生防木霉菌T43對玉米莖腐病及土壤中莖腐病菌數(shù)量的影響

摘要：為明確生防木霉菌T43不同施加次數(shù)對玉米莖腐病的防治效果及對土壤中莖腐病菌（Fusarium graminearum）數(shù)量的影響，將濃度為2.5×105 CFU/mL的禾谷鐮孢菌孢子懸浮液施加到滅菌土壤中，1周后種植玉米種子，同時，分別向各盆栽土壤施加濃度為2.5×105 CFU/mL的木霉菌T43孢子懸浮液1～2次，2次施加時間的間隔為1周。每隔1周進行病情統(tǒng)計，計算盆栽玉米植株的病情指數(shù)和玉米莖腐病的防效，并采用稀釋涂布法對土壤中木霉菌T43和玉米莖腐病菌的數(shù)量變化進行比較與分析。結(jié)果表明，第9周時木霉菌T43處理2次的盆栽玉米莖腐病的病情指數(shù)為19.44，對莖腐病的防效達到72.00%；在0～9周內(nèi)，玉米生防木霉菌T43的數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，單獨施加莖腐病菌的對照組數(shù)量在第7周達到峰值，為1.83×108 CFU/g；木霉菌T43施加2次后，土壤中的木霉菌數(shù)量也在第7周達到峰值，為1.50×108 CFU/g。與對照組相比，木霉菌T43處理2次的防治效果最好，第7周時玉米莖腐病菌的數(shù)量僅有4.33×107 CFU/g，相較于病原菌對照減少了76.34%。綜上，木霉菌T43可有效地防治盆栽玉米莖腐病的發(fā)生，且能夠抑制盆栽土壤中莖腐病菌的繁殖。

關(guān)鍵詞：生防木霉菌；玉米；莖腐??；病菌數(shù)量；生防效果

中圖分類號：S182；S435.131.4+9" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）03-0128-05

邱新月，魏甜甜，許" 蓉，等. 生防木霉菌T43對玉米莖腐病及土壤中莖腐病菌數(shù)量的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2025，53（3）：128-133.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2025.03.017

收稿日期：2024-03-07

基金項目：山西省基礎(chǔ)研究計劃（編號：202203021211270）；山西省重點研發(fā)計劃（編號：201903D211001-1）。

作者簡介：邱新月（1996—），女，河北滄州人，碩士研究生，從事植物病害與生物防治研究。E-mail：2624380002@qq.com。

通信作者：姚艷平，博士，副教授，從事植物病害與生物防治研究。E-mail：ypyao2002@163.com。

玉米莖腐病是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的土傳病害，能夠?qū)е掠衩壮霈F(xiàn)倒伏、枯死、果穗下垂，甚至是植株死亡［1］，一般使玉米減產(chǎn)10%～25%，嚴重時可達70%以上，已成為玉米生產(chǎn)上亟需解決的問題［2］。目前，玉米莖腐病的防治主要依靠抗病品種和化學防治，但由于玉米品種的多樣性及差異性，導致針對性的品種抗病很難實現(xiàn)；而化學農(nóng)藥的長期施用易導致病原菌抗藥性的產(chǎn)生，以及農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和土壤微生物種群減少等一系列問題［3］。因此尋求一種安全高效、對環(huán)境友好的防治策略是目前玉米莖腐病防控中的首要任務(wù)。

木霉菌（Trichoderma spp.）具有良好的環(huán)境適應(yīng)能力，能夠在自然界中廣泛存活，生長速度快和多重生防機制使其在植物病害防治中具有良好的優(yōu)勢［4-5］。木霉菌可通過競爭、抗生作用、寄生作用來抑制病原菌的生長，可防治由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、多種鐮孢菌（Fusarium spp.）等病原菌引起的植物病害［6］。佟昀錚發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉（T. harzianum）CCTH-2具有較強的重寄生作用，可纏繞病原菌菌絲，抑菌效果達到了82.83%［7］。耿肖兵研究發(fā)現(xiàn)，生防菌木霉菌48SJ7-1對玉米莖腐病防效達到了68.47%［8］。除此之外，木霉菌還可以改善土壤微生態(tài)，促進植物生長。曹健研究表明，淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）B10-1和綠色木霉（T. viride）B1-1可提高真菌的豐富度和多樣性，降低土壤中細菌菌群結(jié)構(gòu)的多樣性和豐富度，降低尖鐮孢菌（F. oxysporum）的含量［9］。Samolski等發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉可提高黃瓜植株根毛的數(shù)量和長度，增加根系表面積［10］。同時其他研究也表明，木霉菌在水稻根系定殖后可有效增長水稻根系、增強玉米植株根毛發(fā)育、增加根系生物量、使玉米根系生長增強等［11-13］。

