基于全基因組測序的多粘類芽孢桿菌NBmelon-1生防機(jī)制探究及驗證

關(guān)鍵詞多粘類芽孢桿菌；全基因組；次級代謝產(chǎn)物；抑菌作用

甜瓜（CucumismeloL.）是我國重要經(jīng)濟(jì)作物之一，具有多種營養(yǎng)成分和食用價值，廣受消費者的喜愛［1］。由于單一品種高密度重茬種植，導(dǎo)致連作障礙頻發(fā)，土傳病害加劇，其中甜瓜枯萎病是典型的土傳真菌病害。目前對甜瓜枯萎病的防治主要以化學(xué)防治為主，但易產(chǎn)生耐藥性和污染環(huán)境。生物防治作為綠色安全防治手段，是一種可持續(xù)且環(huán)境友好的替代方法［2］。

類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）細(xì)菌作為土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢種群，抗逆性強(qiáng)，具有良好的生防潛力和促生效果［3］。多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）為類芽孢桿菌屬的模式種，具有廣譜抗性和促生效果，且為非致病性細(xì)菌，是一類重要的根際有益菌。該菌通過固氮、溶磷、產(chǎn)鐵載體和分泌植物激素等方式促進(jìn)植物生長。Abdallah等［4］研究發(fā)現(xiàn)P.polymyxaSx3能通過固氮、溶磷并產(chǎn)生吲哚乙酸，促進(jìn)水稻的生長。此外，該菌通過位點競爭、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性和分泌拮抗物質(zhì)等方式抑菌［5］。Tim?musk等［6］研究表明P.polymyxa可定殖于擬南芥的根部形成生物保護(hù)膜，抑制病原菌的入侵。Kim等［7］研究發(fā)現(xiàn)P.polymyxaAPEC136能夠促進(jìn)蘋果淀粉酶和蛋白酶產(chǎn)生，有效抑制蘋果采后炭疽病和白腐病的發(fā)生。除此之外，多粘類芽孢桿菌可產(chǎn)生多肽類抗生素、抑菌蛋白和其他小分子抑菌物質(zhì)，如核苷類物質(zhì)、吡嗪類物質(zhì)等［8-10］，其中多肽類抗生素是其發(fā)揮抑菌作用的主要物質(zhì)。Kajimura等［11］研究發(fā)現(xiàn)P.polymyxaKT-8產(chǎn)生的多肽類物質(zhì)殺鐮孢菌素A、B、C、D具有明顯的體外抑菌活性。

目前，針對多粘類芽孢桿菌的研究主要集中于其生物學(xué)特性，以及其生防機(jī)制的探討［12］，然而，傳統(tǒng)方法很難全面挖掘出該菌所含有的生防相關(guān)基因。全基因組測序技術(shù)作為研究物種信息的有力手段，極大地促進(jìn)了細(xì)菌基因組的高效解析，能夠揭示潛在的功能及其作用機(jī)制。陳俊毅等［13］通過全基因組測序技術(shù)獲得P.polymyxaSC2中具有預(yù)測功能的分泌蛋白共89個。全基因組測序技術(shù)的發(fā)展有效地促進(jìn)了多粘類芽孢桿菌的研究。筆者所在課題組前期從甜瓜根部篩選出1株高效生防菌P.polymyxaNBmelon-1，通過三代（PacBio）測序技術(shù)，獲得該菌株完整的基因組序列，挖掘其促生和抑菌基因，預(yù)測次級代謝產(chǎn)物合成基因簇；通過酸沉淀法和硫酸銨沉淀法對抑菌物質(zhì)進(jìn)行粗提取，初步明確抑菌物質(zhì)成分；同時對該菌株促生和產(chǎn)酶潛力進(jìn)行測定，以期為后續(xù)深入挖掘其生防機(jī)制以及工業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：P.polymyxaNBmelon-1由浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院甜瓜課題組分離并保存［14］。甜瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporum）、黑點根腐病菌（Monosporascuscannonballus）、蔓枯病菌（Stagono?sporopsiscucurbitacearum）、根腐病菌（F.solani）由浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所保存。

