固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定紅棗制品中環(huán)磷酸腺苷

摘要：采用固相萃取-高效液相色譜法建立了紅棗制品中環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）含量的分析方法。樣品提取后，經(jīng)Strata-X-AW固相萃取柱凈化，采用Waters XSelect C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以甲醇和0.5%甲酸-水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果表明，cAMP在0.50～50.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R²）大于0.999。對(duì)紅棗酸奶、紅棗酒、紅棗醋等不同種類加工制品進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，紅棗酸奶和紅棗酒添加量為5.00，10.0，20.0 mg/kg，紅棗醋添加量為2.00，5.00，10.0 mg/kg時(shí)，cAMP的平均回收率為86.2%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～5.0%。方法的檢出限為0.12～0.46 mg/kg，定量限為0.39～1.55 mg/kg。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，適用于紅棗制品中cAMP含量的檢測(cè)，同時(shí)也為產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)管提供了新思路。

關(guān)鍵詞：環(huán)磷酸腺苷；紅棗；固相萃?。桓咝б合嗌V

中圖分類號(hào)：TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1000-9973（2025）03-0178-06

Determination of Cyclic Adenosine Monophosphate in Jujube Products by

Solid-Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

CHENG Lu-yao¹， DONG Shuo¹， ZHANG Lei²， GAO Wen-tao¹，

LI Jing-ming¹， LI Jian-gui²， MA Li-yan^1，3*

（1.College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083，

China;2.College of Forestry and Landscape Architecture， Xinjiang Agricultural University，

Urumqi 830052， China;3.Quality Inspection and Testing Center for Agri-Products （Beijing），

Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing 100083， China）

Abstract： A method for analyzing the content of cyclic adenosine monophosphate （cAMP） in jujube products is established using solid-phase extraction-high performance liquid chromatography. After extraction， the sample is purified by Strata-X-AW solid-phase extraction column， separated by Waters XSelect C18 chromatographic column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， and gradient elution is performed with methanol and 0.5% formic acid-aqueous solution as the mobile phases at the flow rate of 0.8 mL/min and the sample volume of 10 μL.The result show that cAMP has a good linear relationship in the mass concentration range of 0.50～50.0 mg/L， with the correlation coefficient （R²） greater than 0.999. Methodological validation is conducted on different kinds of processed products such as jujube yoghurt， jujube wine and jujube vinegar. The results show that when the addition amount of jujube yogurt and jujube wine is 5.00， 10.0， 20.0 mg/kg， and the addition amount of jujube wine is 2.00， 5.00， 10.0 mg/kg， the average recovery rate of cAMP is 86.2%～112%， the relative standard deviation is 1.7%～5.0%， the limits of detection are 0.12～0.46 mg/kg and the limits of quantification are 0.39～1.55 mg/kg. The method is simple and accurate， with good repeatability and high stability. It is suitable for the determination of cAMP content in jujube products， which has provided a new idea for the supervision of product quality.

Key words： cyclic adenosine monophosphate; jujube; solid-phase extraction; high performance liquid chromatography

收稿日期：2024-09-12

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項(xiàng)（2021A02002-01）

作者簡(jiǎn)介：成璐瑤（2001—），女，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

*通信作者：馬麗艷（1970—），女，教授級(jí)高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向：食品安全及其檢測(cè)技術(shù)。

紅棗（Ziziphus jujuba Mill.）又稱大棗或干棗，是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus）植物的成熟果實(shí)^[1]。中國(guó)紅棗資源豐富，是世界上紅棗生產(chǎn)大國(guó)，棗樹在我國(guó)已有3 000多年的栽培歷史^[2-3]。紅棗是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源食品，具有強(qiáng)身、養(yǎng)胃、健脾、滋補(bǔ)、益血等功效^[4]，可直接食用，也可用作食品添加劑和調(diào)味劑^[5]。研究表明，紅棗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，同時(shí)含有多糖^[6-7]、多酚^[8]、黃酮^[9]、五環(huán)三萜^[10]、環(huán)核苷酸^[11]等多種功能成分，具有極大的開發(fā)和利用價(jià)值，日益受到國(guó)內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)學(xué)家的廣泛關(guān)注。