本試驗以生防木霉菌T43為對象，研究木霉菌T43對玉米莖腐病的防治效果，并分析木霉菌T43對土壤中玉米莖腐病菌（F. graminearum）數(shù)量變化的影響，探討生防木霉菌T43的生防機制，為玉米莖腐病的生物防治提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

1.1.1" 供試材料

供試菌株：玉米莖腐病菌為禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum，縮寫為FG）；生防菌為綠色木霉（Trichoderma viride）T43，均由山西農(nóng)業(yè)大學植物病理重點實驗室提供。

供試玉米品種：玉米莖腐病感病品種，太育919。

1.1.2" 供試培養(yǎng)基

玉米培養(yǎng)基：參照周闖的方法［14］加以改進，將玉米浸泡在自來水中3 d，稱取 100 g 放入菌袋，并加入10 mL的1.5%葡萄糖溶液，于高壓滅菌鍋中121 ℃ 滅菌20 min。

綠豆培養(yǎng)基MB和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA參照劉焱琨的方法［15］進行制備。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 玉米莖腐病菌FG孢子懸浮液的配制

將純化后的FG接入MB培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后，采用血球計數(shù)板在顯微鏡下測定孢子濃度，配制成 2.5×105 CFU/mL的孢子懸浮液。

1.2.2" 綠色木霉T43孢子懸浮液配制

采用宿暢等的方法，并加以改進［16］。將活化后的綠色木霉T43接種于玉米培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d。用少量蒸餾水將培養(yǎng)基中的木霉T43分生孢子沖洗下來，單層紗布過濾后，采用血球計數(shù)板在顯微鏡下測定孢子濃度，將孢子濃度調(diào)整為2.5×105 CFU/mL。

1.2.3" 盆栽試驗

試驗于2021年8月中旬至10月上旬在山西農(nóng)業(yè)大學植物保護學院農(nóng)作站完成。

1.2.3.1" 土壤滅菌

8月中旬開始準備工作，首先采集多年玉米連作的田間土壤，將土壤于烘箱中進行150 ℃、3 h干熱滅菌，加入無菌水使土壤充分吸收后放置2 d［17］。

1.2.3.2 ""種子消毒

挑選大小均勻飽滿的成熟玉米種子，清水沖洗后用10% NaClO溶液消毒 5 min，采用無菌水清洗3遍后再浸泡20 min［18］。

1.2.3.3" 盆栽處理

利用無菌噴壺將60 mL玉米莖腐病菌FG孢子懸浮液均勻施加在盆栽土壤中。7 d后，每盆種植5粒消毒后的玉米種子。同時向各處理花盆中分別施加60 mL木霉菌T43的孢子懸浮液1次（T1）、2次（T2），施加間隔時間為7 d。以單獨施加木霉菌孢子懸浮液為木霉菌處理的對照（CK1、CK2），間隔時間為7 d；以單獨施加FG孢子懸浮液為玉米莖腐病菌FG處理的對照（CK3），以無菌水處理作為空白對照（CK0）。