供試培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、阿須貝固氮培養(yǎng)基［15］、有機(jī)磷培養(yǎng)基［15］、PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基［16］、CAS檢測培養(yǎng)基［16］、蛋白胨水液體培養(yǎng)基［17］、鉀細(xì)菌固體培養(yǎng)基［16］、R2A培養(yǎng)基［18］、纖維素剛果紅培養(yǎng)基［19］。

供試藥劑：鹽酸、甲醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。L-色氨酸、硫酸銨購自北京酷來博科技有限公司。Salkowski比色液購自福州飛凈生物科技有限公司。

1.2 全基因組測序

將P.polymyxaNBmelon-1接種于NB培養(yǎng)基，28℃、180r/min培養(yǎng)24h后8000r/min、離心5min收集菌體，送北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將編碼基因序列與不同功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，包括基因本體論（GO）、同源蛋白簇（COG）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）、碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（CAZy）、病原菌毒力因子數(shù)據(jù)庫（VFDB）。利用antiSMASHv7.0.0對次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測。

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)已知多粘類芽胞桿菌基因組中脂肽化合物合成及促生相關(guān)的基因設(shè)計引物（表1），以P.poly?myxaNBmelon-1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5μLPCR產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。

1.4 抑菌物質(zhì)粗提物制備及活性檢測

1）酸沉淀法［21］。取NBmelon-1無菌發(fā)酵液，用6mol/LHCl調(diào)pH至2.0，4℃下靜置12h后，4℃、12000r/min離心10min，將沉淀溶解于少量甲醇（濾膜滅菌）中，獲得脂肽粗提物，0.22μm微孔濾膜過濾后?20℃保存。

2）硫酸銨沉淀法［22］。取NBmelon-1無菌發(fā)酵液，緩慢加入硫酸銨直至飽和，4℃下靜置12h，4℃、12000r/min離心10min，用原無菌發(fā)酵液1/10體積的0.02mol/LTris-HCl（pH=6.8）溶解沉淀，獲得蛋白粗提物，0.22μm微孔濾膜過濾后?20℃保存。

3）抑菌試驗。將甜瓜枯萎病菌、黑點根腐病菌、蔓枯病菌、根腐病菌的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，將3個牛津杯平均放置于平板上，注入200μL粗提液。以無菌水、甲醇為對照，每個處理3次重復(fù)。28℃下培養(yǎng)3～5d，測定抑菌圈直徑。

1.5 促進(jìn)植物生長活性及產(chǎn)纖維素酶能力測定

1）溶磷能力。取5μL純化后的P.polymyxaNBmelon-1菌株懸液，分別接種至有機(jī)磷和無機(jī)磷培養(yǎng)基，于30℃下倒置培養(yǎng)3～5d，若形成透明圈，則表明其具備溶磷能力。測量透明圈直徑和菌落直徑，計算二者比值。

2）解鉀能力。取5μL純化菌株懸液接種于鉀細(xì)菌固體培養(yǎng)基，于28℃倒置培養(yǎng)3d，若觀察產(chǎn)生透明圈，則表明其具備解鉀能力。測量透明圈直徑和菌落直徑并計算比值。

3）鐵載體產(chǎn)生能力。取5μL純化菌株懸液接種于CAS檢測培養(yǎng)基，于30℃倒置培養(yǎng)5～7d。若菌落周圍產(chǎn)生橙黃色暈圈，則表明該菌具備產(chǎn)鐵載體能力。測量橙色鐵載體暈圈直徑和菌落直徑，計算二者比值。

