杜氏桿菌對雞糞好氧堆肥過程中氮素保持的影響

摘要：為緩解雞糞在好氧堆肥過程中氮素損失過多的問題，篩選有固氮能力的菌株，制成菌劑施用于雞糞的好氧堆肥過程，以測試菌劑的加入對雞糞堆肥理化性質和總氮含量、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量、氨氣排放量之間的關系，以得到高效的固氮菌株。首先采集雞糞堆肥體系高溫期樣本，采用涂布劃線的方法挑選單菌落，通過分析菌株對無氮培養(yǎng)基的利用效率，進而篩選有固氮能力的菌株。對菌株進行16S rRNA序列擴增后進行測序分析，利用NCBI網(wǎng)站中的BLAST進行序列對比分析，對其相似性高的序列進行下載，采用MEGA分析法對相似的序列進行發(fā)育樹分析。而后將篩選出的菌株應用于雞糞堆肥體系。通過采集其中5 d的樣本，對其溫度、含水率、EC、pH值、總氮含量、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量和氨氣排放量等指標進行分析，進一步明確菌株在堆肥體系中對氮素保持的作用。結果表明，篩選的菌株為杜氏桿菌，其序列對比與紫假杜氏桿菌和自生固氮菌馬賽菌相似性最高。將杜氏桿菌應用于雞糞堆肥體系后發(fā)現(xiàn)，菌劑的投入使堆體升溫期溫度比CK組高4 ℃，延長堆體的高溫期1 d。菌劑的添加使堆肥結束時總氮濃度比CK組提高了 1.27 g/kg。銨態(tài)氮在堆肥結束時濃度比CK組高15.5%。硝態(tài)氮濃度同樣高于CK組4.87%。而加入菌劑后氨氣排放量相比CK組減少10%。上述結果表明，本研究篩選的杜氏桿菌應用于雞糞好氧堆肥對氮素保持有促進作用，推進堆肥過程順利進行，為后期雞糞好氧堆肥菌劑的選擇提供了更多的選項。

關鍵詞：篩選；16S rRNA；杜氏桿菌；堆肥；氮素循環(huán)

中圖分類號：S141.4" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）03-0249-06

楊夢圓，彭" 霞，濮振宇，等. 杜氏桿菌對雞糞好氧堆肥過程中氮素保持的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2025，53（3）：249-254.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2025.03.033

收稿日期：2024-01-24

基金項目：湖北省重點研發(fā)計劃（編號：2023BBB124）。

作者簡介：楊夢圓（1997—），女，河南洛陽人，碩士，主要從事畜禽糞污的資源化利用研究。E-mail：1812236062@qq.com。

通信作者：朱" 藝，博士，副教授，主要從事固體廢棄物資源化利用研究。E-mail：zhuyi027@126.com。

根據(jù)2022年國家統(tǒng)計局發(fā)布的《中華人民共和國2022年國民經(jīng)濟和社會發(fā)展統(tǒng)計公報》顯示，全國豬牛羊禽肉產(chǎn)量9 227萬t，比上年增長3.8%。在畜牧業(yè)快速發(fā)展的同時，產(chǎn)生的畜禽糞便約38億t，畜禽糞便的排放處理處置問題尤為嚴峻［1］。畜禽糞便的排放會產(chǎn)生惡臭氣體，如氨氣和硫化氫等污染環(huán)境；畜禽糞便中的有機質、氮磷鉀及致病微生物、有害重金屬元素等，會隨著畜禽糞便的排放進入土壤和地下水，造成生態(tài)環(huán)境的失衡［2］。從環(huán)境保護和資源化利用的角度，畜禽糞便如何無害化處理成為一個亟待解決的問題。

畜禽糞便的處理方式有飼料化、能源化（厭氧發(fā)酵和缺氧熱解）、肥料化（好氧堆肥）等。其中，好氧堆肥技術由于成本低、安全高效和工藝簡單等優(yōu)點被推廣使用［3］。但好氧堆肥的過程存在氮素損失大的問題，氮素損失主要是由有機氮的礦化和銨態(tài)氮的揮發(fā)以及硝態(tài)氮的反硝化等過程造成的，共造成氮素損失50%～68%［4］。

