中國(guó)沙棘ACBPs基因家族成員鑒定及響應(yīng)鉛脅迫的表達(dá)分析

摘" " 要：【目的】ACBPs（acyl-CoA-binding proteins）基因家族在植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育、響應(yīng)非生物脅迫以及生物膜修復(fù)等方面具有重要作用。旨在探究中國(guó)沙棘ACBPs基因家族成員在重金屬鉛脅迫下的基因表達(dá)量，為初步解析中國(guó)沙棘響應(yīng)重金屬鉛脅迫的分子機(jī)制及利用基因工程手段培育重金屬鉛低積累性的新品種提供研究基礎(chǔ)和分子靶標(biāo)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)中國(guó)沙棘ACBPs基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)其家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析、多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析、亞細(xì)胞定位和染色體定位分析、基因結(jié)構(gòu)和Motif序列分析、順式作用元件分析、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析、物種內(nèi)與物種間基因共線性分析以及對(duì)基因表達(dá)模式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析和qRT-PCR驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】在中國(guó)沙棘全基因組中共鑒定出8個(gè)ACBPs基因，不均勻分布于7條染色體上。ACBPs家族成員可細(xì)分為4個(gè)組，同一組內(nèi)的成員基因結(jié)構(gòu)保守且蛋白基序差異較小。共線性分析表明，中國(guó)沙棘ACBPs基因家族與擬南芥ACBPs基因家族之間存在9條共線性，與翅果油樹(shù)ACBPs基因家族之間存在17條共線性。轉(zhuǎn)錄組分析和qRT-PCR驗(yàn)證表明，中國(guó)沙棘ACBPs基因家族中大部分基因在鉛濃度（w，后同）為1000 mg·kg-1時(shí)，表達(dá)量急劇下降；在鉛濃度為5000 mg·kg-1時(shí)，表達(dá)量顯著上升?！窘Y(jié)論】在中國(guó)沙棘基因組中鑒定到8個(gè)ACBPs基因。Group1和Group3中的成員在基因結(jié)構(gòu)、motif序列以及蛋白三維結(jié)構(gòu)中均表現(xiàn)了一定的保守性；ACBPs基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域含有多種順式作用元件，能夠響應(yīng)植物激素的調(diào)控、影響分生組織的基因活性，以及響應(yīng)脅迫應(yīng)激?；蚣易宕蟛糠殖蓡T在鉛脅迫條件下的表達(dá)具有相似性，該基因家族通過(guò)調(diào)整基因的表達(dá)量響應(yīng)不同濃度的重金屬鉛脅迫，從而減輕鉛脅迫帶來(lái)的傷害。

關(guān)鍵詞：中國(guó)沙棘；生物信息學(xué)；ACBPs基因家族；鉛脅迫

中圖分類號(hào)：S793.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2025）03-0526-17

Identification and expression analysis of ACBPs family members of Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi in response to lead stress

CHEN Ke1， 2， LI Xinjuan1， ZHANG Tian1， REN Qiandan1， SUN Jing2， ZHOU Wu1*

（1College of Eco-Environmental Engineering， Qinghai University， Xining 810016， Qinghai， China; 2Northwest Institute of Plateau Biology， Chinese Academy of Sciences/Qinghai Provincial Key Laboratory of Qinghai-Tibet Plateau Biological Resources/CAS Key Laboratory of Tibetan Medicine Research， Xining 810008， Qinghai， China）