1.2.3.4" 病情調(diào)查與統(tǒng)計

施加病原菌后的第2周時開始進行玉米植株取樣。將玉米根系完整的取出，進行玉米莖腐病的病情統(tǒng)計，計算病害防效。病情分級標準參考程星凱的方法［19］。

1.2.3.5" 數(shù)量檢測

盆栽土壤施加玉米莖腐病菌FG后，每隔1周采集玉米植株根系土壤2 g，每盆取3次，混勻風干過篩（20目）［20］。從中稱取1 g土樣放入裝有玻璃珠的錐形瓶中，再加入10 mL無菌生理鹽水在搖床中培養(yǎng)30 min，之后進行10倍梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7進行涂布，28 ℃暗培養(yǎng) 3～5 d，進行木霉菌T43和玉米莖腐病菌FG的數(shù)量統(tǒng)計［21］。

土壤真菌數(shù)量根據(jù)以下公式計算［22］：

土壤真菌數(shù)量（CFU/g）=單菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)土壤重量。

根據(jù)以下公式計算病原菌的抑制率［23］：

抑制率=T0-T1T0×100%。

式中：T0為處理前的菌落數(shù)量；T1為處理后的菌落數(shù)量。

1.2.4" 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2016進行統(tǒng)計，利用Origin 2019b 32Bit進行作圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 木霉菌T43對玉米莖腐病的防治效果

由圖1-a可知，土壤中單獨施加玉米莖腐病菌FG（CK3）后，前3周玉米莖腐病未發(fā)生，其病情指數(shù)為0；第4周時玉米植株開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，病情指數(shù)為13.89，隨著時間的延續(xù)莖腐病病情逐漸嚴重，第9周時玉米植株的病情指數(shù)高達69.44。施加1次木霉菌T43（T1）進行防治后，玉米植株同樣在第4周開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀但病情指數(shù)僅為8.33，之后隨著時間的延長，在第9周時發(fā)病最為嚴重，病情指數(shù)為41.67。施加2次（T2）木霉菌T43的玉米植株在第5周開始發(fā)病，第9周時發(fā)病情況最為嚴重，病情指數(shù)為19.44。

由圖1-b可知，前3周所有處理中玉米植株不發(fā)?。坏?周木霉菌T43處理1次對玉米莖腐病的防治效果為40.00%，第7周時防效最高，達68.75%，后又逐漸下降，第9周時降至40.00%。木霉菌T43處理2次對玉米莖腐病的防治效果最好，其防效呈現(xiàn)先下降后上升最后下降的趨勢，第5周時該處理玉米植株開始發(fā)病，防效為85.71%，之后在第6周時防效到達第2次高峰，達90.91%，之后逐漸下降，第9周時防效為72.00%，但仍高于其他處理。說明木霉菌處理次數(shù)不同，對玉米莖腐病的防效不同，但均表現(xiàn)出較好的病害防治作用。

2.2" 盆栽土壤中玉米莖腐病菌FG的數(shù)量變化

由圖2可知，土壤中施加玉米莖腐病菌FG后，其數(shù)量變化呈現(xiàn)先上升后下降再次上升至最高點后迅速下降的趨勢。病原菌FG數(shù)量從第1周開始逐漸上升，至第3周到達第1個高峰，數(shù)量達 4.33×107 CFU/g，之后逐漸下降；從第4周開始，玉米莖腐病菌FG數(shù)量又再次上升，并于第7周時至最高峰，數(shù)量達1.83×108 CFU/g，然后又迅速下降。雖然在測定時間段內(nèi)病原菌的數(shù)量變化有所浮動，但玉米莖腐病菌FG的數(shù)量總體表現(xiàn)為上升趨勢，說明土壤中施加玉米莖腐病菌FG后，其可在土壤中長期存活并逐漸繁殖。

2.3" 盆栽土壤中綠色木霉T43的數(shù)量變化

由圖3可知，不同施加次數(shù)的木霉菌數(shù)量在土壤中均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。CK1與CK2處理在第7周到達菌落數(shù)量高峰，分別為 9.33×107 CFU/g 和1.50×108 CFU/g，隨后1周CK1和CK2的木霉數(shù)量均開始逐漸下降，且CK2處理后的木霉數(shù)量仍高于CK1。木霉菌T43在土壤中的數(shù)量變化說明木霉菌可在土壤中長期存活并大量繁殖，且繁殖規(guī)律與木霉菌的施加次數(shù)和施加量