對于氮素損失比例大的問題，目前有大量的研究報道關于加入微生物菌劑來減少氮素損失。有學者在堆肥過程中加入氨氧化細菌、自生固氮菌及耐高溫硝化細菌等促進銨態(tài)氮的轉化，避免氨氣的過多釋放。它們通過調節(jié)溫度、pH值等促進堆肥腐熟，增加氮素含量。姬亞慧在豬糞和玉米秸稈堆肥中加入地芽孢桿菌和棉毛狀嗜熱霉菌顯著提高堆肥硝態(tài)氮含量［5］。曾金櫻等在雞糞和米糠共堆肥中加入納豆菌、芽孢桿菌、放線菌、酵母、固氮菌、乳酸菌等微生物促進總氮的積累［6］。李其勝指出在堆肥中加入枯草芽孢桿菌和戊糖片球菌等微生物菌劑能夠減少氮素損失［7］。孫譜等論述了木本廢棄物堆肥常見的微生物和作用［8］。楊迎香等通過添加外源固氮菌來影響微生物群落和氨基酸代謝，減少了堆肥中的碳氮損失［9］。很多學者加入自行研制的復合微生物菌劑達到氨氣減排和堆肥提前進入高溫期的效果［10-11］。這些研究均表明在堆肥中加入微生物菌劑可以促進氮素保留。由于市面上微生物菌劑堆肥效果的單一性，以及保氮效果的有限性，因此需要對具體的應用場景進行有效菌株的篩選，以滿足堆肥過程中對氮素保留的需要。

本研究在雞糞堆肥中篩選微生物，制成菌劑，研究雞糞好氧堆肥過程中添加此微生物菌劑所產(chǎn)生的效果，以期能夠降低堆肥中的氮素損失和氨氣排放量，為氮素保持微生物菌劑的選擇提供更多可能性。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

1.1.1" 菌株的篩選樣本

篩菌樣本選為鮮雞糞和稻殼共堆肥4 d的樣品。取距堆體表層5 cm以下的樣品進行篩菌。

1.1.2" 培養(yǎng)基

無氮培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基配制參考前人配制［12］。生理生化鑒定培養(yǎng)基參考汪蕊露等的研究配制［13］。

1.1.3" 菌株的篩選

從雞糞堆肥中取樣品5 g以 1 ∶10 的比例加入無菌水，攪拌均勻后，采用梯度稀釋法將樣品稀釋成10-1、10-3、10-5、10-7、10-9。將稀釋好的樣品取100 μL均勻涂布于無氮培養(yǎng)基平板上倒置于30 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至長出單菌落。挑選單菌落于平板上劃線純化，經(jīng)過4～5次純化后，得到單一的菌落形態(tài)后進行甘油凍干保存。

1.2" 菌株的生理生化鑒定和分子鑒定

肉眼觀察菌落的顏色、形狀、表面形態(tài)等情況并記錄。將單菌落進行革蘭氏染色后在光學顯微鏡下用100×油鏡進行觀察，記錄染色結果。菌株的生理生化參考汪蕊露等的方法［13］進行鑒定。

將純化好的菌株接入LB液體培養(yǎng)基中置入搖床中，以恒溫30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，使用細菌16S rRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對菌株進行16S rRNA序列擴增。其中Premix Taq 25.00 μL、上游引物0.75 μL、下游引物0.75 μL、菌液2.50 μL、無菌水21.00 μL，制成50.00 μL的反應體系。將反應體系置入PCR儀器進行95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34次循環(huán)后，72 ℃延伸 10 min。將PCR產(chǎn)物進行電泳，有明顯目的條帶后送至武漢金開瑞生物工程有限公司進行測序。

1.3" 菌株的添加對雞糞堆肥的影響

本次試驗地點設置在武漢市農(nóng)業(yè)科學院內。堆肥時間從2023年11月3日開始，11月23日結束，進行為期20 d的堆肥試驗。共設置2個處理。將雞糞和稻殼混合后將碳氮比調整至約25 ∶1。由表1可知，菌株的來源為實驗室使用無氮培養(yǎng)基篩選的菌株，制成菌劑后以0.05%的堆體重（鮮重）添加，在1、3、8、13、20 d取樣，共取樣5次。測定每天的溫度及每次的含水率、pH值、EC（電導率）、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量、總氮含量等，氨氣排放量每隔3 d檢測1次。

