柑橘采后分選中咪鮮胺和抑霉唑濃度檢測

關鍵詞柑橘采后病害；咪鮮胺；抑霉唑；高效液相色譜法

柑橘是世界第一大水果，也是全球重要的經(jīng)濟作物。中國是世界上最大的柑橘生產(chǎn)國，柑橘種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，2022年柑橘栽培面積約333萬hm2，產(chǎn)量約6000萬t，是中國最具競爭力的農(nóng)產(chǎn)品之一。由于生理性失調(diào)和病原菌侵染，柑橘采后病害頻發(fā)，對柑橘產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。為了降低柑橘腐爛率、提高商品價值，在柑橘采后分選過程中常在柑橘采后分選線上使用殺菌劑浸果。咪鮮胺（N-丙基-N-［2-（2，4，6-三氯苯氧基）乙基］-咪唑-1-甲酰胺，Prochloraz），是一種廣譜、高效和低毒的新型咪唑類殺菌劑；抑霉唑（（±）烯丙基1-（2，4-二氯苯基）-2-咪唑-1-基乙基醚，Imazalil），則是一種內(nèi)吸性的廣譜殺菌劑。咪鮮胺和抑霉唑通過抑制麥角甾醇的生物合成，破壞病原真菌細胞膜功能。在生產(chǎn)過程中常單獨或混合使用，以防治柑橘采后病害［1-3］。

目前對咪鮮胺和抑霉唑的檢測主要集中于果實中的殘留，采用方法包括氣相色譜法（GC）［4］、高效液相色譜法（HPLC）［5-6］、超高效液相色譜法（UPLC）［6］、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用等［7-8］，近年來亦建立了酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）［9-10］、膠體金免疫層析（GICT）［11］和表面增強拉曼光譜技術(shù)（SERS）［12-13］和毛細管電泳法檢測技術(shù)（CE）［14］等。然而，上述方法通常用來檢測果蔬、食品中微量的咪鮮胺和抑霉唑殘留，其提取方法復雜，且涉及大量有機溶劑的使用。在柑橘采后處理中，柑橘果實經(jīng)過水洗、殺菌劑保鮮、烘干、分級、包裝等環(huán)節(jié)，實現(xiàn)了從農(nóng)產(chǎn)品到商品的轉(zhuǎn)換。在采后分選線中，隨著對柑橘果實的處理，殺菌劑藥劑池中的有效成分濃度會逐漸下降，因此需要及時補充藥劑，以確保其濃度維持在有效范圍內(nèi)。然而，由于缺乏藥劑池中殺菌劑濃度變化動態(tài)規(guī)律的研究，導致采后生產(chǎn)中殺菌劑的使用缺乏理論指導，致使殺菌劑使用效率低或病害防治效果不理想。本研究旨在建立一種基于HPLC的同時檢測較高質(zhì)量濃度條件下咪鮮胺和抑霉唑的方法，揭示咪鮮胺和抑霉唑在采后處理過程中質(zhì)量濃度變化規(guī)律，為規(guī)范柑橘采后殺菌劑的使用方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

咪鮮胺原藥：湖北速普爾化工有限公司，純度98%，甲醇溶解；抑霉唑原藥：湖北速普爾化工有限公司，純度97%，甲醇溶解；正邦百使特水乳劑：咪鮮胺有效成分含量45%，推薦使用質(zhì)量濃度300～450μg/mL；禾益待玉水乳劑：抑霉唑有效成分含量20%，推薦使用質(zhì)量濃度250～500μg/mL；甲醇和乙腈：色譜級，購自月旭科技股份有限公司；溫州蜜柑（CitrusunshiuMarc.）：2023年10月收集自宜昌市夷陵區(qū)某采后處理廠。

1.2 試驗儀器

高效液相色譜儀U3000（美國賽默飛世爾科技公司）、UltimatePFP（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱（月旭科技股份有限公司）、分析天平PR1602ZH/E（美國奧豪斯儀器有限公司）、超聲波清洗儀DTC-15J（湖北鼎泰生化科技設備制造有限公司）和高速離心機（Beckman，USA）。

1.3 HPLC檢測咪鮮胺和抑霉唑

1）咪鮮胺和抑霉唑標準曲線的繪制。使用甲醇溶解咪鮮胺和抑霉唑原藥，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后用甲醇稀釋至不同質(zhì)量濃度（5.0、10.0、20.0、50.0、100.0和300.0μg/mL），采用高效液相色譜法進行檢測，以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制咪鮮胺和抑霉唑的標準曲線。