Abstract： 【Objective】 Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi is a plant of substantial economic value and ecological significance， attracting sustained research interest. The ACBPs gene family is integral to plant biology， playing a critical role in normal plant growth and development. This gene family is deeply involved in cellular material and energy metabolism and plays a vital role in plants’ adaptation to abiotic stress and biomembrane repair， particularly in response to heavy metal stress. Information on the ACBPs gene family in H. rhamnoides remains scarce. This study aims to accurately and comprehensively identify the members of the ACBPs gene family in H. rhamnoides using bioinformatics tools， and to investigate the expression of these genes under heavy metal （lead） stress through molecular biology approaches. 【Methods】 In this study， the ACBPs gene family in H. rhamnoides subsp. sinensis Rousi was identified using the hidden Markov model （PF00887） and the HMMER search script. Physicochemical properties and subcellular localization were analyzed via the ExPASy and WoLF PSORT websites. Multiple sequence alignment and gene structure analyses were conducted using MEGA software and the GSDS website. Phylogenetic and motif analyses were performed using the TBtools FastTree plugin and the MEME website. Chromosome localization and cis-acting element analyses were conducted using Mapchart software and the PlantCARE website. Intra- and interspecific gene collinearity analyses were conducted via the TBtools Advanced Circos and One Step MCScanX plugins. Protein-protein interaction networks and three-dimensional structure prediction analyses were conducted using the STRING database and the SWISS-MODEL website. Additionally， expression profiles of ACBPs gene were visualized using heatmaps based on FPKM values from RNA-Seq data， and relative gene expression levels were validated through qRT-PCR experiments. 【Results】 A comprehensive search of the H. rhamnoides subsp. sinensis Rousi proteome identified eight ACBPs genes， named HrLACBPs1–HrLACBPs8. Physicochemical analysis revealed that most translated protein sequences were rich in acidic amino acids， with only one being basic， and most of the proteins were localized in the nucleus. Multiple sequence alignments identified two main motifs， YKQA and KWDAW， responsible for acyl-CoA binding. Chromosomal mapping indicated that HrLACBPs4 and HrLACBPs5 were on chromosome 4， while the other six genes were on chromosomes 1， 2， 3， 5， 11， and 12. Phylogenetic analysis with the ACBPs gene families of Arabidopsis， Elaeagnus mollis Diels and Helianthus annuus divided the HrLACBPs family into three groups： Groups 1 with three members， Group 2 with one member， and Group 3 and 4 each with two members. Gene structure and motif analysis showed conserved gene structures and minimal motif differences within each group， with Group 3 containing the most exons and motif sequences. Cis-acting element analysis， focusing on hormone regulation， meristem expression， and stress response elements， revealed that the promoters of HrLACBPs members generally contained three or more of these elements. Collinearity analysis demonstrated no collinearity between HrLACBPs4 and the other seven genes， but HrLACBPs2， HrLACBPs3， and HrLACBPs5 exhibited mutual collinearity on chromosomes 2， 3， and 4. Nine collinearities were identified between the H. rhamnoides ACBPs gene family and the Arabidopsis ACBPs gene family， and seventeen with the Elaeagnus mollis Diels ACBPs gene family. Protein interaction network analysis suggested that HrLACBPs1 in H. rhamnoides may functionally resemble ACBP6 in Arabidopsis. Protein 3D structure predictions revealed that Group 3 proteins were the most complex with high model similarity; Group 1 proteins were simpler but also similar; Group 4 proteins showed low similarity and large differences. Transcriptome analysis and qRT-PCR validation indicated that， except for HrLACBPs1， the other genes had lower expression levels at 2000 mg·kg-1 lead compared to controls， while their expression increased at 5000 mg·kg-1 lead. 【Conclusion】 In H. rhamnoides subsp. sinensis Rousi， eight ACBPs were identified， with Group 1 and 3 members exhibiting conserved patterns in gene structure， motif sequences， and three-dimensional protein structures. Group 3 contained the most exons， increasing the likelihood of alternative splicing and enhancing functional diversity. The gene family’s promoter regions contain various cis-acting elements responsive to plant hormones， meristematic activity， and stress stimuli， suggesting that HrLACBPs have multiple biological functions. Protein interaction network analysis highlighted AtACBP6， from the Arabidopsis ACBP family， as a core protein that enhances plant cold tolerance when overexpressed under cold stress. Low-temperature stress response elements were also identified in HrLACBPs1， suggesting its role in enhancing plant cold tolerance. Transcriptome analysis and qRT-PCR validation showed that most ACBPs genes in H. rhamnoides were significantly downregulated at 1000 mg·kg-1 lead， with upregulation occurring at 5000 mg·kg-1. This may occur because low lead concentrations cause less oxidative stress， allowing plants to enhance antioxidant defenses by upregulating gene expression to mitigate lead damage. HrLACBPs1 expression， localized in the endoplasmic reticulum， decreased at 500 mg·kg-1 lead compared to controls， then gradually increased at 2000 and 5000 mg·kg-1. Expression of the genes in the endoplasmic reticulum may reduce to alleviate protein synthesis burden at low lead stress and may increase to address protein damage and accumulation at higher stress levels. These findings provide a solid theoretical basis for further research on H. rhamnoides’s response to heavy metal lead stress.

Key words： Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi; Bioinformatics; ACBPs gene family; Lead stress

中國(guó)沙棘（Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi），是胡頹子科沙棘屬的一種落葉性灌木或小喬木，適應(yīng)能力強(qiáng)，廣泛生長(zhǎng)于中國(guó)華北、西北、西南等地[1]。中國(guó)沙棘是一種具有重要經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的植物，果實(shí)富含多種生物活性物質(zhì)，如不飽和脂肪酸、維生素C等，對(duì)人類健康具有頗多益處[2]。中國(guó)沙棘是一種重金屬富集型的植物，能夠吸收并累積土壤中的鉛等重金屬，這種特性使沙棘果實(shí)及其加工產(chǎn)品中重金屬含量超出了安全標(biāo)準(zhǔn)，尤其是在濃縮果汁和其衍生產(chǎn)品中，這種超標(biāo)情況更為顯著[3]。因此，研究中國(guó)沙棘對(duì)鉛脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)中國(guó)沙棘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和人類健康具有重要意義。

隨著工業(yè)高速發(fā)展，環(huán)境問(wèn)題日益突出，尤其是土壤中的鉛污染問(wèn)題。鉛在土壤中溶解度低，受多種因素影響，遷移能力弱，導(dǎo)致土壤污染加劇[4]。鉛對(duì)植物生長(zhǎng)有顯著的負(fù)面影響，高濃度鉛會(huì)抑制植物種子中的生長(zhǎng)分子，影響生根和發(fā)芽，導(dǎo)致植物衰敗或死亡[5]。鉛污染還影響植物的光合作用、水分代謝和礦物質(zhì)吸收[6]。鉛污染通過(guò)食物鏈影響人體健康，過(guò)量攝入鉛會(huì)影響兒童智力發(fā)育，損害閱讀和協(xié)調(diào)能力[7]，導(dǎo)致胃腸問(wèn)題，如食欲不振和便秘。鉛的攝入還可能引起腎組織變性和腎功能改變[8]，增加腎衰竭風(fēng)險(xiǎn)。此外，鉛對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有直接毒性作用，可能引發(fā)鉛性腦病[9]。