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是核苷酸的衍生物，被稱為細(xì)胞第二信使，為一種蛋白激酶致活劑^[12]。cAMP廣泛存在于各種植物中，具有多種生理活性，是大棗中最具特色的化合物。據(jù)報(bào)道，成熟紅棗果肉中的cAMP含量高達(dá)302～500 nmol/g^[13]，是已知cAMP含量最豐富的天然植物。cAMP在機(jī)體內(nèi)多種酶類的代謝過程中具有重要作用，能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化和發(fā)育^[14-15]。同時(shí)有研究表明，cAMP具有抗腫瘤^[16]、抗過敏^[17]、保肝、改善心腦血管功能^[18]和促進(jìn)神經(jīng)再生^[19]等多種生理活性。 紅棗中豐富的cAMP具有很大的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。紅棗果汁^[20-21]、紅棗酒^[3，22]、紅棗醋^[23-24]、紅棗發(fā)酵乳制品^[25-26]等紅棗加工產(chǎn)品深受廣大消費(fèi)者的喜愛。

目前關(guān)于紅棗中cAMP的檢測(cè)方法研究較多，主要有薄層色譜法^[27-28]、酶聯(lián)免疫法^[29-30]、高效液相色譜法^[31]、毛細(xì)管電泳法^[32-33]、液相色譜-電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法^[34]、液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法^[35]等。薄層色譜法靈敏度低，需要被檢測(cè)物達(dá)到一定濃度才可能被檢測(cè)到；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)速度快、靈敏度高，但檢測(cè)精度不高、易受外界因素影響；毛細(xì)管電泳法具有分析時(shí)間短、樣品用量少、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，但存在制備能力差、對(duì)非電活性物質(zhì)分離效率低等局限性；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析方法高效，但儀器貴，對(duì)技術(shù)人員要求高；高效液相色譜法因分離效能高、檢測(cè)速度快、靈敏度高等特點(diǎn)，在紅棗cAMP的檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛。

紅棗制品中除了含有紅棗外，還含有糧谷、乳制品、糖類、添加劑等，成分復(fù)雜，樣品提取后直接分析會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)干擾大、基線升高、色譜峰分離度低等情況，同時(shí)，紅棗制品中的cAMP含量相對(duì)較低，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行有效的凈化、富集。目前，關(guān)于紅棗加工制品中cAMP的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。

固相萃取（solid-phase extraction，SPE）技術(shù)利用固相萃取柱中的填料對(duì)樣品中的待測(cè)組分進(jìn)行選擇性吸附，使之與其他成分分離，再用洗脫液洗脫，達(dá)到凈化的目的^[36]，在天然產(chǎn)物中得到廣泛的應(yīng)用。

本研究以紅棗加工制品為研究對(duì)象，采用固相萃取技術(shù)結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，建立一種檢測(cè)紅棗加工制品中cAMP含量的新方法。該方法簡(jiǎn)單、凈化效果好、精準(zhǔn)，適用于紅棗制品中cAMP含量的檢測(cè)，同時(shí)也對(duì)食品質(zhì)量的監(jiān)管具有重要意義。

1材料和方法

1.1試劑

環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：天津阿爾塔科技有限公司;甲醇、甲酸（均為色譜純）：北京百靈威科技有限公司;氨水、乙酸鋅（均為分析純）：北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司。

實(shí)驗(yàn)所用紅棗加工制品均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器）安捷倫科技有限公司；BSA224S-CW電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;KQ-600DA數(shù)控超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司;HC-3018離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;Supleco Visiprep 12-port固相萃取裝置、C18固相萃取柱（500 mg，6 mL）北京八方世紀(jì)科技有限公司;Milli-Q超純水機(jī)美國(guó)Millipore公司;UB-7精密酸度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;Strata-X-A固相萃取柱（200 mg，6 mL）、Strata-X-AW固相萃取柱（200 mg，6 mL）、0.22 μm微孔濾膜天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3方法

1.3.1cAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取cAMP標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g（精確到0.000 1 g），用水溶解并定容至10 mL，配制成1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水定容至10 mL，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確吸取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0，50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2提取

發(fā)酵乳制品：稱取樣品2.5 g（精確到0.000 1 g），加入20 mL水，超聲提取20 min后，用5%氨水調(diào)pH值至5～7，加入0.5 mL乙酸鋅溶液（220 g/L）混勻，用水定容至25 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min，取上清液10 mL備用。

棗醋：稱取樣品5 g（精確到0.000 1 g），加入15 mL水，超聲提取20 min后，用5%氨水調(diào)pH值至5～7，用水定容至25 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min，取上清液10 mL備用。

棗汁飲料、棗酒：稱取樣品10 g（精確到0.000 1 g），加入10 mL水，超聲提取20 min后，用5%氨水調(diào)pH值至5～7，用水定容至25 mL（如此時(shí)提取液的酒精度＞5%，可提高定容體積使提取液的酒精度＜5%），轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min，取上清液10 mL備用。