4）固氮能力。取5μL純化菌株懸液接種于阿須貝固氮培養(yǎng)基，于30℃倒置培養(yǎng)3d。若能正常生長，則表明其具備固氮能力。

5）產(chǎn)NH3能力。將純化的菌株懸液接種于含有5mL蛋白胨水液體培養(yǎng)基的試管中，于36℃下培養(yǎng)24h。加入Kovacs試劑后，若上層呈現(xiàn)紅色，則為陽性反應(yīng)，表明其具備產(chǎn)NH3能力。

6）分泌吲哚乙酸（IAA）能力。將純化后菌株接種于100mL的R2A（含色氨酸）的培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min培養(yǎng)24h。取菌懸液50μL滴置白色陶瓷板上，同時加入50μL比色液。以比色液中加入50μL50mg/L的IAA和無菌水作為對照組。在室溫下避光放置30min后，觀察顏色變化。顏色變粉紅者為陽性，表示能夠分泌IAA。

7）產(chǎn)纖維素酶的能力。將5μL純化菌株懸液接種于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，于30℃倒置培養(yǎng)5～7d。若形成透明圈，則表明其具備產(chǎn)纖維素酶的能力。測量透明圈直徑和菌落直徑，計算兩者比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株NBmelon-1的基因組特征

P.polymyxaNBmelon-1基因組大小為5765142bp，GC含量為45.68%，共4984個蛋白編碼基因，編碼基因長度占基因組總長度的85.63%（圖1）；該基因組中含有106個tRNA、6個sRNA、14個5SrRNA、13個16SrRNA、14個23SrRNA、3個CRIS?PR-Cas；同時預(yù)測到233個重復(fù)序列（表2）。

1）COG功能注釋。P.polymyxaNBmelon-1基因組中共含有4071個編碼蛋白基因，注釋到4類COG功能，共劃分21個亞類，占所有編碼蛋白基因的81.68%（圖2），集中在主要功能預(yù)測（generalfunc?tionpredictiononly，14.32%）、碳水化合物轉(zhuǎn)運及代謝（carbohydratetransportandmetabolism，11.83%）、轉(zhuǎn)錄（transcription，11.49%）、氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝（aminoacidtransportandmetabolism，9.58%）和無機(jī)離子轉(zhuǎn)運與代謝（inorganiciontransportandmetabo?lism，6.60%）；還存在大量未知功能的基因322個，占編碼蛋白基因6.46%。

2）GO注釋。P.polymyxaNBmelon-1基因組中共有3483個編碼蛋白基因注釋到GO功能，占總編碼基因的68.88%（圖3）。與分子功能（molecularfunction）相關(guān)的基因數(shù)為2734個，主要參與ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、金屬離子結(jié)合等。參與生物過程（bi?ologicalprocess）的基因數(shù)為2543個，其中參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控（regulationoftranscription，1.80%）的基因數(shù)最多。細(xì)胞成分（cellularcomponent）相關(guān)的基因數(shù)為1638個，該本體下參與膜組分的基因數(shù)是所有GO功能注釋中數(shù)目最多的。此外，含有與誘導(dǎo)抗性相關(guān)的基因，如超氧化物歧化酶活性和過氧化物酶活性等；含有與病原體細(xì)胞壁水解的相關(guān)基因，如纖維素酶活性和葡聚糖酶活性等；還含有植物促生相關(guān)基因，如生長素合成等。以上結(jié)果表明，該菌具有抑菌、誘導(dǎo)植物抗性和促生的潛能。

3）KEGG注釋。P.polymyxaNBmelon-1基因組中共有2545個編碼蛋白基因注釋到KEGG途徑的6大類中，參與27條代謝通路，占總編碼基因的51.06%（圖4）。其中與代謝相關(guān)的基因數(shù)最多，主要富集在碳水化合物代謝（carbohydratemetabolism）和氨基酸代謝（aminoacidmetabolism）等12條代謝途徑中。KEGG富集分析表明，該菌株存在能夠合成萬古霉素（vancomycin）、鏈霉素（streptomycin）等抗生素生物合成有關(guān)的代謝通路，能代謝抗壞血酸、果糖、甘露糖、淀粉、蔗糖和脂肪酸等，說明P.poly?myxaNBmelon-1在抑菌和促生方面存在一定潛力。

