梨亞科5個屬S-RNase基因的序列特征及進化分析

摘" " 要：【目的】分析梨亞科5個屬S-RNase基因序列特征及其進化規(guī)律?！痉椒ā渴占疓enBank數(shù)據(jù)庫中5個屬S-RNase基因CDS全長、大于330 bp的外顯子片段以及內(nèi)含子序列，剔除重復序列后，利用MEGA11軟件對其進行序列和多態(tài)性分析，并利用多序列比對結(jié)果構建系統(tǒng)進化樹；計算S-RNase基因RSCU值，以歐式平方距離作為基因間進化距離進行聚類分析。利用MEGA11軟件計算梨亞科5個屬S-RNase基因序列堿基組成及密碼子使用偏好?！窘Y(jié)果】GenBank數(shù)據(jù)庫中剔除重復序列后，共收錄梨亞科5個屬S-RNase基因CDS全長序列90條，長度范圍為678～711 bp；大于330 bp的外顯子片段序列有140條。梨亞科5個屬S-RNase基因序列各區(qū)域分析表明：C2-HV、C4-C5、C5-和HV區(qū)存在較多的共性特征；編碼區(qū)、內(nèi)含子、密碼子使用偏好聚類的進化樹均沒有明顯種和屬的界限。S-RNase基因3個位置的堿基含量均呈現(xiàn)A+T大于C+G，HV區(qū)3個位置CG分布較為一致。【結(jié)論】梨亞科5個屬S-RNase基因除了HV區(qū)，C2-HV、C4-C5和C5-也具備參與S位點識別的可能性。同時，梨亞科5個屬S-RNase基因的分化早于5個屬的分化時間且S-RNase基因密碼子存在一定的偏好。

關鍵詞：梨亞科；雌蕊S基因；序列特征；密碼使用偏好；進化分析

中圖分類號：S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2025）03-0462-14

Sequence characterization and evolutionary analysis of S-RNase gene among five genera Pomoideae

LIANG Wenjie1， XIE Zhiliang1， Wuyun Tana2

（1Wenzhou Vocational College of Science and Technology， Wenzhou 325006， Zhejiang， China; 2 Research Institute of Non-Timber Forestry of Chinese Academy of Forestry， Zhengzhou 450003， Henan， China）

