ZmDIR11調(diào)控玉米抗鹽脅迫機(jī)制研究

關(guān)鍵詞玉米；生物信息學(xué)；ZmDIR11；DIRs基因；鹽脅迫；耐鹽機(jī)制

鹽脅迫（saltstress）是指植物在高鹽度環(huán)境中生長時(shí)所受到的高滲透勢(shì)影響，包括土壤中游離礦物質(zhì)如Na+、Ka+、Mg2+、Cl-等離子對(duì)植物生長發(fā)育所產(chǎn)生的抑制作用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，土壤鹽漬化所導(dǎo)致的對(duì)作物的鹽脅迫是干擾作物正常生長發(fā)育過程的一個(gè)重要限制因素。土壤鹽漬化區(qū)域占據(jù)了全球近1/5的農(nóng)業(yè)土地面積。在中國西北等地區(qū)分布著大面積的鹽漬化土地，由于持續(xù)性的地下水過度開采和化肥過度使用，土壤鹽漬化也逐漸成為制約我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要障礙。在鹽漬化土壤中，作物受到的生長阻礙主要是由高滲透勢(shì)差導(dǎo)致的氧化脅迫、離子損傷和滲透脅迫等所造成，導(dǎo)致作物嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收［1］。玉米作為我國的三大糧食作物之一，挖掘玉米耐鹽基因、解析玉米耐鹽機(jī)制、提高玉米的耐鹽性對(duì)于實(shí)現(xiàn)糧食安全和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展非常重要。

挖掘玉米耐鹽基因能夠?yàn)槔没蚬こ碳涌煊衩啄望}育種進(jìn)程提供重要的基礎(chǔ)材料。研究人員圍繞玉米的耐鹽機(jī)制開展了長期的研究，挖掘鑒定了相當(dāng)數(shù)量的抗性基因和分子調(diào)控途徑，涉及編碼轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶以及蛋白代謝等功能。轉(zhuǎn)錄因子是一類能與基因特定序列專一性結(jié)合并使該基因在特定時(shí)間和空間以特定的強(qiáng)度表達(dá)的一類蛋白質(zhì)［2］。最新研究發(fā)現(xiàn)，ZmWAKY86作為WAKY轉(zhuǎn)錄因子家族核心成員，被證實(shí)是玉米耐鹽性的正調(diào)控因子［3］。Fu等［4］通過在擬南芥中過表達(dá)玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmEREB20，發(fā)現(xiàn)該基因能通過提高ABA響應(yīng)途徑的敏感性來增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性。蛋白激酶是在植物生長發(fā)育和抵抗逆境的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著催化蛋白質(zhì)磷酸化作用的酶。玉米耐鹽性的調(diào)控涉及多個(gè)蛋白激酶基因，這些基因通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與玉米對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。ZmBSK7編碼一個(gè)油菜素類固醇信號(hào)激酶，研究表明該基因在調(diào)控玉米耐鹽性中發(fā)揮著積極作用，敲除ZmBSK7能明顯降低玉米植株對(duì)鹽脅迫的敏感性［5］。研究人員鑒定到1個(gè)玉米類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶基因（CIPK）ZmCIPK21，發(fā)現(xiàn)它的過表達(dá)能增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性［6］。植物在響應(yīng)逆境脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同的代謝物質(zhì)如脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖等調(diào)節(jié)植物體內(nèi)滲透壓，或產(chǎn)生相應(yīng)的活性酶來增強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)性［7?8］。因此，能夠增強(qiáng)特定代謝物質(zhì)表達(dá)的基因也是植物耐鹽基因挖掘的重要對(duì)象。研究顯示，玉米糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZmSWEET1b能夠正調(diào)控玉米對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)能力［9］，ZmSTG1基因過表達(dá)能通過維持光系統(tǒng)活性來提高玉米的耐鹽性［10］。

