基于VIGS的不同表達(dá)載體混合接種對(duì)烤煙煙堿代謝的影響

摘要：煙堿的代謝具有復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中眾多基因間存在相互影響，為探究不同基因共同沉默后對(duì)煙堿代謝通路以及葉片煙堿含量的影響。使用前期構(gòu)建的煙堿代謝途徑中3個(gè)功能基因（NtA622、NtPMT、NtBBL）和1個(gè)調(diào)控基因（NtMYB305a）病毒載體，利用病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）技術(shù)依據(jù)基因在煙堿代謝中的作用性質(zhì)和作用階段，設(shè)置不同載體組合浸染液接種處理，測(cè)定各處理的基因相對(duì)表達(dá)量、酶活性、煙堿含量，系統(tǒng)分析目的基因沉默效率以及沉默后對(duì)其他基因表達(dá)的影響，并探究各處理的基因平均沉默效率對(duì)煙堿降低率的貢獻(xiàn)度。結(jié)果表明，各處理沉默相應(yīng)目的基因，會(huì)在一定程度上影響本研究中其他目的基因的表達(dá)，其中NtA622基因受影響較小，而NtPMT、NtBBL基因受影響較大；各處理煙堿含量均得到降低，其中D6處理4個(gè)基因共同沉默后煙堿含量降低幅度最大，PMT、BBL活性與煙堿含量趨勢(shì)基本一致，A622活性與煙堿含量趨勢(shì)不完全一致；基因平均沉默效率低于煙堿含量降低率越多，說(shuō)明對(duì)煙堿降低的貢獻(xiàn)度越大，基因平均沉默效率高于煙堿含量降低率越多，說(shuō)明對(duì)煙堿降低的貢獻(xiàn)度越小。由此可知，利用VIGS技術(shù)可有效沉默目的基因的表達(dá)，進(jìn)而降低葉片中煙堿含量，其中4個(gè)基因共同沉默后，煙堿含量降低最多；在煙堿代謝途徑上，NtA622基因相對(duì)較穩(wěn)定，而NtPMT與NtBBL基因相對(duì)不穩(wěn)定；PMT、BBL活性與煙堿含量趨勢(shì)基本一致。本研究為烤煙煙堿的分子調(diào)控提供了理論和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：VIGS；混合載體；煙堿；基因表達(dá)量；酶活性；基因平均沉默效率

中圖分類(lèi)號(hào)：S572.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）03-0016-07

卜亞艇，李" 偉，許燕彪，等. 基于VIGS的不同表達(dá)載體混合接種對(duì)烤煙煙堿代謝的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2025，53（3）：16-23.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2025.03.003

收稿日期：2024-07-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32372178）；福建省煙草公司南平市公司科技計(jì)劃（編號(hào)：2021350700240072、2022350700240103）。

作者簡(jiǎn)介：卜亞艇（1998—），女，河南開(kāi)封人，碩士研究生，從事煙草遺傳育種研究。E-mail：15637855832@163.com。

通信作者：楊再軍，碩士，從事烤煙生產(chǎn)技術(shù)研究，E-mail：yangzaijun528@163.com；鄭" 聰，碩士，農(nóng)藝師，從事烤煙生產(chǎn)技術(shù)研究，E-mail：npyczc@163.com；徐世曉，博士，副教授，從事煙草遺傳育種研究，E-mail：xushixiao@henau.edu.cn。

對(duì)于煙草而言，煙堿的存在是其具有獨(dú)特魅力和商品價(jià)值的重要因素，作為煙草特有的活性化學(xué)成分，不僅直接影響著葉片的生理活性，還是煙草制品成癮性的主要成分［1-2］。煙堿的合成場(chǎng)所在煙株的根部，其他組織或器官均不具備合成煙堿的能力［3］。煙堿的代謝途徑已基本明確，大致可由3個(gè)步驟組成（圖1），包括吡啶環(huán)和吡咯環(huán)的形成以及2環(huán)的結(jié)合［4］。