Abstract： 【Objective】 In order to avoid self-pollination， self-incompatibility is a common phenomenon in 5 genera in Pyridae fruit trees during evolution. In order to understand the latest isolation and identification of S-RNase gene in pear incompatibility， we analyzed its sequence characteristics and evolutionary rules. 【Methods】 The keywords Malus S-RNase complete cds， Pyrus S-RNase complete cds， Cydonia S-RNase complete cds， Crataegus S-RNase complete cds and Eriobotrya S-RNase complete cds were searched for the full-length CDS sequence of pear S-RNase gene in the GenBank database of NCBI. And the Blast tool was use to search and supplement. After the initial identification of the searched sequences， the sequence analysis was performed using VectorNTI11.5.3 software， and the duplicate sequences were manually corrected and eliminated. The Find Best DNA/Protein Models program of MEGA11 software was used to find out the optimal model suitable for the sequence of 5 genera of Pyridae S-RNase gene， and the corresponding model and algorithm were used to calculate the differentiation between the sequences. Tajima's Test of Neutrality under Selection was used to calculate genetic polymorphisms， and the sequences of signal peptide， C1-C5， HV region and other relevant regions were analyzed respectively. The nucleotide composition and Compute codon usage bias programs of MEGA11 software were used to calculate the base composition and relative synonymous of the S-RNase gene sequence of 5 genera of Pyridae codon usage value. The ClustalW program of MEGA11 software was used to compare the CDS full-length sequence of 5 genera in Pyridae S-RNase gene. The phylogenetic tree of gene coding region was constructed by NJ in distance method， and the reliability test was performed 1000 times by Bootsrap. SPSS22 was used to cluster the S-RNase gene RSCU of 5 genera of Pyridae using Euclidean square distance as inter-gene evolutionary distance. 【Results】 At present， 120 CDS full-length sequences of 5 genera in Pyridae S-RNase gene were included in GenBank database， and 90 CDS sequences were removed. There were 51 genes from pears， 35 genes from apples， 1 gene from quince， 1 gene from loquat and 2 genes from hawthorn. The sequence analysis showed that the total length of CDS sequence of the S-RNase gene in 5 genera in Pyridae was 678-711 bp. There were 1 gene length of 678 bp， 17 for 681 bp， 26 for 684 bp， 33 for 687 bp， 6 for 690 bp， 7 for 699 bp， and 1for 711 bp. The polymorphism of the S-RNase gene signal peptide， HV， C3-C4 sequence length of pear subfamily showed certain polymorphism， and the HV region had the largest change， followed by the signal peptide region， C3-C4， and the rest of the sequence length did not change. The signal peptide region was mainly replaced， followed by deletion and insertion. The deletion of HV region was much more than the insertion. There was also an insertion of C3-C4. The intron sequence size of the HV region ranged from 109 bp to 3130 bp， which had rich length polymorphism. The A， T， C and G components of the S-RNase gene in 5 genera of Pyridae were significantly different， and the conversion/transmutation ratio was less than 1 in only C2-HV and HV regions， and greater than 1 in other regions. Considering the number of positives， the two indexes of genetic polymorphism Θ， π and Tajima test statistic D， the C2-HV， C4-C5 and C5- regions might be involved in the identification of pollen S gene. The pear subfamily S-RNase did not form distinct genetic differentiation by genus or species. The differentiation distance between apple and pear was smaller than that within the genus， and the distance between apple， pear and hawthorn was the closest. The S-RNase gene of the pear subfamily also did not form a distinct species-specific boundary， and was found in hawthorn， apple， begonia， and flowering begonia P. pyrifolia， P. bretschneideri， P. communis and P. ussuriensis showed that the genetic differentiation distance between species was smaller than that between species. The codon use preference analysis showed that there were 5 high frequency codons and 20 preference codons in 5 genera in Pyridae S-RNase gene， and the stop codon was TAA. The content of bases at the first and second positions of the codon was relatively consistent， that is， A was dominant， and T was dominant at the third position， and the bases at the three positions were A+T greater than C+G. The four bases were not randomly arranged in this gene， and there was a certain bias. The phylogenetic tree constructed by the CDS sequence and codon of S-RNase genes of 5 genera of Pyridae showed that the S-RNases of different genera or species clustered together first， without obvious species or genus clustering. 【Conclusion】 At present， a total of 90 CDS full-length sequences of the S-RNase genes of 5 genera of Pyridae without duplication were recorded in GenBank. It was found that in addition to the recognized HV region with pollen recognition features， other regions also showed similar features; The phylogenetic tree generated by gene coding sequence and codon preference showed no genus or species-specific clustering， indicating that the S-RNase gene differentiation in 5 genera of Pyridae was earlier than that among different genera. The codon preference reflected the abundance of transfer RNA and the frequency of different nucleotides used in genes to some extent. Most of the S-RNase codons ending with C and G bases had low RSCU value， indicating that the four bases would not be randomly arranged in this gene， and there would be a certain bias， and the codon ending with A/T would be preferred.

Key words： Pomoideae; S-RNase; Sequence feature; Codon usage bias; Evolution analysis

梨亞科（Pomoideae）中梨屬（Pyrus L.）、蘋果屬（Malus Mill.）、枇杷屬（Eriobotrya Lindl.）、山楂屬（Crataegus L.）和榅桲屬（Cydonia Mill.）中有許多人們喜歡食用的康養(yǎng)果品，如梨（Pyrus L.）[1]、蘋果（Malus domestica Borkh.）[2]、枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.][3]、山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）[4]和榅桲（Cydonia oblonga Mill.）[5]等。這些果樹在進化過程中為了避免自花授粉，普遍存在自交不親和現(xiàn)象[6-7]，其自交不親和現(xiàn)象由雌蕊S-RNase和花粉F-box（SFBB）相互作用實現(xiàn)[6-8]。