密切相關(guān)。

2.4" 木霉菌T43對土壤中玉米莖腐病菌FG數(shù)量的影響

盆栽土壤中先后施加玉米莖腐病菌FG和木霉菌T43后，由圖4可知，與僅施加玉米莖腐病菌FG的CK3相比，木霉菌處理后土壤中的玉米莖腐病菌FG數(shù)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中T2的處理效果最優(yōu)，與CK3具有明顯差異。在第7周時，處理T2中的玉米莖腐病菌FG數(shù)量最少，僅為 4.33×107 CFU/g，相較于CK3降低了76.34%；處理T1中的玉米莖腐病菌FG數(shù)量也僅為 9.67×107 CFU/g，相較于CK3降低了47.16%。試驗處理的前3周，因土壤中木霉菌T43數(shù)量有限，對玉米莖腐病菌FG的抑制效果并不明顯，但從第4周開始不同施加次數(shù)的木霉菌處理的效果開始出現(xiàn)差異，施加2次木霉菌T43孢子懸浮液的T2處理的抑制效果最優(yōu)。原因可能是木霉菌經(jīng)過前3周的繁殖種群數(shù)量達到一定程度并順利完成了在土壤中的定殖，所以后期對玉米莖腐病菌FG的抑制效果越來越明顯。

2.5" 玉米莖腐病菌FG對木霉菌T43數(shù)量的影響

由圖5可知，無論土壤中是否存在病原菌FG，木霉菌T43的數(shù)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；但土壤中存在病原菌FG時，木霉菌T43的數(shù)量遠遠低于只施加木霉菌T43的對照CK1和CK2。尤其在第7周時差異最為明顯，此時對照CK1的木霉菌T43數(shù)量為9.33×107 CFU/g，而T1則為7.67×107 CFU/g，木霉菌數(shù)量減少了17.79%；對照CK2中木霉菌T43數(shù)量為1.57×108 CFU/g，而T2則為 1.17×108 CFU/g，相較于CK2木霉菌數(shù)量降低了25.48%。由此可知，土壤中的病原菌FG與木霉菌T43會存在空間競爭和營養(yǎng)競爭等關(guān)系，進而影響到木霉菌T43在土壤中的繁殖數(shù)量和定殖，導致出現(xiàn)土壤中木霉菌數(shù)量降低的現(xiàn)象。

3" 討論

本研究探究了生防木霉菌T43對玉米莖腐病的防治效果及其對土壤中莖腐病菌數(shù)量的影響，研究結(jié)果表明，土壤中施加2次木霉菌T43后，木霉菌數(shù)量在第7周可達到數(shù)量高峰，為1.50×108 CFU/g，對土壤中玉米莖腐病菌FG數(shù)量的抑制率達76.34%；在第6周對玉米莖腐病的防效達第2次高峰，為90.91%，之后逐漸下降，第9周時防效為72.00%，說明木霉菌可在土壤中存活并繁殖，雖然后期數(shù)量下降但并不會影響其對玉米莖腐病的防治作用，木霉菌T43可有效抑制土壤中玉米莖腐病菌FG的數(shù)量，有效地防治玉米莖腐病的發(fā)生，土壤中木霉菌T43的數(shù)量和抑菌效果均與木霉菌T43的接種量和施加次數(shù)密切相關(guān)。