DIRs基因編碼Dirigent蛋白，在多種藥用植物及木本植物中被證明是植物木脂素生物合成途徑的關(guān)鍵蛋白。在木脂素代謝通路中，發(fā)現(xiàn)與漆酶共同催化松伯醇單體形成松脂醇為下游木脂素合成提供底物［11］。DIRs是一類保守的蛋白基因，存在于所有的植物中，其蛋白序列均包含至少1個(gè)Dirigent結(jié)構(gòu)域［12］。通過構(gòu)建不同植物DIRs基因的系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，ZmDIR11屬于DIR?g亞家族。目前，擬南芥中共鑒定出26種AtDIR基因［13］，水稻中共鑒定出55種OsDIRs基因［14］，小麥中共鑒定135個(gè)TaDIRs基因［15］，甘蔗中共鑒定到64個(gè)ScDIRs基因［16］。研究表明AtDIR5、AtDIR7、AtDIR9受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)［17］，TaDIR13和TaDIR14也能對(duì)鹽脅迫處理作出反應(yīng)［15］，還發(fā)現(xiàn)OsDIR55的過表達(dá)可以改變根部擴(kuò)散屏障從而增強(qiáng)水稻的耐鹽性［18］。但目前尚缺乏DIR響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制研究，在玉米中關(guān)于DIRs基因的報(bào)道也較少。本研究通過對(duì)鮮食玉米耐鹽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到1個(gè)能對(duì)鹽脅迫誘導(dǎo)作出反應(yīng)的ZmDIR11（Zm00001d012432）基因，對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步在玉米B73?EMS突變體中探索ZmDIR11參與耐鹽脅迫的調(diào)控模式，以期為玉米耐鹽性遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試玉米（ZeamaysL.）材料為B73自交系，亞細(xì)胞定位所用材料為本氏煙草（Nicotianabenthami?anaL.），由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米中心提供，突變體材料從玉米EMS突變庫（https：//elabcaas.cn/）中獲得。玉米和煙草植株置于白天28℃/夜晚21℃的人工氣候室中，光周期為16h光照/8h黑暗，植株在盛裝有含品氏土、蛭石和珍珠巖等體積混合土壤的10m3黑色方缽中生長，用1/2Hogland營養(yǎng)液培育。在鹽脅迫實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)玉米長到3葉期時(shí)，對(duì)照組用1/2Ho?gland營養(yǎng)液處理，脅迫組用1/2Hogland配制200mmol/L的NaCl溶液處理，在不同時(shí)間點(diǎn)采集玉米苗期第2片平展真葉速凍于液氮中，在-80℃冰箱保存，用于后續(xù)研究。

1.2 ZmDIR11ems突變體株系的建立

從玉米EMS突變庫（https：//elabcaas.cn/）中獲得第1代ZmDIR11突變體種子。本研究使用的2種突變體為EMS4?3f0544（ZmDIR11ems?1）和EMS4?15dd8f（ZmDIR11ems?2）。獲得突變體種子后與野生型B73雜交，背景材料純化2代，后自交2代，通過PCR?瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性突變位點(diǎn)，引物為ZmDIR1?F：ATCCTACATCTGCCTGCCCTCT；ZmDIR11?R：TGACATTATTCCCACCCGTTTC。選擇每種突變體的純合系進(jìn)行鹽脅迫表型分析。

1.3 ZmDIR11的生物信息學(xué)分析

通過MaizeGDB查詢ZmDIR11及其他ZmDIRs基因和蛋白信息，使用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白和核苷酸序列的多重比對(duì)，結(jié)合利用ExPASy在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/）對(duì)ZmDIR11蛋白序列進(jìn)行模型預(yù)測(cè)。利用IBS2.0在線網(wǎng)站（https：//www.ibs.renlab.org/#/home）繪制ZmDIR11基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖。另外，在STRING蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string?db.org/）查詢、預(yù)測(cè)DIR11蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行GO富集分析。調(diào)取基因組上ZmDIR11起始密碼子前2000bp序列，利用Plant?Care在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)ZmDIR11啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析，并利用Tbtools軟件進(jìn)行可視化預(yù)測(cè)。其他物種的DIRs序列從NCBI（NationalCenterforBiotechnologeInformation）數(shù)據(jù)庫中查詢獲得，序列比對(duì)通過MEGAX軟件進(jìn)行，系統(tǒng)發(fā)育樹通過tbtools軟件構(gòu)建。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄qPCR分析

使用天根TRIZon總RNA提取試劑盒（DP405）提取玉米葉片總RNA，然后使用HiScriptⅢAllin?oneRTSupermix（Vazyme，南京，中國）試劑盒將玉米總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用ChamQSYBRcol?orqPCRMasterMix試劑盒（Vazyme）進(jìn)行RT?qP?CR。RT?qPCR分析使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的AppliedBiosystems熒光定量PCR分析儀（QuantStu?dioTM6Flex）完成，RT?qPCR引物見表1，ZmAC?TIN1用作內(nèi)參基因。

1.5 亞細(xì)胞定位

將ZmDIR11序列擴(kuò)增克隆并構(gòu)建到載體pCAMBIA1305?GFP中，將AtH2B序列以及At?WAK?HDEL序列構(gòu)建到載體pCAMBIA1305?RFP中，載體構(gòu)建完成后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)，制備混合液注射入生長4周的煙草葉片中［19］。煙草暗培養(yǎng)36h后，進(jìn)行激光共聚焦觀察拍照。定位對(duì)照蛋白H2B是核定位的組蛋白［20］，WAK?HDEL蛋白則定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，WAK是細(xì)胞壁相關(guān)激酶蛋白［21］，HDEL是一段特殊的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留多肽信號(hào)［22］。

1.6 玉米葉片代謝指標(biāo)的測(cè)定

測(cè)定玉米第2片真葉MDA、脯氨酸、H2O2、超氧陰離子的含量及玉米葉片中SOD、CAT、POD酶的活性，將12日齡的幼苗在200mmol/L的NaCl溶液處理3d（對(duì)照材料為1/2Hogland營養(yǎng)液）。指標(biāo)檢測(cè)均使用索萊寶公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行，方法為微量法，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)（MDA檢測(cè)試劑盒貨號(hào)為BC0025，Pro檢測(cè)試劑盒貨號(hào)為BC0295，H2O2檢測(cè)試劑盒貨號(hào)為BC3595，超氧陰離子含量檢測(cè)試劑盒貨號(hào)為BC1295，SOD檢測(cè)試劑盒貨號(hào)為BC0175，CAT檢測(cè)試劑盒貨號(hào)為BC0205，POD檢測(cè)試劑盒貨號(hào)為BC0095）。Na＋和K＋的測(cè)定，采用苗期玉米第2片真葉，在70℃烘箱干燥2d后，磨碎稱樣0.1g處理后使用火焰分光光度法測(cè)定［23］。葉綠素的提取采用玉米幼苗第2片新鮮真葉，剪碎稱取0.1g用有機(jī)溶劑提取法提取，提取試劑購買自上海源葉公司。在酶標(biāo)儀上測(cè)定663和645nm處的吸光值，計(jì)算葉綠素含量?？偰局睾康臏y(cè)定使用甲醇作為木脂素萃取溶劑，料液比為1∶20（m/V），設(shè)置超聲波萃取儀器功率為2500W，40℃萃取1h、離心取上清使用植物總木脂素ELISA檢測(cè)試劑盒（ChemicalBook，貨號(hào)CB21405974）進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPadPrism8.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Tukey多重比較進(jìn)行單向或雙向方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmDIR11基因的克隆與生物信息分析