根據(jù)已有梨亞科5個屬S-RNase基因一級結(jié)構特征[9]，其N端到C端分別為信號肽（Signal peptide，SP）、保守區(qū)（Conserved region）C1、保守區(qū)C2、高變區(qū)HV（High variable region，包含內(nèi)含子intron）、保守區(qū)C3、保守區(qū)C4、保守區(qū)C5。除了SP和保守區(qū)C1區(qū)外，其他相鄰區(qū)域間以及C5后面還存在其他序列，其中HV區(qū)被公認為是S-RNase基因特異識別的重要區(qū)域，同時該區(qū)域也是鑒定梨亞科5個屬S-RNase新基因的重要指標[9]。近些年，隨著梨亞科5個屬越來越多的S-RNase基因被分離鑒定，其基因進化也逐漸成為研究的熱點之一。目前，關于梨亞科5個屬S-RNase基因進化的相關研究較少，且研究多以S-RNase基因序列片段為基礎[10]。近些年隨著測序技術的不斷完善，梨亞科5個屬的S-RNase基因CDS（Coding Sequence）全長序列被分離鑒定；有誤序列得到了更正[11]。因此，有必要利用最新數(shù)據(jù)對現(xiàn)有梨亞科5個屬的S-RNase基因序列特征和進化情況進行研究，以便反映更真實的情況。筆者在本研究中收集整理梨亞科5個屬S-RNase基因CDS全長序列、大于330 bp的S-RNase基因外顯子片段序列和intron序列，分析其序列特征和密碼子使用情況。同時，利用其基因CDS全長、intron序列和密碼子使用偏好分別構建進化樹，從3個方面反映其進化情況。通過對梨亞科5個屬最新數(shù)據(jù)的整理和分析，可以為研究者提供精準的S-RNase基因數(shù)據(jù)；研究發(fā)現(xiàn)新的序列位點符合參與自交不親和識別的特征，為目前陷入停滯的梨亞科自交不親和研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2024年4月10日前NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的梨亞科蘋果屬、梨屬、榅桲屬、山楂屬、枇杷屬S-RNase基因CDS全長序列、大于330 bp的S-RNase基因外顯子片段序列以及HV區(qū)內(nèi)含子序列。

1.2 試驗方法

1.2.1 序列獲取 全長序列分別采用關鍵詞Malus S-RNase complete cds，Pyrus S-RNase complete cds，Cydonia S-RNase complete cds，Crataegus S-RNase complete cds和Eriobotrya S-RNase complete cds進行搜索，并利用Blast工具進行搜索補充；大于330 bp的外顯子片段序列也采用上述方法，其中的complete替換為partial。

1.2.2 基因序列分析 利用VectorNTI11.5.3軟件進行基因序列分析，并人工加以糾正。

1.2.3 梨亞科5個屬S-RNase基因分化及多態(tài)性 利用MEGA11軟件分別篩選出梨亞科5個屬S-RNase基因CDS全長序列、片段序列和intron序列適合的最佳數(shù)學模型，選擇該模型計算各序列分化數(shù)據(jù)，同時利用Tajima’s Test計算各序列的遺傳多態(tài)性。

1.2.4 密碼子使用偏好分析 利用MEGA11軟件自帶Compute nucleotide composition和Compute codon usage bias程序分別計算序列堿基組成比例情況和RSCU（Relative synonymous codon usage）值。

1.2.5 系統(tǒng)進化分析 用MEGA11軟件的ClustalW程序?qū)鎭喛?個屬S-RNase基因CDS全長序列和HV區(qū)內(nèi)含子序列分別作序列比對，利用鄰接法分別構建二者的進化樹；利用SPSS22對其CDS全長序列RSCU以歐式平方距離作為基因間進化距離進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列分析