植物對(duì)鉛的吸收主要有兩個(gè)重要途徑，第一，植物葉片的吸收和吸附；第二，植物根系吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。植物葉片具有吸收大氣中重金屬氣溶膠的能力[10]，由于鉛在土壤中的流動(dòng)性較差，且主要以非可交換態(tài)存在[11]，因此，在大氣鉛濃度較高的地區(qū)，植物通過(guò)葉片的吸附和吸收作用積累鉛的可能性，要遠(yuǎn)大于通過(guò)根系吸收后再向地上部分轉(zhuǎn)移的可能性。鉛從大氣環(huán)境中向植物葉片內(nèi)部的轉(zhuǎn)移過(guò)程與葉片的表面形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[12]。植物葉片表皮上的角質(zhì)層小孔、氣孔以及排水孔道是大氣中鉛顆粒進(jìn)入葉片的關(guān)鍵途徑，而在這些途徑中，氣孔的進(jìn)入效率最高[13]。

植物根系對(duì)鉛的吸收可能涉及主動(dòng)和被動(dòng)兩種機(jī)制。大多數(shù)植物根系通過(guò)吸收在土壤中以溶解態(tài)的形式存在的鉛[14]，鉛在植物中的遷移率相對(duì)較低，大部分被植物吸收的鉛局限于根部，只有少量的鉛被輸送到芽中，這可能是由于內(nèi)胚層中卡氏帶的屏障作用，以及木質(zhì)部果膠等會(huì)阻礙鉛離子的運(yùn)輸[15]。鉛一旦被植物根系表面吸附，就有可能通過(guò)質(zhì)外體途徑和共質(zhì)體途徑兩種主要的細(xì)胞間運(yùn)輸途徑，進(jìn)入根的內(nèi)部。質(zhì)外體途徑涉及細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙，是一個(gè)非細(xì)胞質(zhì)的路徑。在質(zhì)外體途徑中，鉛可能與細(xì)胞壁的多糖（如纖維素、半纖維素和果膠）相互作用，這些多糖中含有可以與鉛離子形成絡(luò)合物的官能團(tuán)。質(zhì)外體途徑允許鉛在細(xì)胞間隙中相對(duì)快速地移動(dòng)，但最終可能需要跨越質(zhì)膜進(jìn)入共質(zhì)體途徑以進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸[16]；共質(zhì)體途徑涉及細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜連接的細(xì)胞間連絲。這是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的路徑，允許分子和離子在細(xì)胞之間直接移動(dòng)。對(duì)于鉛而言，共質(zhì)體途徑可能涉及特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些蛋白可以幫助鉛穿過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后通過(guò)共質(zhì)體途徑在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移[17]。

植物在鉛污染的情況下，會(huì)發(fā)生一系列的生理生化變化來(lái)響應(yīng)鉛脅迫，形成耐受機(jī)制。一般來(lái)說(shuō)，植物對(duì)鉛的耐受和解毒機(jī)制可通過(guò)外部屏障作用來(lái)排斥鉛的吸收，以及通過(guò)內(nèi)部生理調(diào)節(jié)來(lái)增強(qiáng)對(duì)鉛的耐受性[5]。植物通過(guò)根系的細(xì)胞壁和角質(zhì)層形成物理屏障，這些屏障能夠限制鉛離子的跨膜運(yùn)輸；當(dāng)植物接觸到重金屬毒性區(qū)域時(shí)，能夠通過(guò)抑制其根系的擴(kuò)展，有效減少與有毒重金屬的接觸面積，進(jìn)而減輕重金屬造成的損害[18]。細(xì)胞壁是鉛離子進(jìn)入植物細(xì)胞的第一道防線，在植物對(duì)鉛的耐性和解毒過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞壁中的組分（果膠、纖維素和木質(zhì)素等），含有大量的負(fù)電基團(tuán)，這些負(fù)電基團(tuán)可通過(guò)吸附（通過(guò)靜電作用吸附帶正電的鉛離子）、絡(luò)合（與鉛離子形成絡(luò)合物）、沉淀（與鉛離子反應(yīng)生成不溶性的沉淀物）等方式與鉛離子發(fā)生相互作用，能夠有效抑制其進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，從而降低了鉛對(duì)植物細(xì)胞的毒性[3]。除細(xì)胞壁外，質(zhì)膜作為細(xì)胞的外層界限，也為細(xì)胞提供了一個(gè)物理屏障。質(zhì)膜的脂質(zhì)雙分子層對(duì)大多數(shù)離子和大分子是不可滲透的，這有助于限制鉛離子的進(jìn)入。同樣，質(zhì)膜表面帶有負(fù)電荷（磷酸基團(tuán)），這些負(fù)電荷區(qū)域能夠吸附帶正電的鉛離子，減少了鉛離子通過(guò)膜的機(jī)會(huì)。植物細(xì)胞內(nèi)的液泡含有多種有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和生物堿等成分，這些能夠與鉛離子形成絡(luò)合物[19]，而植物細(xì)胞內(nèi)部的液泡可以通過(guò)液泡膜上的特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如HMA（重金屬ATP酶）家族蛋白，將鉛離子泵入液泡中，從而降低其對(duì)細(xì)胞的毒性[20]。