2）咪鮮胺和抑霉唑檢出限的測定。使用甲醇溶解咪鮮胺和抑霉唑原藥，設置咪鮮胺質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0μg/mL，設置抑霉唑質(zhì)量濃度分別為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4和1.5μg/mL。采用高效液相色譜法進行檢測，3倍噪聲峰高即為咪鮮胺和抑霉唑的檢出限。

3）儀器精密度的測定。為了評估高效液相色譜儀的可靠性，選擇50μg/mL的咪鮮胺溶液和50μg/mL的抑霉唑溶液，在12h內(nèi)每隔2h采用高效液相色譜法進行檢測，共檢測6次，分別記錄峰面積。對檢測的6次峰面積計算平均值、標準差和相對標準偏差。

4）咪鮮胺和抑霉唑添加回收率的測定。為了檢測抽提方法導致的樣品損失，評估測量過程中農(nóng)藥商品制劑中各種助劑對抽提效果的干擾，進行回收率測定。使用蒸餾水配制正邦百使特水乳劑和禾益待玉水乳劑，使咪鮮胺和抑霉唑的有效質(zhì)量濃度分別為450.0、300.0μg/mL，記為溶液A和B；使用甲醇溶解咪鮮胺和抑霉唑原藥，使其質(zhì)量濃度為5000.0μg/mL，記為溶液C和D；分別取400.0μL、800.0μL和1.6mL的溶液C與溶液A（D與B）混合定容至10mL，得到混合溶液。分別吸取2mL混合溶液，甲醇定容至10mL，使混合液中的咪鮮胺終質(zhì)量濃度分別為130.0、170.0和250.0μg/mL，抑霉唑的終質(zhì)量濃度分別為100.0、140.0和220.0μg/mL，每組3次重復。渦旋震蕩1min后超聲波處理10min，8000r/min離心5min，取1mL上清液后0.22μm微孔濾膜過濾。采用高效液相色譜法進行檢測，根據(jù)實際加標峰面積與理論加標峰面積之比計算添加回收率。

1.4 咪鮮胺和抑霉唑商品制劑的穩(wěn)定性

為了明確咪鮮胺和抑霉唑商品制劑在水溶液中的穩(wěn)定性，將正邦百使特水乳劑和禾益待玉水乳劑溶于水配制為混合液。將混配的商品制劑分別在室溫（20±1）℃和?20℃條件下儲存。不同時間點分別取2mL，用甲醇定容至10mL后旋渦震蕩1min，超聲波處理10min，離心，取1mL上清液過0.22μm濾膜，采用高效液相色譜儀進行檢測，每次檢測3個重復。

1.5 采后處理過程中咪鮮胺和抑霉唑質(zhì)量濃度的檢測

2023年10月24日07：00宜昌市夷陵區(qū)某采后處理廠配制保鮮劑。保鮮劑選用300mL龍燈富而樂（咪鮮胺有效成分含量450g/L）和300mL安道麥萬利得（抑霉唑有效成分含量500g/L），混合溶于300kg水中后充分攪拌溶解。07：30開始對直徑60mm的溫州蜜柑進行保鮮處理。溫州蜜柑首先在清水池清洗后進入藥劑池，經(jīng)烘干和分級后進行包裝。

自藥劑池取100mL配制的尚未浸果的藥液作為未浸果的藥液對照；自分選線藥劑池中，每2h取5mL藥液作為浸果的樣本；每一時間點取樣3次，干冰保存。全程記錄處理的溫州蜜柑量。

取2mL藥液，甲醇定容至10mL后，渦旋震蕩1min，超聲10min，8000r/min離心5min，取1mL上清液過0.22μm微孔濾膜，采用高效液相色譜儀對咪鮮胺和抑霉唑的質(zhì)量濃度進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測咪鮮胺和抑霉唑的條件

結(jié)合保留時間、色譜峰圖、檢測靈敏度等因素，確定使用乙腈和水作為流動相進行梯度洗脫，洗脫條件如表1所示：使用UltimatePFP色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；以純水（A）和乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫，0～10min乙腈的比例從10%增加到90%，10～17min乙腈的比例維持在90%，17min以后乙腈的比例恢復到10%，進樣量10μL，在流速1mL/min，柱溫30℃，205nm波長下對咪鮮胺和抑霉唑進行檢測。咪鮮胺原藥、抑霉唑原藥和2種原藥混標的檢測結(jié)果如圖1所示，咪鮮胺的保留時間是14.880min，抑霉唑的保留時間是11.697min，咪鮮胺和抑霉唑在此檢測條件下峰形良好且互不干擾。