2.1.1 外顯子序列分析 GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄梨亞科5個屬S-RNase基因CDS全長序列120條，剔除重復序列后共90條。GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄梨亞科5個屬S-RNase基因大于330 bp的外顯子片段序列140條，其中梨屬51條，蘋果屬35條，榅桲屬5條，枇杷屬29條，山楂屬20條。分析梨亞科5個屬90條S-RNase基因CDS全長序列，結(jié)果（表1）顯示其長度為678～711 bp。其中678 bp 1條，681 bp 17條，684 bp 26條，687 bp 33條，690 bp 6條，699 bp 7條，711 bp 1條，平均長度為686 bp。由表1可以看出，梨亞科5個屬S-RNase基因SP、HV、intron、C3-C4（C3、C4間）和C5-區(qū)域序列長度存在多態(tài)性，且以intron變化最大，其次為HV、C5-、SP、C3-C4，其余部位序列長度均無變化。SP序列長度：81 bp 77條，84 bp 2條，78 bp 9條，75 bp 2條，SP區(qū)域主要發(fā)生替換，其次為缺失和插入；HV區(qū)序列長度：57 bp 7條，48 bp 5條，45 bp 53條，42 bp 13條，39 bp 12條，該區(qū)域發(fā)生缺失的現(xiàn)象遠大于插入的情況；分布在HV區(qū)的intron序列大小為109～3130 bp，具有豐富的長度多態(tài)性；C5-序列長度：126 bp 4條，129 bp 16條，132 bp 60條，135 bp 9 條，156 bp 1條，主要發(fā)生為缺失和插入；另外C3-C4也出現(xiàn)一處插入的情況。

梨亞科5個屬S-RNase基因各區(qū)域的A、T、C、G組成有較大差異，其轉(zhuǎn)換/顛換比值僅有C2-HV和HV區(qū)小于1，其余位置均大于1，綜合保守位點、變異位點、簡約信息位點以及單突變位點情況，C2-HV和HV區(qū)數(shù)值最接近。5個保守區(qū)保守位點占比由大到小分別為：C2、C3、C1、C5、C4；外顯子各部位序列變異位點占比由大到小分別為C2-HV、HV、SP、C4-C5、C3-C4、C5-、C1-C2、HV-C3。

2.1.2 intron序列分析 梨亞科5個屬90條S-RNase基因全長CDS序列共登錄HV區(qū)內(nèi)含子序列83條，其余7條未登錄內(nèi)含子信息的基因均為蘋果屬S-RNase基因mRNA序列；140條片段序列對應121條內(nèi)含子序列，包含梨屬51條，蘋果屬34條，榅桲屬5條，枇杷屬29條，山楂屬2條，其余為mRNA序列，未登錄內(nèi)含子序列。分析梨亞科5個屬S-RNase基因HV區(qū)內(nèi)含子序列（圖1），結(jié)果顯示其長度為109～3130 bp，平均長度為505 bp，具有豐富的長度多態(tài)性。其中151～200 bp占比最大，為31.33%；其次為100～150 bp，占比26.51%；其余長度區(qū)間占比均較小。內(nèi)含子均符合GT-AG法則，其中全長序列對應的內(nèi)含子序列還符合GTAA-CAG。內(nèi)含子序列T、C、A、G平均含量分別為T：39.1%，C：13.7%，A：35.2%，G：12.0%，內(nèi)含子保守位點占比僅為10.31%。

2.2 梨亞科5個屬S-RNase基因序列分化及多態(tài)性

由表2可以看出，梨亞科5個屬S-RNase基因CDS全長序列陽性位點數(shù)（dN-dS＞0位點）占比小于50%，不同部位區(qū)域中，大于全長序列陽性位點占比，由大到小分別為HV、SP、C4-C5；其中連續(xù)陽性位點數(shù)，C5-、C4-C5、SP超過HV，HV-C3與HV持平。

由表3反映的遺傳多態(tài)性的兩個指標Θ和π數(shù)值來看，梨亞科5個屬S-RNase基因的C2-HV、HV、HV-C3、C3-C4、C4-C5、C5-核苷酸多樣性指標π大于整條序列平均值，且其Tajima檢驗統(tǒng)計量D＞0，證明這些位置受平衡選擇的影響。綜合考慮Θ、π數(shù)值以及S值來看，C2-HV和HV最接近，其次是C4-C5。其中5個保守區(qū)以及intron、SP、C1-C2區(qū)D＜0，表明這些區(qū)域受定向選擇的影響。HV區(qū)π值最大，其次為C2-HV、C4-C5、C3-C4、C5-、HV-C3，這些區(qū)域的π均大于全長序列平均π值，5個保守區(qū)的Θ和π數(shù)值均偏小，π值越小說明DNA序列差異越小。