其中，溫度采用電子測溫儀在每天10：00、17：00 測溫取平均值；pH值和EC取鮮樣以 1 ∶10 的重量比例添加純水振蕩1 h過濾后用酸度測試儀和電導率儀測定［14］。含水率取5 g鮮樣置于烘干的玻璃器皿上，放入烘箱8 h后取出冷卻至室溫后稱量。銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、總氮含量使用流速儀測算［5］。其中，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮測定稱取5 g鮮樣，以1 ∶10的比例加入2 mol/L的KCL溶液振蕩1 h后過濾用流速儀測定；總氮含量測定用風干樣，稱取 2 g 風干樣于 100 mL 刻度消煮管中，加入5 mL濃硫酸和 2 g 混合催化劑后置于通風櫥150 ℃消解 30 min，250 ℃ 消解30 min，360 ℃消解120 min后，冷卻至室溫用純水稀釋至100 mL于流速儀上測定。氨氣使用硼酸滴定的方法［15］測量。

1.4" 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2019b 32bit進行數(shù)據(jù)分析并制圖，試驗所得數(shù)據(jù)為3次重復的平均值，誤差采用標準偏差表示；利用MEGA軟件進行菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

2" 結果與分析

2.1" 菌株的形態(tài)學和生理生化特征

本次試驗所篩菌株命名為“2”。由圖1-a可知，菌株“2”形態(tài)呈圓形、不透明、表面光滑，菌株“2”進行革蘭氏染色后放在顯微鏡下觀察，顏色呈紫色，判斷結果為陰性，見圖1-b。

對菌株進行生化特性研究發(fā)現(xiàn)，菌株“2”可以

與硝酸鹽和亞硝酸鹽反應，而硝酸鹽和亞硝酸鹽參與了堆肥的硝化和反硝化過程。由表2可知， 試驗結果顯示菌株可利用淀粉。

2.2" 菌株“2”的分子鑒定

對單菌落進行16S rRNA序列擴增，擴增出 1 398 bp 的DNA條帶。將所測菌株的16S rRNA基因序列與NCBI上BLAST進行對比得到相似基因序列，構建16S rRNA的序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。對比序列發(fā)現(xiàn)紫假杜氏桿菌（OP364615.1）與菌株“2”同源性達到99.71%，所以初步定義菌株“2”為杜氏桿菌。

2.3" 菌株的添加對堆肥的影響

由圖3-a可知，在雞糞堆肥中溫度的變化情況。杜氏桿菌制成菌劑施用于雞糞堆肥中，1～2 d為升溫期，2～9 d為高溫期（≥50 ℃），10～14 d為降溫期，15～20 d為腐熟期。杜氏桿菌組升溫迅速，1 d 內溫度升高19 ℃，比CK組高4 ℃。在高溫期，杜氏桿菌組和CK組趨勢相同，均為先升高后下降，最高溫均在5 d，分別為66.9 ℃和63.4 ℃，高溫期分別維持了9 d和8 d。高溫期杜氏桿菌組的累計溫度比CK組溫度高25.3 ℃。降溫期杜氏桿菌組降溫較快，堆肥前期有機物已被微生物利用，后期溫度持續(xù)降低［16］。

由圖3-b可知，堆肥的含水率變化。2個處理均隨著時間推移含水率下降。堆肥開始時含水率約為60%，在堆肥結束時含水率下降至約50%，含水率在前期下降較多。含水率由2個方面決定，一方面為堆體的有機物分解使含水率升高，另一方面為堆體的高溫蒸發(fā)水分使含水率下降。而在此次試驗中含水率降低，但降幅不大，考慮原因為溫度的升高，微生物大量死亡，有機物的代謝變緩慢，且試驗設置在冬天，環(huán)境溫度較低，蒸發(fā)水分能力較弱，使含水率下降有限。

pH值由有機物分解產(chǎn)生的酸和氨化作用產(chǎn)生的氨氣和氫氧根共同決定。由圖3-c可知，堆肥的pH值變化情況。CK組和杜氏桿菌組初始的pH值在8左右，呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，2個組都符合腐熟標準。堆肥過程中由于溫度升高產(chǎn)生銨態(tài)氮導致堆體中氫氧根離子較多，pH值升高，又由于氨氣的揮發(fā)和后期氨化作用的減弱產(chǎn)生了有機酸，所以堆體pH值又在一定程度上降低［17-18］。