1.3.3凈化

準(zhǔn)確移取10 mL樣品提取液，轉(zhuǎn)移至事先用5 mL甲醇、5 mL水活化的Strata-X-AW固相萃取柱中，控制流速為1～2 mL/min，棄流出液。再依次用5 mL水、3 mL甲醇淋洗，抽干2 min，用5 mL含5%甲酸的50%甲醇-水溶液洗脫，控制流速為1～2 mL/min，收集洗脫液，用水定容至10 mL，過0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

1.3.4色譜條件

Waters XSelect C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進(jìn)樣量10 μL；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)259 nm；流動(dòng)相A：甲醇溶液；流動(dòng)相B：0.5%甲酸-水溶液；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

1.4數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為重復(fù)3次的平均值，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用SPSS進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著）；采用Origin 2024進(jìn)行圖表的繪制。

2結(jié)果與分析

2.1凈化條件的優(yōu)化

2.1.1固相萃取柱優(yōu)化

對(duì)樣品進(jìn)行有效的凈化是提高目標(biāo)化合物回收率的關(guān)鍵因素。本研究采用固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，實(shí)驗(yàn)比較了C18固相萃取柱、Strata-X-A固相萃取柱、Strata-X-AW固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果顯示，使用C18固相萃取柱凈化時(shí)，回收率僅為13.7%，大部分cAMP在淋洗時(shí)損失；Strata-X-A柱的回收率為89.7%，Strata-X-AW柱的回收率為100.3%。Strata-X-AW柱是弱陰離子交換聚合物吸附劑，含有弱堿性基團(tuán)，在水中能解離出OH-而呈弱堿性^[37]，在中性和酸性條件下，其正電荷可以與cAMP分子中的磷酸基團(tuán)結(jié)合使其在固相萃取柱上保留，用水和甲醇去除大部分干擾物后，在酸性條件下目標(biāo)物被洗脫下來。樣品凈化前后的cAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

2.1.2樣品提取液pH值優(yōu)化

用2%乙酸和5%氨水將樣品提取液的pH值調(diào)至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，比較不同pH值對(duì)凈化效果的影響，見圖2。

由圖2可知，提取液pH值在5.0～7.0之間時(shí)，cAMP回收率在99%～103%之間，回收率較高；而pH值為3.0，4.0時(shí)，cAMP回收率較低。Strata-X-AW固相萃取柱是一種聚合物基質(zhì)的弱陰離子交換柱，可提供反相和陰離子交換雙重保留模式^[38]。pH值偏中性有利于化合物進(jìn)行離子交換，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)控制提取液的pH值在5.0～7.0之間，以確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2.1.3洗脫液的優(yōu)化

洗脫液的組成比例和洗脫體積對(duì)固相萃取柱的回收率影響較大。SPE柱經(jīng)活化和平衡后，取5 mL 10 μg/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣，用5 mL水、5 mL甲醇淋洗后，用含5%甲酸的甲醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液中未檢測(cè)到目標(biāo)化合物，即含5%甲酸的甲醇溶液不能將cAMP從SPE柱上洗脫下來。為進(jìn)一步確定洗脫液中甲醇的比例對(duì)洗脫效果的影響，在保持甲酸比例為5%的情況下，比較洗脫液中甲醇比例分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)的洗脫效果，見圖3。

由圖3可知，當(dāng)洗脫液中甲醇比例為50%和60%時(shí)洗脫效果無明顯差異，均能將cAMP從SPE柱上洗脫下來。當(dāng)甲醇比例達(dá)到70%時(shí)，回收率降低；當(dāng)甲醇比例達(dá)到90%及以上時(shí)，無法將cAMP洗脫下來，這可能是由于水的比例增加使洗脫液的極性增加，更有利于cAMP的洗脫。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇含5%甲酸的50%甲醇-水溶液進(jìn)行洗脫。

2.1.4洗脫曲線

取10 μg/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL加入到活化后的Strata-X-AW柱上，用5 mL水、5 mL甲醇淋洗，抽干后用含5%甲酸的50%甲醇溶液洗脫，洗脫液每1 mL收集一次，分別進(jìn)行cAMP含量分析。以洗脫液的體積為橫坐標(biāo)，每毫升洗脫液對(duì)應(yīng)的cAMP質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，見圖4。

由圖4可知，2 mL洗脫液可以將70%的cAMP從SPE柱上洗脫下來，3 mL洗脫液可以將98%的cAMP洗脫下來。為保證洗脫完全，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇洗脫液體積為5 mL。