2.3 梨亞科5個屬不同類群S-RNase基因位點遺傳多態(tài)性和遺傳分化

由表4可以看出，梨亞科5個屬S-RNase基因CDS全長序列、序列片段和內(nèi)含子序列分化均沒有形成明顯的以屬為單位的界限，蘋果屬、梨屬、枇杷屬、榅桲屬、山楂屬序列均出現(xiàn)屬間分化距離小于屬內(nèi)的情況，CDS全長序列屬間分化距離0.198～0.275，屬內(nèi)分化距離為0.165～0.214；對應intron序列屬間分化距離0.145～0.323，屬內(nèi)分化距離為0.140～0.374；其中蘋果屬、梨屬S-RNase基因CDS全長序列均和山楂屬距離最近，而二者intron序列均與枇杷屬距離最近。梨亞科5個屬S-RNase基因也沒有形成明顯的以種為單位的界限，山楂、蘋果、海棠（M. spectabilis）、花葉海棠（M. transitoria）、砂梨（P. pyrifolia）、白梨（P. bretschneideri）、西洋梨（P. communis）、秋子梨（P. ussuriensis）CDS全長序列和intron序列均出現(xiàn)種間遺傳分化距離小于種內(nèi)的情況，其中CDS全長序列種間距離為0.160～0.275，種內(nèi)距離為0.165～0.228，intron種間距離為0.145～0.567，種內(nèi)距離為0.139～0.359。intron序列的平均分化距離是對應CDS全長分化距離的1.5倍。其中，花葉海棠和新疆梨，海棠和新疆梨，蘋果和山楂，砂梨和山楂，白梨和新疆野蘋果，秋子梨和海棠，西洋梨CDS全長序列和山楂距離較近，該結(jié)果和常規(guī)意義上植物親緣關系遠近不一致，表明梨亞科5個屬S-RNase基因分化早于屬的分化。內(nèi)含子的遺傳分化距離和編碼區(qū)在某些屬或種之間存在一定的相關性，但在另一些屬或種之間又呈現(xiàn)相互獨立的關系。序列片段的遺傳分化距離和全長序列的遺傳分化距離不存在嚴格的相關性，在有CDS全長序列的情況下，應優(yōu)先使用全長序列數(shù)據(jù)作為分析依據(jù)。

從圖2可以看出，梨亞科5個屬S-RNase基因遺傳分化距離在0.000～0.330之間，除HV和C2-HV各區(qū)域遺傳分化距離在0.000～0.600之間，不同位置的區(qū)間分布不同；5個保守區(qū)中，C2遺傳分化距離最為集中，0.000～0.150占100%；在此區(qū)間C1占比98.38%，C5占比77.85%，C4占比76.03%，C3占比80.60%，其他區(qū)域分布相對比較分散（圖2-A）。HV、C2-HV和intron區(qū)的遺傳分化距離較大，HV區(qū)的分化距離在-214 748 364.000～2.400，C2-HV區(qū)的分化距離在-214 748 364.000～1.200（圖2-B），intron區(qū)的分化距離在-214 748 364.000～2.196（圖2-C）。出現(xiàn)負值的情況是由MEGA11的算法所導致的，說明遺傳分化距離較大。相比較而言，HV區(qū)距離分布較為分散，C2-HV和intron分布則較為集中。

2.4 梨亞科5個屬S-RNase基因密碼子使用偏好

某一具體密碼子在編碼相應氨基酸的同義密碼子中的相對概率即為相對同義密碼子使用度（RSCU），是密碼子使用偏好性的直觀反映。當值為1時，密碼子無使用偏好；大于1，使用頻率較高；小于1，使用頻率較低。在梨亞科5個屬S-RNase基因密碼子RSCU表中（表5），26個密碼子RSCU值大于1，其中密碼子TTG、TCT、TCA、GCC、TAA的RSCU值大于1.5，是高頻密碼子，20個以T或A結(jié)尾的密碼子TTT、TTA、ATT、ATA、GTT、GTA、TCT、TCA、CCT、CCA、TAT、TAA、CAT、AAT、AAA、GAT、GAA、CGA、AGA、GGA為偏好密碼子；而結(jié)尾為C、G的密碼子RSCU值多數(shù)小于1，顯示此類密碼子利用率較低，TAA為終止密碼子。