在煙堿代謝途徑里的吡咯環(huán)形成中，腐胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）具有催化作用，能夠催化腐胺生成S-腺苷甲硫氨酸和N-甲基腐胺［6］。同時(shí)PMT也是煙堿生物合成的關(guān)鍵控制酶，控制著初級(jí)代謝產(chǎn)物向次級(jí)代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，供應(yīng)煙堿合成所需的N-甲基吡咯啉陽(yáng)離子［7］。A622是一個(gè)異類(lèi)黃酮還原酶基因，通過(guò)消減雜交技術(shù)與PMT一起分離得到［8］；小檗堿橋接酶（BBL）基因家族存在于細(xì)菌、真菌和植物里，該基因家族在煙堿合成途徑的下游發(fā)揮作用［9］。研究表明，PIP家族異類(lèi)黃酮還原酶類(lèi)蛋白A622參與煙堿代謝途徑里的吡啶環(huán)形成［9］，同時(shí)與小檗堿橋接酶類(lèi)蛋白BBL共同參與煙堿合成的最后步驟：吡啶環(huán)與吡咯環(huán)的結(jié)合［10-11］。在煙草中，NtMYB305a屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族，是擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtMYB21和AtMYB24的同源基因，研究證實(shí)NtMYB305a可以顯著調(diào)控?zé)煵葜袩焿A的合成，過(guò)表達(dá)或者沉默NtMYB305a會(huì)顯著提高或降低煙草葉片中的煙堿含量，同時(shí)對(duì)煙草煙堿合成基因NtPMT、 NtA622以及NtBBL的表達(dá)具有調(diào)

控作用［12-13］。煙堿的生物合成和累積受到遺傳基礎(chǔ)、生態(tài)環(huán)境、栽培措施、外源物質(zhì)、采收與調(diào)制等因素的影響，然而經(jīng)濟(jì)效益差和工序繁瑣是導(dǎo)致眾多調(diào)節(jié)煙堿含量的措施沒(méi)有得到廣泛推廣的主要原因［14］。

基因沉默的本質(zhì)是降低或者停止基因在植株體內(nèi)的表達(dá)。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）屬于轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默，無(wú)需依靠轉(zhuǎn)基因植株就可以在植物體內(nèi)短時(shí)間且精確地完成對(duì)內(nèi)源目的基因完成沉默［15］。VIGS技術(shù)具有高效性，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法將含目的基因片段的病毒載體導(dǎo)入植株中，在植株中能進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳導(dǎo)，進(jìn)而完成系統(tǒng)沉默，從很大程度上節(jié)約了人力物力。目前VIGS技術(shù)已在植物功能基因的鑒定和植物抗病抗蟲(chóng)基因研究中被廣泛使用［16-17］。近年來(lái)，在煙草中也有大量應(yīng)用，姚怡帆等利用VIGS技術(shù)沉默NtPPO8基因，有效降低其基因表達(dá)量，進(jìn)而降低PPO（多酚氧化酶）活性，提高煙葉耐烤性［18］；崔露瑩等構(gòu)建NtHDZIV8基因的沉默載體，初步驗(yàn)證了該基因?qū)煵菹倜l(fā)育的調(diào)控作用［19］；郭玉鴿等利用VIGS技術(shù)將混合載體菌液接種到普通煙草中，目的基因得到不同的沉默效率［20］。盡管有研究表明利用VIGS技術(shù)在本氏煙草中沉默腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，能夠降低本氏煙草中煙堿含量，但并沒(méi)有在普通栽培煙草中進(jìn)行驗(yàn)證［21］。在降低煙草中煙堿含量方面，國(guó)內(nèi)外研究人員在多個(gè)途徑上進(jìn)行了大量研究，但利用VIGS技術(shù)通過(guò)對(duì)煙堿代謝通路上不同基因進(jìn)行組合式沉默還鮮有報(bào)道。

煙堿生物合成是受眾多基因共同作用的結(jié)果，然而在煙堿代謝途徑中基因發(fā)揮功能的位置不一致，并且調(diào)控基因與功能基因之間存在相互作用。因此，本研究使用筆者所在實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的4個(gè)VIGS病毒載體，依據(jù)基因性質(zhì)（功能基因：NtA622、NtPMT、NtBBL；調(diào)控基因：NtMYB305a）和作用階段（NtPMT作用于上游，NtA622、NtBBL共同作用于下游）進(jìn)行不同載體混合，探究各混合載體處理接種后基因相對(duì)表達(dá)量之間的差異，以及酶活性和煙堿含量的變化，從而篩選出煙堿含量降低率較高的混合接種處理，以期為生物技術(shù)手段降低烤煙煙堿含量提供理論基礎(chǔ)，提高煙葉在工業(yè)企業(yè)中的適配性。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