?；o酶A結(jié)合蛋白（ACBPs）是一類在脂類代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，這類蛋白含有一個(gè)高度保守的?；o酶A結(jié)合域（ACB），其在不同物種間保持功能上的一致性。ACB能夠與碳鏈長(zhǎng)度介于C12至C26之間的?；o酶A分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這種穩(wěn)定性對(duì)確保脂肪酸代謝過(guò)程中生化反應(yīng)的順利進(jìn)行至關(guān)重要[21]。植物ACBPs可以在不同的組織中表達(dá)，響應(yīng)非生物和生物脅迫，并被分類到不同的亞細(xì)胞位置[22]。在植物中，根據(jù)ACBPs的結(jié)構(gòu)和功能，可將其分為4個(gè)主要類別：分別是只含有一個(gè)ACB域的小分子質(zhì)量的ACBPs（Small ACBPs）；含有N端ACB域和C端ankyrin結(jié)構(gòu)域的大分子質(zhì)量ACBPs（ANK-ACBPs）；只含有一個(gè)ACB域的大分子質(zhì)量ACBPs（Large ACBPs）；含有N端ACB域和C端kelch結(jié)構(gòu)域的大分子質(zhì)量ACBPs（Kelch ACBPs）[23]。

植物中的?；o酶A結(jié)合蛋白對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的平衡至關(guān)重要，該蛋白能夠參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程，而且還能夠響應(yīng)多種生物和非生物脅迫，包括重金屬、氧化應(yīng)激、低溫以及病原體的侵襲等，對(duì)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育與逆境應(yīng)答具有重要作用[24]。擬南芥ACBPs基因家族中的AtACBP1和AtACBP2能夠結(jié)合卵磷脂（lecithin）和酰基輔酶脂類（Acyl-CoA），并參與長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的合成[25]；AtACBP1和AtACBP2被鉛離子、鎘離子、銅離子等重金屬離子脅迫時(shí)，表達(dá)水平上升，并通過(guò)與亞油酰輔酶A（linoleoyl-CoA）和亞麻酰輔酶A（linolenoyl-CoA）結(jié)合，參與到細(xì)胞膜的修復(fù)過(guò)程[26]；過(guò)表達(dá)AtACBP2可以增強(qiáng)擬南芥的抗旱能力[27]。此外，在水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，在干旱和高鹽條件下，OsACBP4的表達(dá)量迅速升高；在種子形成的過(guò)程中，OsACBP5的表達(dá)量顯著升高，OsACBP6對(duì)傷害（如機(jī)械損傷或病理傷害）非常敏感[28]，并且是目前已知唯一定位于過(guò)氧化物酶體的ACBP。過(guò)氧化物酶體是β-氧化的唯一場(chǎng)所，所以此發(fā)現(xiàn)意味著OsACBP6可能為脂類的降解運(yùn)送了底物[29]。由此可見(jiàn)，ACBPs基因家族在幫助植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫中具有重要作用。

中國(guó)沙棘是我國(guó)及世界的重要經(jīng)濟(jì)作物，目前關(guān)于中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的信息較為缺乏，因此開(kāi)展中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的全基因組鑒定以及分析其在鉛脅迫下的表達(dá)模式和功能具有重要意義。筆者基于中國(guó)沙棘的全基因組對(duì)中國(guó)沙棘ACBPs基因家族進(jìn)行鑒定，篩選出8個(gè)ACBPs基因家族成員，并對(duì)該基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以及對(duì)不同濃度鉛脅迫下的基因表達(dá)量進(jìn)行分析，為初步解析中國(guó)沙棘響應(yīng)重金屬鉛脅迫的分子機(jī)制，以及通過(guò)基因工程手段培育重金屬鉛低積累性的新品種提供研究基礎(chǔ)和分子靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的鑒定及基本信息

從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)下載ACBPs基因結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫文件（PF00887），從國(guó)家基因庫(kù)核酸序列歸檔系統(tǒng)中獲取中國(guó)沙棘的全基因組、蛋白序列和注釋文件。利用Hmmer search腳本，以e值＜0.001為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)中國(guó)沙棘的全基因組蛋白序列進(jìn)行搜索，篩選獲得候選蛋白。隨后將候選蛋白序列文件提交至SMART數(shù)據(jù)庫(kù)和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行進(jìn)一步的保守結(jié)構(gòu)域比對(duì)確認(rèn)，并根據(jù)結(jié)果對(duì)中國(guó)沙棘該家族的8個(gè)成員進(jìn)行命名，分別為HrLACBPs1～HrLACBPs8。利用ExPASy網(wǎng)站和WoLF PSORT網(wǎng)站，分析中國(guó)沙棘ACBPs家族蛋白的蛋白長(zhǎng)度、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)，以及預(yù)測(cè)該家族成員的亞細(xì)胞定位。

1.2 中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的多序列比對(duì)和基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA 7.0軟件的ClustalW功能，對(duì)下載的中國(guó)沙棘蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，將對(duì)比的結(jié)果導(dǎo)入GeneDoc軟件分析保守結(jié)構(gòu)域，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行美化。將鑒定出的8個(gè)中國(guó)沙棘ACBPs基因家族成員的序列，以及該家族成員基因進(jìn)化樹(shù)的nwk文件，上傳至基因結(jié)構(gòu)展示服務(wù)器（GSDS）進(jìn)行可視化分析，得到中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化樹(shù)的組合圖。