堆體中的EC與可溶性鹽含量成正比［19］。由圖3-d可知，整個CK組和杜氏桿菌組的變化趨勢相同，均呈現(xiàn)先上升后下降后期再次上升的趨勢。堆肥前期由于水分的蒸發(fā)以及有機酸小分子等的產(chǎn)生導致堆體EC上升，而后期由于氨氣等的揮發(fā)或鹽基離子沉淀導致EC下降。但在堆肥的整個期間，杜氏處理組的電導率都高于CK組。說明添加微生物提高了堆體中可溶性鹽的含量。

總氮是堆體內各種氮素形式的總和。堆體中的有機氮會轉化成各種形式的氮逸出堆體，但隨著干物質的減少和微生物固氮作用的發(fā)生也有助于總氮含量的升高［19］?？偟緾K組和杜氏處理組變化趨勢類似， 由圖4-a可知，呈現(xiàn)先上升后下

降的趨勢?？偟吭?～3 d均上升，其中，CK組含量升高21.2%， 杜氏桿菌處理組升高35.1%， 杜氏桿菌組升幅較大。CK組在3～8 d總氮含量呈上升趨勢，雖杜氏桿菌組呈下降趨勢但總氮含量仍高于CK組。在堆肥結束時，CK組的總氮含量為 13.28 g/kg，杜氏桿菌組的總氮含量為14.55 g/kg。在整個堆肥過程中，CK組的總氮含量提高13.4%，杜氏桿菌組的總氮含量提高15.5%。在高溫期總氮含量升高的同時硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量也升高，說明添加杜氏桿菌可增加堆體中的氮素含量。

銨態(tài)氮是堆肥中氮素損失的主要來源，銨態(tài)氮的變化受溫度、pH值、氨氧化細菌的影響。堆肥中銨態(tài)氮含量的多少表明了微生物分解利用氮的情況。由圖4-b可知，CK組和菌劑組銨態(tài)氮含量變化情況基本一致。在高溫期銨態(tài)氮含量上升，CK組在8 d達最大值，杜氏桿菌組在13 d達最大值，然后趨于平穩(wěn)，在腐熟期銨態(tài)氮含量大量下降。堆肥結束時，銨態(tài)氮含量CK組和杜氏桿菌組分別增加15.2%和30.7%。堆肥前期銨態(tài)氮含量增大是有機氮在微生物作用下被分解成氨氣和銨態(tài)氮，使得銨態(tài)氮含量上升。

由圖4-c可知，硝態(tài)氮含量先上升后下降。試驗開始時杜氏桿菌組比CK組含量稍高，在3 d時杜氏桿菌組達到最高，此時，CK組和杜氏桿菌組硝態(tài)氮含量的增幅分別為16.23%和21.1%。而CK組在8 d時達到最高，且之后均下降，整體趨勢相同。堆肥結束時，杜氏桿菌組硝態(tài)氮含量的增幅稍高于CK組。堆體前期在銨態(tài)氮含量較高的時期，堆體溫度還未完全抑制硝化反應，使銨態(tài)氮可以轉化為硝態(tài)氮，硝態(tài)氮濃度上升。隨著堆體持續(xù)高溫，硝化反應被抑制，且銨態(tài)氮含量的持續(xù)下降導致硝態(tài)氮含量沒有增加的趨勢。堆體中使用杜氏桿菌菌劑能在初始階段加速銨態(tài)氮向硝態(tài)氮的轉換，促進硝態(tài)氮含量的增加［4］。

氨氣的產(chǎn)生受溫度、pH值、水分等的影響。由圖5可知，氨氣排放呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，堆肥前期由于溫度的升高氨氣排放量整體較多。排放量在4～6 d內達到峰值，且CK的氨氣排放量增加較多。在高溫期，pH值上升會導致氨氣的溶解度減少，氨氣排放量增加。在堆肥中，氨氣和銨態(tài)氮含量存在平衡的關系。后期氨氣排放量下降可能是有機氮更多礦化生成了銨態(tài)氮。在8 d時杜氏桿菌組的銨態(tài)氮含量下降而相應的氨氣排放量雖呈下降趨勢，但降低幅度不及CK組也驗證了這一理論。