由表6可以看出：梨亞科5個屬90條S-RNase基因，其屬間密碼子T、C、A、G平均含量分別為25.7%、21.7%、32.6%、20.1%；種間T-1、C-1、A-1、G-1分別為22.4%、19.8%、36.8%、21.0%；種間T-2、C-2、A-2、G-2分別為27.0%、22.5%、35.3%、15.3%；種間T-3、C-3、A-3、G-3分別為27.7%、22.6%、25.8%、23.9%。3個位置的堿基含量均符合A+T大于C+G，A、T、C、G堿基排列在梨亞科5個屬S-RNase基因中呈現(xiàn)一定的偏好。這種差異沒有以種或?qū)贋閱挝坏拿黠@區(qū)別。

由表7可以看出梨亞科5個屬S-RNase基因CG含量C1區(qū)最低，為30.3%，C3最高，為55.5%，其中HV區(qū)為42.3%。從具體分布看，SP、C2、HV、C5-均符合CG1＜CG2＜CG3。HV區(qū)CG分布較為一致，在40.1%～45.4%，與C5-、C2-HV、C4-C5數(shù)值接近。

2.5 梨亞科5個屬S-RNase進化分析

由梨亞科5個屬S-RNase基因CDS全長序列和其密碼子使用偏好分別構建的進化樹顯示（圖3）：砂梨、白梨、秋子梨、西洋梨、山楂、蘋果、海棠、花葉海棠等同屬或同種的S-RNase基因并沒有出現(xiàn)明顯的聚類。兩個進化樹中，山楂的兩條S-RNase基因均先與蘋果屬、梨屬的S-RNase聚成一類，蘋果屬S-RNase出現(xiàn)多次和梨屬聚成一類的現(xiàn)象，以種為單位的S-RNase基因聚類也是如此。不同屬或同屬不同種間的S-RNase基因相似性高于同屬或同種間基因相似性（圖3-A）。該結(jié)果表明梨亞科5個屬S-RNase的分化要早于各屬和各種的分化。進化樹分支結(jié)構存在一些相同的地方，密碼子使用偏好是物種進化過程中基因經(jīng)歷選擇和突變呈現(xiàn)的結(jié)果，根據(jù)其構建的進化樹體現(xiàn)了基因特定的進化歷程，是基因編碼序列進化樹良好的補充（圖3-B）。由梨亞科5個屬S-RNase基因HV區(qū)內(nèi)含子序列構成的進化樹（圖3-C）和其CDS全長序列進化樹更接近，二者出現(xiàn)多處的分枝結(jié)構基本一致的現(xiàn)象，說明這些基因的CDS序列與HV區(qū)內(nèi)含子序列進化具有相關性。