玉米莖腐病菌FG作為土傳病害的一種，其在土壤中的數(shù)量關(guān)系到玉米莖腐病的發(fā)生情況，所以對土壤中玉米莖腐病菌FG的數(shù)量研究具有十分重要的意義［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨施加玉米莖腐病菌FG時，玉米莖腐病菌FG的數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降再上升至最高點后迅速下降的趨勢，出現(xiàn)此變化的原因可能是由于玉米莖腐病菌FG施加入土壤后，其在土壤中緩慢適應(yīng)環(huán)境條件，并逐漸開始大量繁殖，因此玉米莖腐病菌FG的數(shù)量逐漸上升；之后可能是由于玉米莖腐病菌FG開始侵染玉米根系，誘導玉米根系產(chǎn)生一些活性抗性物質(zhì)，如玉米根系分泌的苯并噻唑類化合物對孢子釋放、游動、休止孢萌發(fā)和菌絲的生長都有抑制作用［25］，所以導致土壤中玉米莖腐病菌FG數(shù)量逐漸下降；又或玉米植株同時通過抗性調(diào)控途徑中的某些基因正調(diào)控玉米莖腐病的抗性［26］，使玉米植株自身抗病性增強，因而影響到玉米莖腐病菌FG的繁殖速度和總體數(shù)量；但由于玉米自身抗病機制的作用比較有限，無法從根本上控制玉米莖腐病菌FG的繁殖，導致后期玉米莖腐病菌FG的數(shù)量重新開始上升。

木霉菌是土壤中最常見的真菌之一，也是一種優(yōu)良的生防微生物，對多種真菌性土傳病害具有明顯的生防效果，其生防潛力與其定殖能力息息相關(guān)［27-28］。本試驗通過稀釋涂布平板法分析了土壤中木霉菌T43的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)木霉菌T43呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與隋麗娜等關(guān)于木霉菌數(shù)量變化的研究結(jié)果［5，29］相似，說明木霉菌T43可以在土壤中長期存活與定殖。施加2次木霉菌T43后，對玉米莖腐病菌FG起到抑制作用，第7周時玉米莖腐病菌FG數(shù)量降低了76.34%，第9周時對玉米莖腐病防效達72.00%。本研究與隋麗娜等的研究結(jié)果［5，30］類似，均體現(xiàn)了木霉菌對玉米莖腐病良好的防治效果。

關(guān)于土壤中玉米莖腐病菌FG定量研究的方法較多，有稀釋涂布平板法、實時熒光定量PCR技術(shù)和環(huán)介導等溫擴增技術(shù)等［31-33］。實時熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強、敏感性高、重復性好等優(yōu)點［34］。但該技術(shù)要求相關(guān)的酶必須能夠耐受高溫，且引物具有高度專一性，否則容易產(chǎn)生引物二聚體，對試驗結(jié)果造成影響［35］。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)引物設(shè)計要求限制了靶位點的選擇，限制了程序的分辨率或特異性，其次，該技術(shù)最終產(chǎn)物是一個大片段，無法進行克隆或通過PCR技術(shù)進行其他生物學試驗［36］。而稀釋涂布平板法具有成本低、能檢測出活菌數(shù)的優(yōu)勢，更能真實地反映土壤樣品的狀況；而且試驗方法操作簡便、具有較強的重復性，無論土壤樣品中菌數(shù)高或低都適用［37-38］，因此，本研究采用稀釋涂布平板法初步測定土壤中菌落數(shù)量，用以初步分析綠色木霉T43及玉米莖腐病菌FG在盆栽土壤中的數(shù)量變化。

4 "結(jié)論

本試驗研究了生防木霉菌T43對玉米莖腐病的防治效果及其對土壤中莖腐病菌數(shù)量的影響，研究結(jié)果表明，土壤中施加2次木霉菌T43后，木霉菌數(shù)量在第7周可達數(shù)量高峰，為1.50×108 CFU/g，對土壤中玉米莖腐病菌FG數(shù)量的抑制率達76.34%；在第6周對玉米莖腐病的防治效果達第2次高峰，為90.91%，之后逐漸下降，第9周時防效為72.00%。說明木霉菌可在土壤中存活并繁殖，可有效抑制土壤中玉米莖腐病菌FG的數(shù)量，且木霉菌T43可有效防治玉米莖腐病的發(fā)生，同時土壤中木霉菌T43的數(shù)量和防治效果均與木霉菌T43的接種量和施加次數(shù)密切相關(guān)。

因此，木霉菌T43具有良好的生防開發(fā)前景，未來應(yīng)對該菌株防治玉米莖腐病的生防機制進行深入的研究與探討，為木霉菌T43充分發(fā)揮其生防功能提供科學依據(jù)，為我國玉米產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)綠色發(fā)展奠定理論基礎(chǔ)。

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