2.2 咪鮮胺和抑霉唑標準曲線的建立

使用建立的檢測方法繪制咪鮮胺和抑霉唑的標準曲線。咪鮮胺的標準曲線y=0.7841x+2.2483，R2=0.9997，抑霉唑的標準曲線y=1.6618x?3.4097，R2=0.9996，在5.0～300.0μg/mL范圍內(nèi)樣品峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關系。

2.3 檢測方法的精密度、靈敏度和準確度

按照信噪比S/N=3標準，咪鮮胺和抑霉唑的最低檢測限分別為0.80、1.20μg/mL。儀器精密度試驗結(jié)果顯示，6次檢測咪鮮胺峰面積平均值為61.9120、標準偏差為0.000543139、相對標準偏差為0.0009%，6次檢測抑霉唑峰面積平均值為32.63257、標準偏差為0.000196638、相對標準偏差為0.0006%，咪鮮胺和抑霉唑檢測相對標準偏差均小于2%（表2）。在咪鮮胺和抑霉唑商品制劑中添加甲醇溶解的原藥，咪鮮胺的添加回收率為96.47%～100.49%，相對標準偏差為1.23%～3.29%（表3）；抑霉唑的添加回收率為94.78%～100.81%，相對標準偏差為4.20%～7.80%（表3）。以上結(jié)果表明，該檢測技術(shù)靈敏、準確，對咪鮮胺和抑霉唑質(zhì)量濃度的檢測可靠性高。

2.4 室溫20℃和低溫?20℃條件下咪鮮胺和抑霉唑商品制劑的穩(wěn)定性

正邦百使特水乳劑溶于水后，其咪鮮胺質(zhì)量濃度在室溫20℃和低溫?20℃條件下96h內(nèi)基本保持穩(wěn)定；禾益待玉水乳劑溶于水后，其抑霉唑質(zhì)量濃度下降幅度較大，24h時降低68.3%，48h降低80.0%，但在?20℃條件下保持穩(wěn)定（圖2、圖3）。

柑橘采后處理廠在使用咪鮮胺和抑霉唑?qū)Ω涕龠M行保鮮處理時，藥劑池中殺菌劑的使用時間通常不會超過24h，基于此，本研究進一步分析了24h內(nèi)室溫20℃和低溫?20℃條件下咪鮮胺和抑霉唑的質(zhì)量濃度動態(tài)變化，24h內(nèi)，正邦百使特水乳劑溶于水后，其咪鮮胺質(zhì)量濃度在室溫20℃和低溫?20℃條件下基本保持穩(wěn)定；禾益待玉水乳劑溶于水后，其抑霉唑質(zhì)量濃度在室溫20℃下8h時降低57.00%，12h降低69.02%，但在?20℃條件下保持穩(wěn)定（圖2、圖3）。

2.5 處理廠藥劑池中咪鮮胺和抑霉唑質(zhì)量濃度的變化

該處理廠藥劑池中藥劑總量為300kg，其中咪鮮胺起始質(zhì)量濃度為556.0μg/mL，抑霉唑起始質(zhì)量濃度為625.4μg/mL，處理的溫州蜜柑數(shù)量、藥劑池中咪鮮胺及抑霉唑的質(zhì)量濃度見表4。

本研究中，采后處理廠的操作過程中，咪鮮胺始終保持在較高水平，處理6h后咪鮮胺的質(zhì)量濃度為456.9μg/mL，依舊高于咪鮮胺推薦使用質(zhì)量濃度的下限250μg/mL。6h內(nèi)共處理溫州蜜柑15t，咪鮮胺的質(zhì)量濃度降低98.6μg/mL。其中，0～2h期間處理1t溫州蜜柑，咪鮮胺質(zhì)量濃度平均降低7.1μg/mL；2～4h期間處理1t溫州蜜柑，咪鮮胺質(zhì)量濃度平均降低6.6μg/mL；在4～6h期間處理1t溫州蜜柑，咪鮮胺質(zhì)量濃度平均下降5.2μg/mL（表4）。由于咪鮮胺在水中穩(wěn)定，咪鮮胺質(zhì)量濃度與處理的溫州蜜柑量相關。因此，在咪鮮胺起始質(zhì)量濃度556.0μg/mL條件下，至少能夠?qū)崿F(xiàn)46t溫州蜜柑的有效處理。