前期在鮮食玉米耐鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到1個(gè)受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因Zm00001d012432，命名為ZmDIR11。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因位于玉米第8條染色體，僅含有1個(gè)外顯子，具有DIRs基因的經(jīng)典結(jié)構(gòu)［24］。對(duì)該基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該基因全長639bp，編碼1個(gè)由212個(gè)氨基酸組成的Dirigent蛋白。該蛋白包含1個(gè)Dirigent結(jié)構(gòu)域，位于肽段99～186氨基酸區(qū)域（圖1A）；其蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)模型也具備典型的Dirigent蛋白結(jié)構(gòu)特征（圖1B）；啟動(dòng)子元件分析（圖1C）顯示，在ZmDIR11的啟動(dòng)子區(qū)域存在包含ARE、MYB、MYC、STRE、LTR以及MBS共6種與非生物脅迫相關(guān)的啟動(dòng)子［25］，其中共有9個(gè)MYB類啟動(dòng)子元件，說明該啟動(dòng)子元件能被MYB轉(zhuǎn)錄因子特異性識(shí)別并結(jié)合。通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢到部分其他玉米ZmDIRs基因的蛋白序列，并將它們同ZmDIR11蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們存在類似的保守氨基酸區(qū)域（圖1D）。為進(jìn)一步探索ZmDIR11的同源性，利用TBtools軟件構(gòu)建了Zm?DIR11的系統(tǒng)發(fā)育樹，并與其他物種（擬南芥、水稻、甘蔗）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ZmDIR11與OsDIR44高度同源（圖1E）。通過查找STRING蛋白數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)ZmDIR11蛋白可能與其他3種玉米DIR蛋白（Zm00001d024969、Zm00001d004753和Zm00001d026546）存在互作，表明ZmDIR11可能與其他DIR蛋白共同發(fā)揮功能（圖1F）。此外，STRING數(shù)據(jù)庫GO富集分顯示，ZmDIR11的生物學(xué)功能相對(duì)集中在植物防御反應(yīng)和苯丙素生物合成過程（圖1G）。

2.2 ZmDIR11的表達(dá)模式與亞細(xì)胞定位

采用RT?qPCR檢測(cè)ZmDIR11的組織表達(dá)模式，結(jié)果顯示，ZmDIR11在玉米幼葉、成熟葉、幼根、莖、須和花粉等組織中均有不同程度的表達(dá)，其中在幼根中的轉(zhuǎn)錄水平最高，莖中表達(dá)量最低（圖2A）。同時(shí)，檢測(cè)ZmDIR11在鹽脅迫不同處理時(shí)間（0、1、6、12、24、36和48h）的葉片中的表達(dá)情況（圖B），對(duì)照組ZmDIR11在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量保持不變，在受到鹽脅迫時(shí)，ZmDIR11的表達(dá)會(huì)隨時(shí)間的推移而上升，在36h達(dá)到最高水平，48h后有所下降。用本氏煙草葉片進(jìn)行蛋白瞬時(shí)表達(dá)（圖2C）。結(jié)果顯示，ZmDIR11蛋白與AtWAK?HDEL?RFP共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是植物細(xì)胞代謝物合成的細(xì)胞器之一，說明ZmDIR11可能參與代謝物合成。

2.3 ZmDIR11在玉米中的抗鹽調(diào)控機(jī)制

用200mmol/L的NaCl溶液處理3葉期的B73野生型幼苗和ZmDIR11ems突變體幼苗。對(duì)照組野生型（WT）和突變體（ZmDIR11ems）材料的幼苗生長特性沒有顯著差異。而在鹽脅迫處理下，突變體植株萎蔫和失綠更嚴(yán)重（圖3A）。野生型和Zm?DIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株的平均株高分別為34.6、34.1和33.5cm，野生型與突變體植株之間無差異。而在鹽脅迫處理?xiàng)l件下，植株生長受到抑制，野生型植株的平均株高為23.0cm，Zm?DIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株的平均株高分別為15.1、14.6cm，野生型植株與突變體植株差異顯著（圖3B）。同樣，對(duì)照組野生型和ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株的平均根長分別為34.9、33.0及35.2cm，突變體與野生型之間根長差異不顯著。經(jīng)過鹽脅迫處理，突變體植株的根部生長受抑制程度更深，ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株的平均根長分別僅有16.9和16.4cm，而野生型植株的平均根長仍有24.1cm，顯著高于突變體植株（圖3C）。此外，對(duì)照組野生型和突變體植株的平均鮮質(zhì)量差異不顯著，野生型平均鮮質(zhì)量為4.81g，Zm?DIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株則分別為4.69g和4.75g。處理組野生型植株的平均鮮質(zhì)量為3.75g，ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株的平均鮮質(zhì)量分別為1.67和1.32g，差異極顯著，突變體植株在鹽脅迫下受到的生長抑制更嚴(yán)重，植株體內(nèi)物質(zhì)積累更緩慢（圖3D）。同樣，對(duì)照組野生型和突變體株系的平均干質(zhì)量差異不顯著，而在鹽脅迫處理下，ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株的平均干質(zhì)量分別為0.19和0.21g，野生型植株的平均干質(zhì)量則為0.36g，突變體與野生型平均干質(zhì)量差異極顯著（圖3E）。上述結(jié)果表明，ZmDIR11的突變使得植株在鹽脅迫下受到的生長抑制情況顯著高于野生型B73材料，ZmDIR11突變影響了玉米苗期植株的生長與干物質(zhì)積累。