供試品種為云煙87，含沉默目的基因片段（保守區(qū)段）的病毒載體pTRV2-NtA622、pTRV2-NtPMT、pTRV2-NtBBL、pTRV2-NtMYB305a以及pTRV1、pTRV2的原始菌液（活性良好）均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)于2023年4月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)煙草基地大棚內(nèi)進(jìn)行，材料采用盆栽種植，除試驗(yàn)因素外，其余盆栽管理措施保持一致。

1.2" 試驗(yàn)方法

1.2.1" 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

共設(shè)置8個(gè)處理（表1）。混合載體組合依據(jù)為：3個(gè)功能基因分別與調(diào)控基因的組合沉默（D1、D2、D3），煙堿代謝途徑中下游2個(gè)功能基因的組合沉默以及2個(gè)功能基因與調(diào)控基因的組合沉默（D4、D5），3個(gè)功能基因共同與調(diào)控基因的組合沉默（D6）。每個(gè)處理選取10株6葉1心時(shí)期煙苗，要求煙苗長(zhǎng)勢(shì)均勻一致無(wú)病蟲(chóng)害，各處理每株煙苗接種對(duì)應(yīng)的4 mL混合浸染液。

1.2.2" 接種體系的構(gòu)建

制備LB培養(yǎng)基（50 μg/mL 卡那霉素、50 μg/mL利福平），高溫高壓滅菌后分別接種含沉默目的基因片段的病毒載體 pTRV2-NtA622、pTRV2-NtPMT、pTRV2-NtBBL、pTRV2-NtMYB305a以及pTRV1、pTRV2的原始菌液，轉(zhuǎn)入搖床（28 ℃，200 r/min）避光恒溫培養(yǎng) 24 h，調(diào)整培養(yǎng)菌液濃度D600 nm為0.8～1.0；按照各處理所需對(duì)應(yīng)的混合病毒載體菌液分別與pTRV1等體積混合，取混合菌液50 mL高速離心 2 min，棄上清液，加入50 mL農(nóng)桿菌浸染緩沖液（50 mmol/L 氯化鈉、50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸、0.1 mmol/L乙酰丁香酮），充分搖勻后避光2 h備用；采用注射接種法對(duì)各個(gè)處理煙苗的嫩葉背面進(jìn)行接種，避開(kāi)支脈，每株煙苗注射左右對(duì)稱(chēng)的2張葉，每張葉注射面積的直徑約1 cm。

1.3" 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1" 基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

取各處理接種后15 d的煙株根部2 cm長(zhǎng)的不定根，清水洗凈后去除雜質(zhì)用吸水紙吸干水分，消毒后液氮凍存?zhèn)溆?，每個(gè)處理取3份樣品作生物學(xué)重復(fù)；將樣本通過(guò)液氮研磨，參照RNA試劑盒說(shuō)明提取總RNA，參照北京全式金生物公司Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA；根據(jù)目的基因片段序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表2），以煙草26S rRNA為內(nèi)參基因進(jìn)行各目的基因的qRT-PCR檢測(cè)，技術(shù)重復(fù)3次，分析檢測(cè)結(jié)果中的CT值，采用2–ΔΔCT法分析各目的基因的相對(duì)表達(dá)量；以CK、CK1為試驗(yàn)對(duì)照組，CK目的基因相對(duì)表達(dá)量為1；D1～D6為試驗(yàn)組。

目的基因沉默效率的計(jì)算公式為：沉默效率=（1-試驗(yàn)組目的基因相對(duì)表達(dá)量）×100%。

1.3.2" 酶活性的測(cè)定

同時(shí)對(duì)根部所取樣品進(jìn)行研磨，加入樣品體積9倍的提取液（pH值7.4 PBS緩沖液），于4 ℃、8 000 r/min，高速離心30 min，取上清液待用，參照酶活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明，采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分別測(cè)定腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）、小檗堿橋接酶類(lèi)蛋白（BBL）、異類(lèi)黃酮還原酶（A622）活性。

1.3.2" 煙堿含量的測(cè)定

同時(shí)取各處理煙株新生頂部葉片3份，作生物學(xué)重復(fù)，在烘箱105 ℃下殺青30 min，60 ℃下烘干至恒定干重；對(duì)各處理殺青樣品去除主脈和支脈，研磨過(guò)60目篩，取粉狀樣品0.25 g，加入5%乙酸，振蕩30 min后取過(guò)濾液采用連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀（AA3，德國(guó) Seal 公司）測(cè)定煙堿含量。