1.3 中國(guó)沙棘ACBPs基因家族系統(tǒng)發(fā)育及Motif分析

從JGI數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥、向日葵的ACBPs蛋白序列文件，從Figshare數(shù)據(jù)庫(kù)中下載翅果油樹(shù)（Elaeagnus mollis Diels）的全基因組、蛋白序列和注釋文件，并通過(guò)ACBPs基因結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫文件（PF00887），篩選得出10個(gè)翅果油樹(shù)ACBPs蛋白。將中國(guó)沙棘、擬南芥、翅果油樹(shù)、向日葵4種植物的ACBPs基因家族成員的蛋白質(zhì)序列放到同一個(gè)文件中，導(dǎo)入到MEGA 11.0軟件中進(jìn)行ClustalW比對(duì)、參數(shù)默認(rèn)，比對(duì)完成之后剪切差異太大的序列。利用MEFA軟件的Neighbor-Joining（鄰接法）構(gòu)建多物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。將系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的nwk文件提交Evolview網(wǎng)站進(jìn)行可視化分析與美化處理。利用MEGA網(wǎng)站，設(shè)置搜索參數(shù)為10，對(duì)該家族的蛋白保守基序（motif）進(jìn)行預(yù)測(cè)，并將預(yù)測(cè)結(jié)果文件與該家族成員基因進(jìn)化樹(shù)的nwk文件上傳到TBtools軟件，得到蛋白保守基序與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的組合圖。

1.4 中國(guó)沙棘ACBPs基因染色體定位、順式作用元件分析

利用Perl腳本從中國(guó)沙棘基因組的Gff注釋文件中提取ACBPs基因家族染色體的位置信息，通過(guò)Mapchart軟件可視化，并在Adobe Illustrator中進(jìn)行美化處理。從中國(guó)沙棘ACBPs基因家族中提取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前2000個(gè)堿基對(duì)的DNA序列，作為啟動(dòng)子區(qū)域，利用PlantCare網(wǎng)站，分析該家族啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。

1.5 中國(guó)沙棘ACBPs基因共線性、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用TBtools中的相關(guān)插件分析中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的染色體長(zhǎng)度信息、基因關(guān)聯(lián)信息以及基因在染色體上的位置，再利用Advanced Circos插件進(jìn)行繪圖，得到中國(guó)沙棘ACBPs基因家族物種內(nèi)的共線性，并根據(jù)擬南芥和翅果油樹(shù)的基因組文件和Gff注釋文件進(jìn)行分析，得到中國(guó)沙棘與擬南芥、翅果油樹(shù)ACBPs基因家族物種間的共線性。通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)確定中國(guó)沙棘ACBPs基因家族與擬南芥中相應(yīng)基因之間的蛋白互作關(guān)系。獲得互作關(guān)系后，利用Cytospace軟件對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.6 中國(guó)沙棘ACBPs蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采取同源建模（homology modeling）的方法對(duì)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，相似的氨基酸序列對(duì)應(yīng)著相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用在線工具SWISS-MODEL，找到與目標(biāo)序列同源的已知結(jié)構(gòu)作為模板（目標(biāo)序列與模板序列的一致度至少要達(dá)到30%），選定好蛋白質(zhì)模型下載PDB文件，然后提交至SAVES網(wǎng)站進(jìn)行測(cè)評(píng)（提供5個(gè)軟件的評(píng)估結(jié)果），其中有3個(gè)顯示通過(guò)即表示預(yù)測(cè)結(jié)果可信度較高。進(jìn)行上述生物信息學(xué)分析的在線工具網(wǎng)址如表1所示。

1.7 中國(guó)沙棘ACBPs基因家族轉(zhuǎn)錄組分析和qRT-PCR驗(yàn)證

選取生長(zhǎng)狀況良好的中國(guó)沙棘幼苗，并對(duì)其進(jìn)行不同濃度的硝酸鉛脅迫：對(duì)照組（不含硝酸鉛）、500、1000、2000、5000 mg·kg-1，脅迫4周。使用DP452型號(hào)的RNA提取試劑盒（由天根公司提供）提取幼苗中的總RNA。將中國(guó)沙棘幼苗送至武漢邁特維爾生物科技有限公司，進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，基于ACBPs基因的FPKM值（每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的fragments），使用TBtools軟件繪制表達(dá)量熱圖，以展示基因表達(dá)的變化。

使用天根KR118試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。針對(duì)HrLACBPs家族的8個(gè)基因，通過(guò)上海生工生物工程股份有限公司合成特異性引物（表2）。選用微管蛋白（TUBULIN）作為內(nèi)參基因，采用SYBR Green（FP215，天根）染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，試驗(yàn)的反應(yīng)體系為20 μL，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。使用2-ΔΔCt計(jì)算中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的相對(duì)表達(dá)量，并使用GraphPad prism軟件對(duì)qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的鑒定及基本信息

通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)中國(guó)沙棘ACBPs基因家族進(jìn)行鑒定，得到8個(gè)ACBPs基因家族成員，并對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度范圍為71 AA（HrLACBPs3）～677 AA（HrLACBPs7）；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為7995.1 Da（HrLACBPs3）～74498.7 Da（HrLACBPs7）；其理論等電點(diǎn)介于4.22（HrLACBPs4）～7.53（HrLACBPs5）之間，其中堿性氨基酸（pI＞7）較少，只有一個(gè)（HrLACBPs5），剩余7個(gè)均為酸性氨基酸。根據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析，中國(guó)沙棘ACBPs基因家族蛋白質(zhì)的分布也呈現(xiàn)多樣性。HrLACBPs1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，HrLACBPs3定位在細(xì)胞質(zhì)，HrLACBPs4定位在葉綠體，而其他蛋白質(zhì)則定位于細(xì)胞核。