2.4 ZmDIR11對(duì)鹽脅迫下玉米植株抗氧化能力的調(diào)控

為了解ZmDIR11是否能調(diào)控鹽脅迫下玉米的氧化損傷代謝，利用RT?qPCR分析野生型B73植株和ZmDIR11ems植株在對(duì)照組和鹽脅迫處理組Zm?CAT3、ZmSOD1、ZmPOD1（參與玉米體內(nèi)抗氧化酶防御通路）基因的相對(duì)表達(dá)量并測(cè)定氧化相關(guān)生理指標(biāo)。

對(duì)照組野生型和突變體葉片中ZmCAT3、ZmSOD1、ZmPOD1的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著；經(jīng)過鹽脅迫處理后，突變體植株葉片中的抗氧化酶防御通路中的ZmCAT1、ZmCAT3、ZmSOD1、ZmPOD1相對(duì)基因表達(dá)量極顯著低于野生型（圖4A、B、C）。

MDA、H2O2以及O2－的過度積累會(huì)損傷細(xì)胞膜，影響植物的生長，減弱植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)能力。突變體植株的MDA、H2O2以及O2－的積累明顯高于野生型。野生型植株、ZmDIR11ems?1和Zm?DIR11ems?2突變體植株的MDA含量分別為80.89、80.23和75.23nmol/g，差異不顯著。而在鹽脅迫處理后，ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株的MDA含量分別增加到201.70和226.32nmol/g，而野生型植株MDA含量增加到159.07nmol/g，突變體植株與野生型植株的MDA含量在鹽脅迫處理后差異顯著（圖4D）。野生型植株葉片的H2O2含量為2.38μmol/g，ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株葉片中含量分別為2.42和2.07μmol/g，差異不顯著。鹽脅迫處理后，ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株的H2O2含量分別上升為28.81和30.41μmol/g，野生型植株葉片中的H2O2含量為18.29μmol/g，鹽脅迫處理后突變體植株和野生型植株之間該指標(biāo)差異極顯著（圖4E）。對(duì)照組野生型和ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株葉片中的O2－含量分別為2.16、1.95和2.05μmol/g，野生型植株與突變體植株之間O2－含量差異不顯著。經(jīng)過鹽脅迫處理后，Zm?DIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株葉片中的O2－含量分別上升到6.73和6.95μmol/g，野生型植株葉片中O2－含量為4.12μmol/g，突變體和野生型植株之間O2－含量差異極顯著（圖4F）。表明ZmDIR11的突變導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜的損傷程度加劇。鹽脅迫引起的氧化損傷會(huì)導(dǎo)致活性氧（ROS）的積累。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）以及過氧化物酶（POD）在清除過量的ROS中發(fā)揮著重要作用。結(jié)果顯示，對(duì)照組野生型和突變體的幼苗葉片中的CAT、SOD、POD活性差異不顯著，其中野生型植株葉片中CAT酶活為81.25U/g，ZmDIR11ems?1與Zm?DIR11ems?2的SOD酶活分別為88.91和79.23U/g。生型植株葉片中的SOD酶活為45.75U/g，Zm?DIR11ems?1與ZmDIR11ems?2的SOD酶活分別為40.85和37.28U/g。野生型植株葉片中的POD酶活為44.76U/g，ZmDIR11ems?1與ZmDIR11ems?2的SOD酶活分別為48.21和51.28U/g（圖4G?I）。在鹽脅迫處理后野生型植株的CAT酶活性達(dá)到了422.56U/g，而ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株分別只有330.17和370.98U/g；野生型植株的SOD酶活性為104.23U/g，而ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體的SOD酶活性分別為79.35和76.24U/g；野生型植株的POD酶活性在處理后達(dá)到了1361.03U/g，而ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株分別為950.43和883.67U/g。鹽脅迫處理后突變體和野生型中的這3種酶活差異均極顯著，ZmDIR11突變后導(dǎo)致突變體材料中的CAT、SOD以及POD的酶活均弱于野生型B73。這表明ZmDIR11通過刺激抗氧化防御酶的功能和降低活性氧水平，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化活性來提高玉米抵御鹽脅迫的能力。