煙堿含量降低率的計(jì)算公式為：煙堿含量降低率=（對(duì)照組煙堿含量-試驗(yàn)組煙堿含量）/對(duì)照組煙堿含量×100%。

基因平均沉默效率對(duì)煙堿含量降低率的貢獻(xiàn)度公式為：貢獻(xiàn)度=煙堿含量降低率/基因平均沉默效率。

1.3" 測(cè)定指標(biāo)

使用Excel 2010和DPS 7.05軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncans新復(fù)極差法比較不同處理間測(cè)定指標(biāo)的顯著差異分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 各處理沉默后相關(guān)基因表達(dá)量差異分析

由圖2至圖7可知，各處理接種后15 d，各基因在CK與CK1中均無(wú)顯著差異。

由圖2可知，D1處理接種后，目的基因NtA622、NtMYB305a相對(duì)表達(dá)量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為34.55%、45.59%；NtBBL和NtPMT基因均表現(xiàn)下調(diào)，其中NtBBL基因下調(diào)幅度最小，二者基因相對(duì)表達(dá)量差異顯著。

由圖3可知，D2處理接種后，目的基因NtPMT、NtMYB305a相對(duì)表達(dá)量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為61.99%、46.59%；NtA622基因相對(duì)表達(dá)量與CK、CK1無(wú)顯著差異，NtBBL基因表現(xiàn)下調(diào)，各基因相對(duì)表達(dá)量之間均存在顯著差異。

由圖4可知，D3處理接種后，目的基因NtBBL、NtMYB305a相對(duì)表達(dá)量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為57.22%、 44.02%； NtA622基因相對(duì)

表達(dá)量與CK、CK1無(wú)顯著差異，NtPMT基因表現(xiàn)下調(diào)，各基因相對(duì)表達(dá)量之間均存在顯著差異。

由圖5可知，D4處理接種后，目的基因NtA622、NtBBL相對(duì)表達(dá)量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為11.30%、48.44%；NtPMT和NtMYB305a基因均表現(xiàn)下調(diào)；各基因相對(duì)表達(dá)量之間均存在顯著差異。

由圖6可知，D5處理接種后，目的基因NtA622、NtBBL、NtMYB305a相對(duì)表達(dá)量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為20.82%、53.68%、41.07%；NtPMT基因表現(xiàn)下調(diào)，下調(diào)幅度低于目的基因NtBBL、NtMYB305a的降低幅度；各基因相對(duì)表達(dá)量之間均存在顯著差異。

由圖7可知，D6處理接種后，目的基因NtA622、 NtPMT、 NtBBL、 NtMYB305a相對(duì)表達(dá)量較CK、CK1均顯著降低，沉默效率分別為14.75%、61.56%、63.82%、47.02%。其中NtA622基因相對(duì)表達(dá)量最高，NtBBL基因相對(duì)表達(dá)量最低，與NtPMT基因差異不顯著。

2.2" 各處理沉默后相關(guān)酶活性的差異分析

由圖8可知，CK與CK1中A622活性無(wú)顯著差異；試驗(yàn)組D2處理與D3處理的A622活性較CK略有降低但未達(dá)到顯著水平，其余試驗(yàn)組較CK均顯著降低。其中D5、D6處理之間的A622活性差異不顯著，較CK分別降低了2.89、3.10 U/L，D1處理的A622活性最低，為8.21 U/L，較CK降低幅度最大，為3.80 U/L。

由圖9可知，CK與CK1中PMT活性無(wú)顯著差異，其余試驗(yàn)組較CK均顯著降低。其中D1、D3、D4處理之間的PMT活性差異不顯著，較CK分別降低了1.09、1.13、1.00 U/L；D3處理與D5處理之間的PMT活性差異不顯著，D5處理較CK降低了 1.47 U/L；D6處理的PMT活性最低，為 1.76 U/L，與D2處理差異不顯著，D2處理與D6處理較CK分別降低了1.93、2.05 U/L。

由圖10可知，CK與CK1中BBL活性無(wú)顯著差異，其余試驗(yàn)組較CK均顯著降低。其中D1處理的BBL活性較CK降低幅度最小，為13.03 ng/L；D3處理與D5處理之間的BBL活性差異不顯著，較CK分別降低了57.03、59.11 ng/L；D6處理的BBL活性最低，為72.65 ng/L，較CK降低了 69.71 ng/L。