由圖6可知，杜氏桿菌的加入對堆肥基本的理化性質以及各種形態(tài)氮含量的影響。在所列的7個

維度中，杜氏桿菌的加入對含水率、pH值的影響并不大；相比較總氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的含量可知，加入杜氏桿菌有助于各種形態(tài)氮的積累；而CK組的氨氣排放量是多于杜氏桿菌組的，說明菌劑的添加在一定程度上有助于氮素的累積且減少氨氣排放。

3" 討論

在畜禽糞便實現(xiàn)資源化、無害化的過程中存在著堆肥周期長，營養(yǎng)物質流失等問題［20］，而添加微生物可加速堆體升溫加快腐熟，減少氮素損失。因此研制出高效的微生物菌劑尤為重要。

好氧堆肥過程中溫度是判斷堆肥腐熟的重要因素。研究表明，加入杜氏桿菌能夠提高堆體溫度，加速堆體升溫，且在高溫期維持較高的溫度［21］。堆體的含水率由有機物的氧化分解和物料的水分蒸發(fā)共同影響。本研究中的含水率下降趨勢不明顯猜測是試驗設置在冬天，由于室外環(huán)境溫度較低不利于水分的蒸發(fā)。pH值能夠影響堆肥的腐熟進程，pH值較高或者較低都會影響微生物的活動。pH值與銨態(tài)氮含量之間存在正相關關系，在堆肥過程中，銨態(tài)氮含量的升高導致氫氧根離子的形成，所以在銨態(tài)氮含量升高的區(qū)間pH值也呈現(xiàn)了較高的趨勢，而銨態(tài)氮含量下降的區(qū)間，pH值也同步降低［22］。堆體中EC過高會造成土壤的滲透壓過高，會對土壤造成鹽害，過低則營養(yǎng)不足。有機質的分解以及銨態(tài)氮和氨氣的揮發(fā)等都會影響EC的數(shù)值。本試驗中杜氏桿菌菌劑組的EC均高于CK組，這與馮雯雯等得出的結論［23］一致，即菌劑的添加會導致堆體中的EC增加。

在堆肥中氮素轉換主要經(jīng)過硝化、反硝化、固持、固氮、氨化等環(huán)節(jié)，圖7為參考李麗劼的研究［19］進行繪制。在堆肥中各種形態(tài)氮的含量變化為氮素轉化提供依據(jù)。

在這個過程中有機氮先礦化或氨化生成銨態(tài)氮和氨氣，氨氣進入大氣，而微生物與亞硝酸鹽反應將銨態(tài)氮轉換成亞硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮與硝酸鹽反應生成硝態(tài)氮，從銨態(tài)氮到硝態(tài)氮為硝化反應［24］。而硝酸鹽發(fā)生反硝化作用生成一氧化二氮、一氧化氮，最終生成氮氣逸出。固氮微生物將空氣中的氮氣固定下來轉化為氨氣，重新進入堆體的氮循環(huán)［19］，這是整個氮素循環(huán)的途徑。在堆肥中，由于高溫期硝化細菌硝化能力的減弱，導致銨態(tài)氮更多的以氨氣的形式揮發(fā)。而杜氏桿菌的加入在銨態(tài)氮增多的情況下，氨氣并沒有增多，而是生成更多的硝態(tài)氮。說明杜氏桿菌可以與堆體中的亞硝酸鹽和硝酸鹽反應，為銨態(tài)氮向硝態(tài)氮的轉化過程助力。而總氮含量的增加也在一定程度上說明在堆肥中，杜氏桿菌的加入有助于氮氣向氨氣的轉化，使氨氣重新進入有機氮、銨態(tài)氮、氨氣這個循環(huán)。

4" 結論

利用無氮培養(yǎng)基篩選的菌株經(jīng)16S rRNA測序以及生理生化鑒定確認為杜氏桿菌。杜氏桿菌應用于雞糞的好氧堆肥，能快速升高堆體溫度，延長高溫期，且pH值和EC均在合理的范圍內，說明杜氏桿菌能推動雞糞好氧堆肥過程的進行。在氮素轉化過程中，促進堆肥后期硝態(tài)氮含量的積累，減少了堆肥高溫期氨氣的排放量，在一定程度上促進了雞糞好氧堆肥中的氮素保持。杜氏桿菌為雞糞堆肥中氮素保持微生物菌劑的選擇提供了多一種選項。

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