2.2 中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育

在先前的研究中，ACBPs基因家族中的兩個(gè)保守基序YKQA和KWDAW被認(rèn)為是結(jié)合酰基輔酶A酯的必要基序。多重序列比對(duì)分析表明（圖1），8個(gè)ACBPs的氨基酸序列中也發(fā)現(xiàn)了這兩個(gè)保守基序。

通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)對(duì)中國(guó)沙棘（8個(gè)）、擬南芥（6個(gè)）[28]、翅果油樹(shù)（10個(gè)）、向日葵（8個(gè)）[30]的ACBPs蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，這些植物中的ACBPs蛋白可根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分支情況分為四大類（Group1～Group4）（圖2）。在各個(gè)類別中，ACBPs蛋白的成員數(shù)量存在差異。Group1含有3個(gè)中國(guó)沙棘ACBPs成員，Group2中含有1個(gè)中國(guó)沙棘ACBPs成員，Group3和Group4中都含有2個(gè)中國(guó)沙棘ACBPs成員。同時(shí)，通過(guò)系統(tǒng)樹(shù)可以發(fā)現(xiàn)翅果油樹(shù)的evm.model.LG01.147單獨(dú)分為了一類，通過(guò)進(jìn)一步的理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白在翅果油樹(shù)的10個(gè)ACBPs蛋白中等電點(diǎn)最低，為酸性蛋白質(zhì)，猜測(cè)該蛋白可能進(jìn)化出了新的功能，具體功能尚需進(jìn)一步研究。

2.3 中國(guó)沙棘ACBPs基因家族基因結(jié)構(gòu)及Motif分析

中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析表明（圖3），中國(guó)沙棘8條ACBPs基因均含有外顯子結(jié)構(gòu)，其中Group3中所含外顯子數(shù)量最多，均為18個(gè)外顯子；Group2的HrLACBPs4含有外顯子數(shù)量最少，僅有2個(gè)；Group1中成員的外顯子數(shù)量為3～4個(gè)。由此可見(jiàn)，位于同一類別中的HrLACBPs家族成員的外顯子數(shù)量接近，呈現(xiàn)高度的序列相似性和保守性。

為進(jìn)一步了解中國(guó)沙棘ACBPs基因家族的特征，對(duì)ACBPs家族蛋白的Motif序列進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明（圖4），HrLACBPs家族編碼蛋白的10個(gè)Motif序列中，親緣關(guān)系較近的成員之間的Motif序列的位置分布更相似。所有的HrLACBPs成員都存在Motif1，表明Motif1在ACBPs基因家族中具有重要作用。此外，HrLACBPs6和HrLACBPs7缺失了Motif7序列，而在HrLACBPs2和HrLACBPs5均含有兩個(gè)Motif7序列，這表明了HrLACBPs家族基因在功能上也存在一定的差異。

2.4 中國(guó)沙棘ACBPs基因染色體定位和順式作用元件分析

中國(guó)沙棘ACBPs基因家族染色體定位結(jié)果表明（圖5），中國(guó)沙棘8個(gè)ACBPs基因分布于7條不同的染色體上，其中HrLACBPs5和HrLACBPs4位于4號(hào)染色體上，剩余6個(gè)基因分別位于1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、11號(hào)、12號(hào)染色體上。

對(duì)中國(guó)沙棘ACBPs基因家族順式作用元件進(jìn)行分析（圖6），重點(diǎn)選取了激素調(diào)控、分生組織表達(dá)和脅迫應(yīng)激相關(guān)的調(diào)控元件。其中激素調(diào)控相關(guān)的順式作用元件主要包括4種類型：促進(jìn)植物響應(yīng)脫落酸信號(hào)的ABRE元件、與水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的TCA-element元件、參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的TGA-element元件，以及與茉莉酸甲酯信號(hào)相關(guān)的TGACG-motif元件；植物體內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控也涉及到4種特定的順式作用元件：與低溫脅迫反應(yīng)相關(guān)的LTR元件、脅迫響應(yīng)元件STRE、涉及防御機(jī)制和應(yīng)激反應(yīng)的TC-rich元件，以及與傷害信號(hào)相關(guān)的WUN-motif元件；還有一類與分生組織特異性表達(dá)密切相關(guān)的順式作用元件，即CAT-box元件。

筆者所選取的9種順式作用元件在HrLACBPs基因家族成員的分布中呈現(xiàn)差異性。具體來(lái)說(shuō)，HrLACBPs8含有最多的響應(yīng)元件，共計(jì)10個(gè)；而HrLACBPs3最少，僅有2個(gè)。從響應(yīng)元件的類型來(lái)看，HrLACBPs家族成員普遍包含3種或以上的元件。由此推測(cè)HrLACBPs家族成員可能具有多重生物學(xué)功能。在HrLACBPs1中發(fā)現(xiàn)含有與低溫脅迫反應(yīng)相關(guān)的元件（LTR），這表明HrLACBPs1與AtACBP6類似，也可能參與響應(yīng)低溫脅迫，提高植物對(duì)低溫的耐受性[31]。