本研究中，采后處理廠的操作過程中，抑霉唑的質(zhì)量濃度變化較為復雜。處理6h后抑霉唑的質(zhì)量濃度為226.5μg/mL，低于推薦使用質(zhì)量濃度的下限250μg/mL。6h內(nèi)共處理溫州蜜柑15t，抑霉唑的質(zhì)量濃度降低398.9μg/mL。在處理柑橘量和處理時間的雙重作用下，0～2h期間處理1t溫州蜜柑，抑霉唑質(zhì)量濃度平均降低23.9μg/mL；2～4h期間處理1t溫州蜜柑，抑霉唑質(zhì)量濃度平均降低26.0μg/mL；4～6h期間處理1t溫州蜜柑，抑霉唑質(zhì)量濃度平均降低33.8μg/mL（表4）。由于抑霉唑在水中易降解，抑霉唑的質(zhì)量濃度與處理時間和處理的溫州蜜柑量相關。

3 討論

本研究建立了一種基于HPLC，可同時檢測咪鮮胺和抑霉唑2種藥劑的方法。采用乙腈和水作為流動相進行梯度洗脫，用UltimatePFP（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，在柱溫30℃、流速1mL/min、進樣量10μL、波長205nm條件下對咪鮮胺和抑霉唑進行檢測，靈敏度和準確度高，2種物質(zhì)峰形良好互不影響。使用建立的檢測技術(shù)研究了柑橘采后分選線上咪鮮胺和抑霉唑的質(zhì)量濃度變化動態(tài)，發(fā)現(xiàn)咪鮮胺穩(wěn)定，質(zhì)量濃度變化與處理的柑橘量相關，抑霉唑穩(wěn)定性差，質(zhì)量濃度變化與處理時間和處理的柑橘量相關。

果蔬、食品中微量咪鮮胺和抑霉唑的檢測方法已有較多報道。謝莉等［6］分別采用超高效液相色譜法（UPLC）和氣相色譜法（GC），對柑橘貯藏期果皮、果肉和全果中咪鮮胺和抑霉唑的殘留進行了動態(tài)檢測分析。UPLC系統(tǒng)及其配套色譜柱相對購置成本較高，且色譜柱易受污染。GC法檢測抑霉唑時，其分離能力受到一定限制且易受標準氣體的影響。姜軍俠等［5］采用C18色譜柱，以0.012mol/L庚烷磺酸鈉水溶液（pH2.5）與甲醇作為流動相進行梯度洗脫，在流速1.5mL/L、柱溫35℃、波長220nm條件下進行檢測，實現(xiàn)了咪鮮胺和抑霉唑的同時檢測。該檢測方法中甲醇為有機相，在水相中添加了離子對試劑和酸性物質(zhì)，然而，離子對試劑和酸性物質(zhì)易對色譜柱和液相色譜儀產(chǎn)生影響，可能增加分析成本。本研究建立的檢測方法可同時檢測咪鮮胺和抑霉唑，具有簡單經(jīng)濟、靈敏度高、分離能力強的特點。在有機相的選擇上，本研究采用了乙腈作為溶劑，以最大程度地保護色譜柱免受損害。

應用建立的檢測技術(shù)，本研究對采后處理廠分選線上咪鮮胺和抑霉唑的質(zhì)量濃度隨處理時間和處理溫州蜜柑量的動態(tài)變化進行了深入探討。研究結(jié)果顯示，咪鮮胺穩(wěn)定，質(zhì)量濃度變化與柑橘量相關，而抑霉唑在水中易降解，抑霉唑質(zhì)量濃度與處理時間和處理的柑橘量有關。300kg的藥液中，咪鮮胺起始質(zhì)量濃度為556μg/mL，至少可以處理溫州蜜柑46t；而抑霉唑起始質(zhì)量濃度為625μg/mL，工作6h處理15t柑橘的情況下，質(zhì)量濃度已低于推薦的質(zhì)量濃度下限，需要及時進行補充。馮丹等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在浙江衢州柑橘主產(chǎn)區(qū)，柑橘綠霉病菌對抑霉唑的抗藥性頻率高達77.1%［12］。因此，從經(jīng)濟的角度出發(fā)，咪鮮胺更適合于柑橘采后病害的防控。

本研究結(jié)果可為規(guī)范柑橘采后殺菌劑的使用提供科學指導，并為其他水果的采后保鮮提供參考依據(jù)。然而，在實際生產(chǎn)過程中，由于柑橘種類繁多、果面性質(zhì)和單果體積存在顯著差異，以及分選線藥劑池容積各不相同，導致采后殺菌劑使用的復雜性顯著增加。因此，需要更為細致的工作才能滿足生產(chǎn)的需求。此外，殺菌劑濃度的智能化或自動化動態(tài)監(jiān)測的實現(xiàn)，也將會顯著提升生產(chǎn)效率，并降低生產(chǎn)成本。