3 討 論

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，人們對梨亞科梨屬[1]、蘋果屬[2]、枇杷屬[3]、山楂屬[4]和榅桲屬[5]等果樹自交不親和系統(tǒng)的分子基礎進行了廣泛研究。作為其雌蕊S位點決定因子的S-RNase基因，其序列特征和進化機制一直是研究熱點之一[12-13]。根據(jù)研究梨亞科5個屬S-RNase基因結(jié)構由5個保守區(qū)和1個包含長度高度多態(tài)性的內(nèi)含子在內(nèi)的HV區(qū)組成[1-3]，HV區(qū)域長期以來被認為是雌蕊S-RNase基因識別雄蕊花粉S基因的關鍵位置[11-12]。梨亞科5個屬S-RNase基因HV區(qū)域陽性位點占比、連續(xù)陽性位點數(shù)以及Tajima檢驗統(tǒng)計量D也支持此觀點。近年來在肯定此觀點的同時，也逐漸有新的觀點，認為其他區(qū)域在花粉S基因識別中也可能起到重要作用。如西洋梨Sn和Si在HV區(qū)域有相同的氨基酸序列，但Sn花粉管的生長不受Si-RNase的抑制[12]，表明HV區(qū)域可能不足以單獨與花粉S蛋白進行選擇性相互作用，還可能存在其他區(qū)域在相互識別過程中發(fā)揮重要作用。一般認為這些區(qū)域顯示出非同義氨基酸取代多于同義取代，同時具有陽性選擇位點。在對梨亞科5個屬S-RNase基因各區(qū)域陽性位點和Tajima檢驗值分析時也發(fā)現(xiàn)了一些區(qū)域符合這一特征。還有學者研究發(fā)現(xiàn)西洋梨等位基因S6a與S6b的HV區(qū)完全一致，但二者其他區(qū)域存在14處氨基酸差異，認為二者應該定義為不同的S基因[11]。在蘋果中也發(fā)現(xiàn)了一對功能不同的S-RNase等位基因共享相同的HV區(qū)域，表明存在HV區(qū)域外的位置參與識別雄蕊花粉S基因的可能性[14]。梨亞科5個屬S-RNase基因的功能區(qū)域，特別是與花粉識別和反應相關的區(qū)域，可能受到正選擇的作用，以維持其在自交不親和反應中的有效性[14]。同時，基因的其他區(qū)域可能更加保守，以保持基因的基本結(jié)構和功能?；谧钚碌睦鎭喛?個屬S-RNase基因CDS全長序列中5個保守區(qū)的分析也支持這一觀點，其中C2區(qū)高度保守，90條序列中僅出現(xiàn)梨S32-RNase（EU336979.1）一處V變?yōu)镮的現(xiàn)象。研究還發(fā)現(xiàn)梨亞科5個屬S-RNase基因C2-HV、C4-C5、C5-無論是陽性位點、反映遺傳多態(tài)性的兩個指標Θ和π、Tajima檢驗統(tǒng)計量D值、CG含量及分布情況均與HV區(qū)上述指標接近。以已有的X-射線衍射獲得的梨S3-RNase三維晶體結(jié)構作為模型[15]，通過SWISS-Model和AlphaFold Protein Structure Database構建梨亞科5個屬S-RNase三維結(jié)構，分析HV區(qū)域位于分子的表面，C4-C5和C5-分別在三維結(jié)構中靠近活性位點裂縫的兩側(cè)，均是最容易和花粉S基因發(fā)生相互作用的有利位置。另外研究發(fā)現(xiàn)梨亞科5個屬S-RNase基因信號肽區(qū)域有較高的陽性位點和連續(xù)陽性位點，這令人疑惑。信號肽主要作用是引導S-RNase向細胞質(zhì)基質(zhì)分泌，并在受粉過程中進入花粉細胞，一般來說，信號肽在蛋白質(zhì)成熟以前就已經(jīng)被信號肽酶切除掉，最新的研究顯示信號肽會在蛋白的空間排列上起直接的作用[16-17]，是否梨亞科5個屬S-RNase的信號肽也有此作用需要進一步的研究來驗證。

5個屬均有一些自交親和的品種，自交親和的原因有多種[18-20]。枇杷S6-RNase基因C5-區(qū)與現(xiàn)有梨亞科S-RNase基因該區(qū)域存在1個24 bp的核苷酸序列插入，根據(jù)現(xiàn)有研究，含有該基因的枇杷品種均是自交親和品種，且有證據(jù)表明是由該插入導致了自交親和[21]。閆莊梨中的S21-RNase基因C2區(qū)1個保守的G被V所取代，改變活性位點附近的空間結(jié)構，使得S-RNase的核酸酶活性降低，從而導致親和[22]。蘋果品種Vered的S39sm-RNase基因與正常S39-RNase基因相比，編碼序列中有兩個非同義替換和3個同義替換，以及一個205 bp堿基對的缺失，其僅編碼121個氨基酸殘基，導致S-RNase異構體的截短，從而導致親和[23]。