2.5 中國(guó)沙棘ACBPs基因共線性、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)中國(guó)沙棘ACBPs基因家族物種內(nèi)共線性分析結(jié)果表明（圖7），在chr1、chr2、chr3、chr4、chr5、chr11和chr12上各分布有一些具有共線性的ACBPs基因，分別是定位在chr1和chr12上的HrLACBPs1和HrLACBPs8；定位在chr5和chr11上的HrLACBPs6和HrLACBPs7以及定位于chr2、chr3和chr4上的HrLACBPs2、HrLACBPs3和HrLACBPs5三個(gè)基因互有共線性。HrLACBPs4與其他7個(gè)基因均沒(méi)有共線性。中國(guó)沙棘ACBPs基因家族共線性分析結(jié)果表明，chr2、chr3和chr4之間存在較密切的共線性關(guān)系。

進(jìn)一步構(gòu)建中國(guó)沙棘ACBPs基因家族和擬南芥、翅果油樹(shù)的共線性分析（圖8），結(jié)果表明，中國(guó)沙棘ACBPs基因家族與擬南芥ACBPs基因家族之間存在9條共線性，而與中國(guó)沙棘同為胡頹子科的翅果油樹(shù)ACBPs基因家族之間存在17條共線性，分析發(fā)現(xiàn)，中國(guó)沙棘與翅果油樹(shù)ACBPs同源基因的數(shù)量要顯著多于中國(guó)沙棘與擬南芥ACBPs同源基因的數(shù)量，反映了胡頹子科ACBPs基因家族在進(jìn)化過(guò)程中的保守性和相似性。

基于擬南芥與中國(guó)沙棘蛋白的同源性，利用String數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行HrLACBPs家族蛋白的互作分析。根據(jù)Cytoscape中的degree值篩選出核心蛋白，如圖9所示，圓圈內(nèi)顏色的深淺代表不同互作強(qiáng)度，顏色深，代表與核心蛋白互作強(qiáng)度大，顏色淺，代表與核心蛋白互作強(qiáng)度??；圓圈之間的線條表示蛋白之間存在互作關(guān)系。根據(jù)結(jié)果可以看出，核心蛋白為擬南芥ACBPs基因家族的ACBP6，而ACBP6在冷脅迫下的應(yīng)答中起重要作用，其過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)植物的耐冷性。在冷脅迫條件下，ACBP6可能通過(guò)調(diào)控與冷脅迫相關(guān)的基因表達(dá)，參與脂類代謝中卵磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)，修復(fù)受損的細(xì)胞膜，從而提高植物對(duì)低溫的耐受性[32]，而中國(guó)沙棘ACBPs基因家族中HrLACBPs1也存在低溫脅迫的順式作用元件。這表明中國(guó)沙棘的HrLACBPs1可能在低溫脅迫響應(yīng)中起重要作用，與擬南芥ACBPs基因家族的ACBP6在功能上可能存在一定的相似性或相互作用。

2.6 中國(guó)沙棘ACBPs蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

基于同源建模原理，對(duì)中國(guó)沙棘ACBPs基因家族進(jìn)行了蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明（圖10），Group3中的蛋白結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，且結(jié)構(gòu)模型相似度較高；Group1中的蛋白氨基酸序列較短且結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，主要由α螺旋組成，同時(shí)伴有一些β轉(zhuǎn)角，這些蛋白的結(jié)構(gòu)模型也展現(xiàn)出較高的相似性；Group2的HrLACBPs4，蛋白結(jié)構(gòu)模型也較為簡(jiǎn)單，相較于Group1中的蛋白模型，具有更多的α螺旋；Group4中的蛋白模型相似度較低，HrLACBPs1存在一條長(zhǎng)而彎曲的鏈狀結(jié)構(gòu)。這表明中國(guó)沙棘ACBPs基因家族在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了一定程度的變異和分化，也暗示ACBPs基因在功能上具有一定的多樣性。

2.7 中國(guó)沙棘ACBPs基因家族轉(zhuǎn)錄組分析和qRT-PCR驗(yàn)證

選取生長(zhǎng)狀況良好的中國(guó)沙棘幼苗，并對(duì)其進(jìn)行不同濃度的硝酸鉛脅迫，脅迫4周后，將中國(guó)沙棘幼苗送至武漢邁特維爾生物科技有限公司，進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序。中國(guó)沙棘ACBPs基因家族測(cè)序結(jié)果表明（圖11），HrLACBPs家族成員在鉛脅迫條件下，表達(dá)量均發(fā)生了不同程度的變化。與對(duì)照相比，HrLACBPs1在低濃度鉛脅迫（500～1000 mg·kg-1）時(shí)，表達(dá)量下降，但在高濃度鉛脅迫（2000～5000 mg·kg-1）時(shí)，表達(dá)量上升；HrLACBPs2、HrLACBPs3、HrLACBPs5、HrLACBPs6以及HrLACBPs8在鉛脅迫濃度為500～2000 mg·kg-1時(shí)，表達(dá)量下調(diào)，但在鉛脅迫為5000 mg·kg-1下的表達(dá)量相對(duì)升高；HrLACBPs4隨著鉛脅迫濃度的升高，表達(dá)量呈先升高后下降的趨勢(shì)。

qRT-PCR的驗(yàn)證結(jié)果（圖12）與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析的結(jié)果基本一致。除了HrLACBPs1外，其他基因在與同基因其他樣本的對(duì)比中，在鉛脅迫濃度為2000 mg·kg-1下的表達(dá)量均較低，甚至HrLACBPs2和HrLACBPs3在Pb2000濃度時(shí)幾乎不表達(dá)；而HrLACBPs家族基因在鉛脅迫濃度為5000 mg·kg-1時(shí)相對(duì)表達(dá)量均會(huì)升高。通過(guò)分析可以推測(cè)中國(guó)沙棘面臨重金屬鉛脅迫時(shí)，HrLACBPs基因家族的成員有不同的表現(xiàn)，都可以在一定程度上響應(yīng)重金屬鉛離子脅迫。