2.2提取條件的優(yōu)化

2.2.1棗汁飲料、棗酒

不含乙醇的果蔬汁飲料經(jīng)提取后可以直接經(jīng)固相萃取柱凈化后進(jìn)行測(cè)定。

目前棗酒的加工方式主要有兩種：發(fā)酵型紅棗酒和調(diào)配型紅棗酒。發(fā)酵型紅棗酒是以紅棗為原料，經(jīng)發(fā)酵、調(diào)制等工藝釀制而成，酒精度通常在9%～13%左右^[39-40]；調(diào)配型紅棗酒是通過食用酒精和棗汁調(diào)配制成，酒精含量差異較大。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酒精度≥10%時(shí)，回收率小于20%，當(dāng)酒精度為5%時(shí)，回收率在90%以上，因此對(duì)于酒精含量較高的棗酒，需要將樣品稀釋到酒精度5%左右再進(jìn)行凈化處理。

2.2.2風(fēng)味發(fā)酵乳

風(fēng)味發(fā)酵乳中的蛋白質(zhì)含量較高，同時(shí)還含有穩(wěn)定劑、添加劑等成分，如果不對(duì)其進(jìn)行凈化，無法進(jìn)行液相色譜分析。常用的蛋白質(zhì)沉淀劑有三氯甲烷^[41]、三氯乙酸^[42]、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅^[43-44]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三氯甲烷沉淀蛋白效果較好，回收率在83.2%，但因其屬于第二類易制毒化學(xué)品，且對(duì)人體有一定的危害，其使用受到一定的限制。用三氯乙酸作為蛋白沉淀劑時(shí)，雖然有蛋白析出，但是上清液依然渾濁，蛋白沉淀不完全，回收率僅有38.5%。亞鐵氰化鉀和乙酸鋅雖然沉淀蛋白效果較好，但回收率僅為3.5%；只用乙酸鋅作為沉淀劑時(shí)，不僅蛋白沉淀效果好，回收率也在90%以上，這可能是由于Strata-X-AW柱是弱陰離子交換柱，亞鐵氰化鉀中的陰離子與SPE柱的活性位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致cAMP不能有效結(jié)合，回收率低。

2.3線性回歸方程、線性范圍

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入高效液相色譜儀中進(jìn)行分析，以濃度為橫坐標(biāo)（x），以不同標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。結(jié)果表明，cAMP在0.50～50.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，回歸方程為y=36.257x+8.069 5，相關(guān)系數(shù)（R²）為0.999 6，線性關(guān)系良好。

2.4精密度、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將濃度為10 μg/mL的cAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果表明，峰面積的RSD為0.41%，表明測(cè)試儀器在該色譜條件下具有良好的精密度。

平行制備10 μg/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液3份，分別在第1，2，3天進(jìn)行分析，觀察日間穩(wěn)定性，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果表明，峰面積的RSD為1.94%，表明該方法在3 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

采用加標(biāo)回收的方法確定該方法的回收率和精密度。在紅棗酸奶、紅棗酒、紅棗醋中添加cAMP，分別在低、中、高3個(gè)添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。按上述所建立的方法進(jìn)行提取、凈化、分析，計(jì)算該方法的回收率和精密度，結(jié)果見表2。

由表2可知，不同紅棗制品中cAMP在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為86.2%～112%，RSD在1.7%～5.0%之間，方法的準(zhǔn)確度和精密度均能滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求。

按3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比計(jì)算方法的定量限（limit of quantification，LOQ）。結(jié)果表明，紅棗酸奶、紅棗酒和紅棗醋3種不同樣品基質(zhì)的LOD分別為0.46，0.12，0.23 mg/kg，LOQ分別為1.55，0.39，0.77 mg/kg，可以滿足實(shí)際樣品的分析需求。

2.6市售紅棗制品中cAMP的檢測(cè)

應(yīng)用本研究建立的方法對(duì)市售的紅棗酸奶、紅棗果汁、棗酪、棗醋等不同類型的紅棗制品中cAMP含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，除以谷物為主要加工原料的棗醋2中未檢出cAMP外，其他4種市售紅棗制品中均檢出cAMP，且含量差異較大，這可能與產(chǎn)品中紅棗的添加量及生產(chǎn)工藝相關(guān)。

3結(jié)論

本研究建立了一種固相萃取柱凈化結(jié)合高效液相色譜分析測(cè)定紅棗制品中cAMP含量的方法。針對(duì)不同樣品的特點(diǎn)，優(yōu)化了提取、凈化方法。結(jié)果表明，通過Strata-X-AW固相萃取柱凈化，能有效去除樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)中cAMP含量的測(cè)定。本方法具有試劑用量少、提取簡(jiǎn)單、凈化效果好等特點(diǎn)，可以用于紅棗加工產(chǎn)品中cAMP的檢測(cè)，也具有應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)和管控的潛力。

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