yǎng)殖蛙外逃，同時加強(qiáng)對野生兩棲動物的蛙病毒監(jiān)控，及時準(zhǔn)確地了解蛙病毒在我國的流行情況。

本研究中，我們首先通過檢測MCP基因中對蛙病毒屬高度保守的特異性片段，確認(rèn)分離株為蛙病毒屬病毒?；贛CP基因全序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)分離的蛙病毒株TSL210813為FV3類群，但該病毒在進(jìn)化樹中未能完全與經(jīng)典的FV3病毒構(gòu)成的分支聚為一簇，與同樣從沼澤綠蛙中分離出的病毒株RGV-JQ654586距離較遠(yuǎn)，而更靠近CMTV樣蛙病毒分支。依靠獨(dú)特且高度保守的MCP基因?qū)π路蛛x的蛙病毒株進(jìn)行分類學(xué)上的歸類是常用且便捷的方法，但這一蛋白高度保守的性質(zhì)可能會掩蓋不同病毒分離株之間的差異。2017年Claytor等［26］發(fā)現(xiàn)首株CMTV樣病毒與FV3樣病毒的重組株，且毒力是野生FV3樣病毒株的2倍。2019年加拿大分離到1株FV3蛙病毒，全基因組分析發(fā)現(xiàn)其與CMTV樣病毒株發(fā)生同源重組，屬于FV3新分支［27］。本毒株是否發(fā)生類似的重組現(xiàn)象而產(chǎn)生新的FV3分支，需要后續(xù)基于病毒全基因組進(jìn)一步分析。病毒株重組后通過獲得更多毒力基因、加快病毒復(fù)制或者進(jìn)行免疫逃避等方式，表現(xiàn)出比野生株更強(qiáng)的毒力，這種病毒進(jìn)化帶來的致病性變化是否與蛙病毒感染宿主范圍與感染同一物種不同生長時期的擴(kuò)展有密切關(guān)系值得進(jìn)一步探索。