2.5 ZmDIR11對(duì)鹽脅迫下玉米植株代謝物積累的影響

植物在鹽脅迫條件下，其自身代謝物積累量會(huì)隨著鹽脅迫的程度而發(fā)生變化。結(jié)果顯示，野生型植株葉片中的Pro含量為19.23μg/g，ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株葉片中的Pro含量分別為20.56和23.78μg/g，野生型和突變體Pro含量差異不顯著。經(jīng)過鹽脅迫處理后，野生型植株葉片中的Pro含量積累達(dá)到了167.97μg/g，而ZmDIR11ems?1、Zm?DIR11ems?2突變體植株中的Pro含量分別為121.48與115.29μg/g，突變體植株與野生型Pro積累水平在鹽脅迫處理后差異極顯著。相較于野生型，突變體植株P(guān)ro的積累明顯更少（圖5A）。由圖5B可見，對(duì)照組野生型和ZmDIR11em?1、ZmDIR11ems?2突變體植株總木脂素含量分別為35.47、32.65和30.67mg/g。在鹽脅迫處理下，所有玉米葉片中的總木脂素含量均有所增加，且ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體葉片中的總木脂素含量分別增加到43.13和47.28mg/g，相較于野生型植株葉片中的56.28mg/g，突變體株系的總木脂含量明顯低于野生型。這可能是因?yàn)閆mDIR11參與木脂素的合成，利用木脂素的抗氧化活性來增強(qiáng)玉米的耐鹽性。

突變體植株葉片葉綠素含量在處理后下降得更多（圖5C）。對(duì)照組野生型植株和ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株葉片的葉綠素含量分別為1.43、1.38和1.41mg/g，無顯著差異。鹽脅迫處理后野生型和突變體的葉綠素含量均有所降低，其中野生型植株葉片中的葉綠素含量為0.93mg/g，而Zm?DIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體植株葉片的葉綠素含量分別為0.73、0.65mg/g，鹽脅迫處理后突變體與野生型植株葉綠素含量差異顯著。以上結(jié)果說明，ZmDIR11正向調(diào)節(jié)玉米中脯氨酸、木脂素的代謝積累過程，減弱了玉米葉片葉綠素的流失程度，正向調(diào)節(jié)玉米的抗鹽脅迫能力。

2.6 ZmDIR11對(duì)植株Na＋、K＋轉(zhuǎn)運(yùn)及相關(guān)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響

為探索ZmDIR11是否通過影響Na＋與K＋含量來調(diào)節(jié)玉米的耐鹽性，測(cè)定了玉米葉片的Na＋和K＋含量。結(jié)果顯示，ZmDIR11突變體比野生型植株在鹽脅迫下有著更多的Na＋積累。對(duì)照組野生型植株葉片Na＋含量為2.57mg/g，ZmDIR11ems?1、Zm?DIR11ems?2突變體葉片的Na＋含量分別為2.61和2.49mg/g，差異不顯著。鹽脅迫處理后ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體葉片的Na＋含量分別增加到46.43和51.51mg/g，相較于處理后的野生型植株葉片中的Na＋含量（31.73mg/g），突變體與野生型在鹽脅迫處理后差異極顯著（圖6A）。ZmDIR11突變體比野生型植株在鹽脅迫下的K＋含量更低（圖6B）。對(duì)照組野生型和ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體葉片的K＋含量分別為48.37、46.88和50.66mg/g，而在鹽脅迫處理后，野生型植株葉片中的K＋含量降低到35.16，ZmDIR11ems?1、ZmDIR11ems?2突變體葉片則分別降低到27.14和25.14mg/g，此時(shí)突變體與野生型K＋含量在鹽處理后差異極顯著。ZmDIR11的突變提高了突變體玉米幼苗體內(nèi)的Na＋含量和K＋含量的比率（圖6C）。