4）碳水化合物活性酶。P.polymyxaNBmelon-1基因組中共有450個編碼蛋白基因歸屬于6類碳水化合物活性酶（CAZymes）（圖5），其中，189個基因編碼糖苷水解酶（glycosidehydrolases，GHs）、109個基因編碼糖苷轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferases，GTs）、70個基因編碼碳水化合物酯酶（carbohydrateesterases，CEs）、39個基因編碼輔助氧化還原酶（auxiliaryactiv?ities，AAs）、30個基因編碼碳水化合物結(jié)合組件（car?bohydrate-bindingmodules，CBMs）和13個基因編碼多糖裂解酶（polysaccharidelyases，PLs），其中，GH43、GH5、GH30等與纖維素和半纖維素降解有關(guān)［23］；GH13與淀粉的水解有關(guān)［24］；CE1、CE3和CE7與木聚糖降解有關(guān)［25］；CE4、GH18與肽聚糖的降解有關(guān)［25］；CBM50通常結(jié)合GHs降解幾丁質(zhì)或肽聚糖［26］，表明P.polymyxaNBmelon-1可能具備降解纖維素、淀粉、幾丁質(zhì)和肽聚糖等物質(zhì)的潛能。

5）毒力因子。P.polymyxaNBmelon-1基因組中共有232個毒力因子（virulentfactor，VF）被注釋，其中與免疫調(diào)節(jié)（immunemodulation）相關(guān)基因最多，為80個，其次是營養(yǎng)/代謝（nutritional/metabolicfactor）和生物膜（biofilm），分別為31和23個（表3）。菌株NBmelon-1中可能具有生防作用的毒力因子主要與黏附（pilR）、分泌系統(tǒng)（essC）和外毒素（hlyB、cylR2）有關(guān)，說明P.polymyxaNBmelon-1可能釋放毒力因子抑制病原菌侵染植株。

2.2 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇

通過antiSMASH預(yù)測菌株NBmelon-1含有5個次級代謝產(chǎn)物合成基因簇，且該菌編碼的5個次級代謝產(chǎn)物均由NRPS途徑合成（圖6）。Cluster2和Cluster5分別是具有抑菌活性的脂肽類化合物（tri?decaptinM）和多粘菌素（polymyxin）的合成基因簇，與已知菌株來源的相對應(yīng)的基因簇相似度均達(dá)100%。而Cluster1和Cluster4與具有抑菌活性的殺鐮孢菌素B（fusaricidinB）和十三肽菌素（tride?captin）的生物合成基因簇有一定的相似性，相似度分別為37%和40%。Cluster3與已知菌株BGC0001728的Peanilipoheptin合成基因簇有一定相似度，但僅為11%（表4）。以上結(jié)果表明，該菌株能夠產(chǎn)生具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物，具有較大的生防潛力。

2.3 抑菌促生相關(guān)基因的PCR檢測

根據(jù)多粘類芽孢桿菌的抑菌促生相關(guān)基因設(shè)計特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)P.polymyxaNBmelon-1能夠擴(kuò)增到合成Polymyxin的編碼基因PMXB、PMXC、PMXD，F(xiàn)usaricidins的編碼基因FUSA，β-葡聚糖的編碼基因PJT以及合成IAA的編碼基因，且條帶與預(yù)期大小相符（圖7），表明P.polymyxaNB?melon-1具有合成Polymyxin和Fusaricidins這2類抑菌脂肽類物質(zhì)的潛力，同時該菌株基因組中存在其他與防御機(jī)制相關(guān)基因和促生相關(guān)基因。