梨亞科S-RNase基因HV區(qū)內(nèi)含子序列長期被認為不參與自交不親和的過程[6-7，24]。分析發(fā)現(xiàn)梨亞科5個屬S-RNase基因內(nèi)含子序列成對總平均遺傳距離0.312，僅為編碼區(qū)序列成對總平均遺傳距離0.210的1.5倍，其分屬和分種遺傳分化距離與對應CDS序列遺傳分化距離也呈現(xiàn)一定的相關性，因此，HV區(qū)的內(nèi)含子序列在進化過程中存在受到編碼區(qū)特別是HV區(qū)影響的可能性。同時，通過分析內(nèi)含子序列發(fā)現(xiàn)一些S-RNase基因的登錄信息有誤：P. communis Si-RNase（AB258361.1）登錄的內(nèi)含子5'端GTGAATTCTCACAGG序列應為外顯子序列，內(nèi)含子序列應為該序列后面的GTAA開始；P. communis S25-RNase（AB731592.1）內(nèi)含子序列長3030 bp，而不是3031 bp。另有P. pyrifolia S46-RNase（FJ946628.1）基因序列提交信息的外顯子序列比真實序列長36 bp，該36 bp應為內(nèi)含子序列。研究還發(fā)現(xiàn)，5個屬中外顯子序列相同的兩條S-RNase基因內(nèi)含子序列存在內(nèi)含子不一致的情況：P.s S28-RNase（EF566872.1）和P.p S8-RNase（AB104908.1），前者比后者存在7 bp核苷酸的缺失，另有4處核苷酸突變；P. b S20-RNase（AY250988.2）和P.b S29-RNase（EU101462.1），前者比后者存在一個20 bp核苷酸插入，另有6處核苷酸突變；P.c S210-RNase（EU477840.1）和P.c S21-RNase（EU477839.1），前者比后者存在1個長度為561 bp序列的插入、另外還有1個堿基突變[25]。這些S-RNase外顯子序列一致而內(nèi)含子序列存在差異，是否為同一基因進化過程中不同時期的形態(tài)還有待進一步研究。

薔薇科基于S-RNase的配子體自交不親和性，被認為是開花植物中最廣泛和最古老的自交不親和系統(tǒng)之一[26]。關于S-RNase基因進化目前主流的觀點是：單一位點起源，多次分化[27-28]。筆者在本研究中表明梨亞科5個屬S-RNase基因CDS全長序列和基因密碼子偏好性進化樹均顯示未形成以種或?qū)贋閱挝坏木垲悾f明梨亞科S-RNase基因分化至少早于5個屬的分化時間。

基因結(jié)構特征以及進化與基因功能密不可分。自從證實了S-RNase就是梨亞科果樹自交不親和的雌性決定因子以來，學者們普遍認為其主要通過降解相應的花粉RNA來完成自交不親和[29-31]。長時間以來學者們也在不斷探尋其分子機制。Matsuura等[15]報告了日本梨S3-RNase在1.5 ?分辨率下的晶體結(jié)構，并給出了S3-RNase存在的識別位點及其酶活性的結(jié)構基礎。Meng等[29]研究認為蘋果花粉ABCF轉(zhuǎn)運蛋白可以將S-RNase運輸至花粉管；Yuan等[30]研究認為進入花粉管中的蘋果S-RNase會被不同基因型的花粉SCF（SKP1-Cullin1-F-box）復合體和26S蛋白酶降解導致親和，同基因型的花粉因不能降解S-RNase而導致自交不親和。Chen等[31]研究認為梨S-RNase直接作用于PbrAct1蛋白，誘導其花粉管細胞凋亡，無法完成受精。Tang等[32]研究發(fā)現(xiàn)梨S-RNase可以介導無機焦磷酸酶通過抑制果膠甲基化酶誘導花粉管頂端膨脹。由于梨亞科雄性自交不親和因子還未最終確定，其S-RNase基因的功能以及如何與雄性S基因互作來完成自交不親和還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

目前，NCBI中GenBank共收錄梨亞科5個屬S-RNase基因CDS全長序列，剔除重復序列90條。大于330 bp的片段序列140條。研究發(fā)現(xiàn)除了公認的HV區(qū)具備和花粉S基因識別的特征外，其他區(qū)域也表現(xiàn)出了相似的特征；基因編碼序列、內(nèi)含子序列和密碼子偏好生成的進化樹均未形成以屬或種為單位的聚類，表明梨亞科5個屬S-RNase基因的分化早于各屬之間的分化。研究顯示梨亞科5個屬S-RNase基因中的密碼子存在一定的偏好性，并且偏好以A/T結(jié)尾的密碼子。

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