3 討 論

目前，在已知的植物ACBPs基因家族的研究中發(fā)現(xiàn)，除了一些多倍體植物ACBPs基因家族數(shù)量較多外，例如，陸地棉（24個(gè)）、白菜（20個(gè)）、歐洲油菜（45個(gè)）等，二倍體植物ACBPs基因家族數(shù)量較少，例如，毛果楊（7個(gè)）、擬南芥（6個(gè)）、水稻（6個(gè)）、高粱（5個(gè)）、玉米（5個(gè)）等[32]。筆者在本研究中對(duì)二倍體植物中國(guó)沙棘的ACBPs基因家族進(jìn)行篩選得到8個(gè)基因，與其他二倍體植物ACBPs基因家族的數(shù)量總體相近。

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可將中國(guó)沙棘ACBPs基因家族分為4組。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)中國(guó)沙棘ACBPs家族中Group3的成員含有最多的外顯子數(shù)量，這一特征可能增加了選擇性剪接的發(fā)生概率，進(jìn)而增加了ACBPs基因家族功能的多樣性[33]。順式作用元件對(duì)許多生物過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要[34]，在順式作用元件的分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)HrLACBPs啟動(dòng)子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了參與對(duì)傷害信號(hào)、水楊酸和脫落酸信號(hào)響應(yīng)的元件。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，中國(guó)沙棘ACBPs蛋白主要定位在細(xì)胞核中，在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中也有分布。這表明HrLACBPs家族成員可能參與調(diào)控基因表達(dá)、脂質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、中長(zhǎng)鏈?；o酶A（acyl-CoA）的轉(zhuǎn)運(yùn)以及葉綠體生物膜的修復(fù)和維持等。此外，已有的研究表明，擬南芥ACBPs家族成員蛋白多數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)，在水稻中，ACBPs家族成員可定位于細(xì)胞質(zhì)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及定位于過(guò)氧化物酶體的OsACBP6[29]。

轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析與qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照（0 mg·kg-1）相比，HrLACBPs家族的大部分基因在鉛濃度為500 mg·kg-1時(shí)表達(dá)量相對(duì)上升，在1000與2000 mg·kg-1時(shí)表達(dá)量大幅度下降，而在5000 mg·kg-1時(shí)表達(dá)量上升。這可能是由于低濃度的鉛脅迫（500 mg·kg-1）對(duì)植物造成的氧化應(yīng)激較小，植物可以通過(guò)增強(qiáng)基因的表達(dá)量，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗氧化防御機(jī)制，從而增強(qiáng)對(duì)鉛的耐受性[35]；而隨著鉛脅迫濃度增加到1000～2000 mg·kg-1時(shí)，可能會(huì)超過(guò)植物對(duì)鉛的耐受閾值，導(dǎo)致植物無(wú)法響應(yīng)高濃度的鉛脅迫，因此基因的表達(dá)量會(huì)大幅度降低[36]；但在極高濃度的鉛脅迫（5000 mg·kg-1）下，植物可能會(huì)啟動(dòng)另一種響應(yīng)機(jī)制，包括重金屬的隔離、儲(chǔ)存或排出，以及修復(fù)受損細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基因上調(diào)[37]，導(dǎo)致基因的表達(dá)量上升。此外，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的HrLACBPs1在低濃度鉛脅迫（500 mg·kg-1）時(shí)的表達(dá)量相較于對(duì)照有所下降，而在2000與5000 mg·kg-1時(shí)表達(dá)量逐漸上升。這表明基因表達(dá)的變化可能還與他們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的位置有關(guān)。定位于細(xì)胞核的基因，可能主要參與調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，而定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基因，可能與蛋白質(zhì)的折疊、修飾和運(yùn)輸以及脂質(zhì)合成、加工和運(yùn)輸有關(guān)。而HrLACBPs1表達(dá)量的不同，可能是因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)在感知到較低濃度的鉛脅迫時(shí)，會(huì)減少基因的表達(dá)以減少蛋白質(zhì)的合成負(fù)荷，在更高濃度脅迫時(shí)，則可能提高表達(dá)量以應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)損傷的積累。上述解釋是基于一般生物學(xué)原理和已有的科學(xué)研究提出的假設(shè)，如果要準(zhǔn)確解釋這些qRT-PCR分析結(jié)果，還需要更詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和更深入的分子機(jī)制研究。

4 結(jié) 論

中國(guó)沙棘基因組中鑒定到8個(gè)HrLACBPs基因，不均勻分布在7條染色體上，這些基因分為4個(gè)類別且大部分基因預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核中；同一類別家族成員基因結(jié)構(gòu)與Motif序列相似；Group1的基因成員之間具有較高的共線性；相比于擬南芥ACBPs基因家族，中國(guó)沙棘ACBPs基因家族與翅果油樹(shù)ACBPs基因家族表現(xiàn)出更高的共線性；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，中國(guó)沙棘ACBPs基因家族同一類別的成員三維結(jié)構(gòu)相似；不同濃度重金屬鉛離子脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析表明，8個(gè)HrLACBPs基因在不同濃度的鉛脅迫條件下存在表達(dá)差異，可能通過(guò)不同的分子機(jī)制響應(yīng)重金屬鉛離子脅迫。

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