2.4 粗提物抑菌活性

通過酸沉淀法所得到的抑菌物質(zhì)為脂肽類粗提物，硫酸銨飽和沉淀法獲得的抑菌物質(zhì)為蛋白類粗提物。通過抑菌試驗可知，脂肽類粗提物能明顯抑制病原真菌的生長，而蛋白類粗提物則無明顯拮抗效果（圖8、表5），表明P.polymyxaNBmelon-1脂肽類物質(zhì)是發(fā)揮抑菌效果的主要物質(zhì)。

2.5 促生特性及纖維素酶活性

對P.polymyxaNBmelon-1產(chǎn)IAA、溶磷和解鉀等促生能力進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，該菌株無法通過溶磷（圖9B、9C）、解鉀（圖9D）和產(chǎn)NH3（圖9E）來促進(jìn)植物生長，但在產(chǎn)IAA試驗中呈陽性反應(yīng)，在CAS培養(yǎng)基能夠產(chǎn)生橙黃色暈圈，且可溶性指數(shù)達(dá)到1.75，同時在固氮培養(yǎng)基上能夠正常生長，表明P.poly?myxaNBmelon-1具有合成生長激素IAA（圖9A）、較強(qiáng)的產(chǎn)鐵載體（圖9G）及為植物提供氮元素（圖9F）的能力。通過對其纖維素酶生成能力的測定，結(jié)果顯示P.polymyxaNBmelon-1不具備產(chǎn)纖維素酶的能力。

3 討論

土傳病害是造成甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢的重要原因之一，通常施加化學(xué)農(nóng)藥防治，但隨著對環(huán)保問題的重視，該方法受到了嚴(yán)格的限制，而生物防治因其綠色安全、無污染得到廣泛關(guān)注。多粘類芽孢桿菌是一類重要的植物根際促生菌，同時具有生物防治的能力，可有效抑制鐮刀菌等土傳病原菌［27］。筆者所在課題組前期從甜瓜根部分離得到1株P(guān).polymyxaNBmelon-1，表現(xiàn)出廣譜抑菌特性和促生能力。為深入該菌潛在的抑菌基因和分子機(jī)制，本研究采用全基因測序技術(shù)，獲得NBmelon-1完整的基因組序列。結(jié)果表明該菌株基因組大小為5765142bp，GC含量為45.68%，共4984個編碼基因。GO注釋表明菌株NBmelon-1基因組中存在與誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（CAT）等，SOD和CAT可保護(hù)植物細(xì)胞免受破壞，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性［28-29］。同時，發(fā)現(xiàn)該菌基因組中存在與病原體細(xì)胞壁水解的相關(guān)基因，如纖維素酶和葡聚糖酶等。KEGG功能注釋顯示，與碳水化合物代謝和氨基酸代謝相關(guān)的基因數(shù)目最為豐富，與COG注釋結(jié)果吻合。同時注釋到淀粉、果糖和蔗糖等多種代謝通路，說明NBmelon-1能夠利用多種碳源生長發(fā)育，有助于在復(fù)雜的環(huán)境中競爭營養(yǎng)物質(zhì)、成功定殖。此外，還注釋到多個生物合成抗生素通路，這可能是NBmelon-1能夠拮抗多種病原菌的潛在原因。

碳水化合物活性酶（CAZymes）是生防菌拮抗病原菌的一類重要分泌蛋白，可破壞病原菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，阻止其入侵。通過CAZy數(shù)據(jù)庫注釋，顯示共450個CAZy家族編碼基因在P.polymyxaNBmelon-1基因組中被預(yù)測得到，其中包括纖維素酶、肽聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等與細(xì)胞壁裂解密切相關(guān)的基因。幾丁質(zhì)酶可有效水解幾丁質(zhì)，破壞病原真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性，從而拮抗真菌生長［30］。若纖維素酶、葡聚糖酶和肽聚糖酶等與幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，則抑菌效果將顯著增強(qiáng)［31］。但通過纖維素酶活性實驗，表明該菌不具備產(chǎn)纖維素酶的能力。因此，推測菌株NBmelon-1可通過合成肽聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等降解酶，破壞真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，抑制病原菌生長。此外，發(fā)現(xiàn)菌株NBmelon-1中含有232個毒力因子，其中可能具有生防作用的毒力因子主要與黏附（pilR）、分泌系統(tǒng)（essC）和外毒素（hlyB、cylR2）有關(guān)［32］。說明NBmelon-1可能通過黏附基因進(jìn)行定殖，形成生物膜以抵御病原菌的入侵；通過分泌毒素干擾病原菌神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，誘發(fā)病原菌細(xì)胞壞死。