ZmSOS1［26］、ZmSOS2［27］、ZmNHX1［28］、Zm?HAK4［29］、ZmHKT1［30］和ZmHKT1；2［31］是一系列編碼Na+、K＋等離子轉(zhuǎn)運(yùn)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，利用RT?qPCR分析這些基因在對(duì)照組（鹽脅迫處理前）和鹽脅迫處理后的相對(duì)基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組Zm?SOS1、ZmSOS2、ZmNHX1、ZmHKT1、ZmHKT1；2和ZmHAK4的相對(duì)表達(dá)量基本無差異，而在鹽脅迫處理下，突變體植株與野生型植株葉片中的各基因相對(duì)表達(dá)量差異極顯著（圖D-I）。這說明ZmDIR11參與了調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)方式來提高植物對(duì)鹽脅迫的抗性。

3 討論

DIRs基因是木脂素生物合成途徑的重要成員，編碼一類保守的Dirigent蛋白。目前，DIRs已被發(fā)現(xiàn)存在于多種植物中，一部分DIRs蛋白被發(fā)現(xiàn)可以參與（+）?棉子酚（（+）?gssypol）［32］的合成以及凱氏帶（asparianstrip）的形成［33］，另一部分則主要參與植物對(duì)生物及非生物逆境響應(yīng)的生理過程。研究人員在西瓜中共鑒定出22個(gè)DIRs基因，并且通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗性品種中ClDIR5和ClDIR8基因在接種白粉病菌后表達(dá)豐度明顯上升，表明這2個(gè)DIRs基因可能參與了西瓜的抗病機(jī)制［34］。過表達(dá)GmDIR22能夠提高大豆植株體內(nèi)木脂素的總量，并增強(qiáng)大豆對(duì)疫霉的抗性，表明大豆DIRs基因也能夠在抵抗生物脅迫中發(fā)揮作用［35］。在對(duì)稻屬的DIRs基因家族進(jìn)行GWAS鑒定和表達(dá)模式分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種立枯絲核菌后，OsjDIR13、OsjDIR15、OsjDIR21、OsjDIR29、OsjDIR35、OsjDIR36和OsjDIR37的表達(dá)受到顯著抑制。并且OsjDIR35、OsjDIR36和OsjDIR37是串聯(lián)重復(fù)基因，這意味著它們?cè)谡{(diào)節(jié)水稻抗紋枯病方面可能發(fā)揮協(xié)同作用［36］。對(duì)蕓薹屬白菜品種的29個(gè)DIRs基因進(jìn)行研究鑒定，發(fā)現(xiàn)BrDIR2能夠?qū)φ婢a(chǎn)生響應(yīng)，并且同時(shí)觀察到11個(gè)BrDIRs對(duì)水淹處理、12個(gè)BrDIRs對(duì)ABA處理和12個(gè)BrDIRs對(duì)冷脅迫處理產(chǎn)生響應(yīng)性表達(dá)。表明白菜DIR基因家族成員既能在生物脅迫中發(fā)揮抗病作用也能對(duì)非生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)［37］。在對(duì)蒺藜苜蓿的DIR基因家族的29個(gè)MtDIRs進(jìn)行非生物脅迫處理表達(dá)譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同基因成員在干旱、寒冷以及鹽度等非生物脅迫處理下發(fā)生高表達(dá)［38］。而另一項(xiàng)對(duì)甘蔗屬ScDirs基因的研究中發(fā)現(xiàn)，ScDir蛋白在大腸桿菌Rosetta菌株中表達(dá)后，能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因細(xì)菌對(duì)PEG和NaCl的耐受性［39］。

日前對(duì)玉米DIRs基因的研究較少，我們前期從玉米中共鑒定出40個(gè)DIRs基因，該家族部分成員包括ZmDIR11在干旱、低溫、NaCl以及水淹等脅迫下被不同程度地誘導(dǎo)表達(dá)。本研究結(jié)果表明，Zm?DIR11在調(diào)控玉米耐鹽性方面發(fā)揮了正調(diào)控作用。ZmDIR11蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)。ZmDIR11通過降低MDA和H2O2的積累，增加Pro和總木脂素的代謝合成，緩解植物受到的細(xì)胞損傷，減弱滲透壓、改善植株生長狀態(tài)。鹽脅迫可致使植物遭受氧化應(yīng)激，并產(chǎn)生氧化損傷。SOD、CAT、POD是減輕氧化損傷的關(guān)鍵酶。ZmDIR11提高了這3種酶的活性，進(jìn)而減輕了鹽脅迫下的氧化損傷。離子毒性損傷是鹽脅迫對(duì)植物的直接影響。高鹽往往通過Na?的積累以及相應(yīng)K?的流失，對(duì)滲透調(diào)節(jié)與光合作用產(chǎn)生影響。為探究ZmDIR11是否借由影響Na?含量來調(diào)控玉米的耐鹽性，對(duì)鹽脅迫下玉米的Na?含量進(jìn)行了測(cè)定。在本研究中，ZmDIR11負(fù)向調(diào)控了Na＋的積累。這表明ZmDIR11可能通過影響Na＋的含量調(diào)控玉米的耐鹽性。本研究發(fā)現(xiàn)Zm?DIR11的突變會(huì)抑制葉綠素的合成，表明ZmDIR11可能通過影響葉綠素的合成參與抵抗鹽脅迫的防御機(jī)制。利用RT?qPCR分析了鹽脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ZmDIR11不僅能影響相關(guān)抗氧化酶基因的表達(dá)，也能影響抗鹽脅迫信號(hào)通路的關(guān)鍵基因Zm?SOS1［26］的表達(dá)。這表明ZmDIR11可能參與玉米抗鹽脅迫的信號(hào)傳遞，提高玉米內(nèi)源抗鹽基因的表達(dá)，從而提高玉米的耐鹽性。

DIRs是參與木脂素合成的關(guān)鍵基因，本研究檢測(cè)了對(duì)照組和鹽脅迫處理組的總木脂素含量。結(jié)果顯示在鹽脅迫下，相比于未經(jīng)鹽處理的對(duì)照組，總木脂素含量有一定程度的上升，而ZmDIR11突變會(huì)相對(duì)降低總木脂素的含量，這表明ZmDIR11影響了木脂素的合成，可能利用木脂素的生物活性來響應(yīng)鹽脅迫。但是，玉米ZmDIR11所調(diào)控合成的木脂素種類還有待鑒定。一般來說，植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器是植物細(xì)胞代謝合成的主要器官之一，控制著大部分次級(jí)代謝物的組裝合成，本研究中發(fā)現(xiàn)ZmDIR11的啟動(dòng)子區(qū)域存在大量和非生物逆境相關(guān)的啟動(dòng)子元件，其中MYB元件最多，而研究表明MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，其重要功能之一就是參與作物對(duì)非生物逆境的應(yīng)答［40］。亞細(xì)胞定位顯示ZmDIR11蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，意味著它參與了某種代謝物如木脂素的合成，通過修飾蛋白質(zhì)或基因的表達(dá)來完成對(duì)鹽脅迫的調(diào)控。，木脂素是由兩分子苯丙素衍生物（即C6?C3單體）聚合而成的天然化合物，而DIR蛋白正是聚合過程中耦合反應(yīng)進(jìn)行的關(guān)鍵條件。本研究僅發(fā)現(xiàn)ZmDIR11影響了玉米總木脂素的代謝。在藥材及木本植物中木脂素結(jié)構(gòu)已超200種，涉及植物生長發(fā)育、植物免疫代謝、人類及動(dòng)物醫(yī)學(xué)等方面，不同結(jié)構(gòu)的木脂素其理化性質(zhì)差異很大。不同的植物中往往存在不同結(jié)構(gòu)的木脂素，與其組成的單體結(jié)構(gòu)及衍生物有關(guān)，進(jìn)而影響植物的生理代謝活動(dòng)。關(guān)于玉米中木脂素的研究較少見，對(duì)木脂素結(jié)構(gòu)的鑒定及理化性質(zhì)的分析尚未突破，在后續(xù)的研究中還有待進(jìn)一步探索。