多粘類芽孢桿菌展現(xiàn)出生防潛力的關(guān)鍵在于其能夠產(chǎn)生抑菌次級代謝產(chǎn)物。P.polymyxaNB?melon-1所編碼的5個肽類次級代謝產(chǎn)物均通過非核糖途徑（NRPS）合成，可在綠色防治、醫(yī)藥開發(fā)和農(nóng)藥生產(chǎn)等方面發(fā)揮重要作用。Polymyxin是一類聚陽離子環(huán)肽類抗生素，包括A、B、C、D等成分，對細(xì)菌具有廣譜抑制性，尤其對革蘭氏陰性菌有強(qiáng)烈抑制作用［33-34］。Fusaricidin是一類環(huán)脂肽化合物，主要對革蘭氏陽性細(xì)菌和多種病原真菌具有抑制活性［35］。此類抗生素常用于植物病害的防治，尤其是對世界公認(rèn)的病原菌鐮刀菌，具有良好的防治效果［36］。Peanilipoheptin是一種未知的脂七肽類次級代謝產(chǎn)物［37］。線性陽離子脂肽Tridecaptin通過抑制細(xì)胞壁肽聚糖合成，引起菌體崩解，從而對多種革蘭氏陰性菌具有抑菌效果［38］。為明確菌株NBmelon-1的抑菌物質(zhì)，對其抑菌基因進(jìn)行分子驗證，并提取抑菌粗提物。結(jié)果表明，該菌含有生成Polymyxin、Fu?saricidin的相關(guān)基因；通過粗提物活性實驗，進(jìn)一步明確了該菌抑菌物質(zhì)為脂肽類物質(zhì)，上述結(jié)果證實基因組測序結(jié)果的可靠性。

多粘類芽孢桿菌促進(jìn)植物生長主要是通過固氮、溶磷、解鉀和獲取鐵等方式，提高養(yǎng)分的吸收利用，以及通過分泌植物激素，促進(jìn)植物生長發(fā)育。P.polymyxaNBmelon-1具有較強(qiáng)的產(chǎn)鐵載體和為植物提供氮元素的能力。通過產(chǎn)IAA測定結(jié)果，可知該菌株能夠分泌IAA。IAA是一種吲哚類具有生長素活性的廣譜性植物生長調(diào)節(jié)劑，可通過促進(jìn)細(xì)胞分裂、加速細(xì)胞伸長等方式，促進(jìn)植物生長［39］。說明該菌具有良好的促進(jìn)植物生長的能力。

綜上所述，P.polymyxaNBmelon-1具有固氮、分泌鐵載體和IAA等能力，可促進(jìn)植物生長。全基因組測序結(jié)果表明，該菌基因組中含有多個次級代謝產(chǎn)物合成基因簇，以及存在超氧化物歧化酶、葡聚糖酶、肽聚糖酶等多種酶的編碼基因。表明NB?melon-1能夠分泌具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物和降解酶，破壞病原菌細(xì)胞壁、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式達(dá)到防治病害的效果，為其后續(xù)被開發(fā)為高效生物菌劑提供科學(xué)依據(jù)。未來應(yīng)結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)，進(jìn)一步明確該菌的抑菌物質(zhì)，深入分析該菌株的拮抗機(jī)制。