2.3" 各處理沉默后葉片煙堿含量的差異分析

由圖11可知，接種混合浸染液15 d，各處理的煙堿含量較對(duì)照組CK與空載體對(duì)照組CK1都有不同程度的下降。其中CK與CK1的葉片煙堿含量變化無(wú)明顯差異，其余試驗(yàn)組葉片煙堿含量較CK均存在顯著差異，葉片煙堿含量降低最少的是D1處理，煙堿含量為0.72%，較CK降低21.84%；D2處理與D3處理無(wú)顯著差異，D3處理與D4處理無(wú)顯著差異；葉片煙堿含量降低最多的是D6處理，煙堿含量為0.41%，較CK降低55.86%。

2.4" 各處理平均沉默效率對(duì)煙堿降低率的貢獻(xiàn)度分析

由圖12可知，D2處理的基因平均沉默效率最高，與D3處理差異不顯著，但顯著高于其他處理，D4處理的基因平均沉默效率最低，顯著低于其他處理；D6處理煙堿含量降低率顯著高于其他處理，D1處理的煙堿含量降低率最低。通過(guò)分析，D1處理的基因平均沉默效率對(duì)煙堿含量的降低率貢獻(xiàn)度最低，為0.545；D6基因平均沉默效率對(duì)煙堿含量的降低率貢獻(xiàn)度最高，為1.194。

3" 討論與結(jié)論

煙堿生物合成調(diào)控的相關(guān)研究一直是煙草學(xué)科的前沿課題，不同的煙草工業(yè)企業(yè)對(duì)煙葉原料的煙堿高低偏愛(ài)不一。部分烤煙種植區(qū)片面追求煙葉產(chǎn)量，大量追加氮肥，導(dǎo)致出現(xiàn)煙葉常規(guī)化學(xué)成分協(xié)調(diào)性差、煙堿含量偏高等問(wèn)題［22］。楊淳婷等通過(guò)煙茄嫁接的方法對(duì)白肋煙換根，能夠顯著降低葉片中的煙堿含量，但過(guò)多降低煙堿含量導(dǎo)致了煙葉香氣量減少，勁頭、刺激性明顯減?。?3］。張明月利用RNAi技術(shù)成功降低了PMT基因表達(dá)量，進(jìn)而降低葉片煙堿含量，但只沉默了單一基因［24］。

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，針對(duì)煙堿生物合成的調(diào)控方式也不再局限于大田措施，越來(lái)越多的調(diào)控手段開(kāi)始從煙堿的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和上游調(diào)控等方面入手。煙堿的生物合成受代謝途徑中多個(gè)基因共同調(diào)控。有研究表明，將不同基因片段同時(shí)組合到TRV病毒載體上，可顯著降低2個(gè)基因的表達(dá)量，說(shuō)明VIGS可用于同時(shí)沉默2個(gè)目標(biāo)基因［25-26］；也有研究表明，VIGS 技術(shù)體系采用葉片接種后病毒可高效擴(kuò)散到受體植株的根、莖和葉等器官，并且在受體植株根中能檢測(cè)到目的基因的表達(dá)量有效降低［27-28］。本研究結(jié)果表明，利用VIGS 技術(shù)對(duì)代謝途徑中4個(gè)關(guān)鍵基因分別進(jìn)行組合式沉默是可行的，成功降低了煙草根中目的基因的表達(dá)量，進(jìn)而降低葉片中煙堿含量。

本研究結(jié)果表明：D1處理的目的基因NtA622、NtMYB305a表現(xiàn)下調(diào)，NtBBL和NtPMT基因均表現(xiàn)下調(diào)；D2處理目的基因NtPMT、NtMYB305a表現(xiàn)下調(diào)，NtA622基因無(wú)顯著變化，NtBBL基因表現(xiàn)下調(diào)；D3處理目的基因NtBBL、NtMYB305a表現(xiàn)下調(diào)，NtA622基因無(wú)顯著變化，NtPMT基因表現(xiàn)下調(diào)；D4處理的目的基因NtA622、NtBBL表現(xiàn)下調(diào)，NtPMT和NtMYB305a基因均表現(xiàn)下調(diào)；D5處理的目的基因NtA622、NtBBL、NtMYB305a表現(xiàn)下調(diào)，而NtPMT基因也表現(xiàn)下調(diào)；D6處理的目的基因NtA622、NtPMT、NtBBL、NtMYB305a均表現(xiàn)下調(diào)。綜上所述，表明NtMYB305a沉默后會(huì)導(dǎo)致其他目的基因的表達(dá)下調(diào)，這與卞士權(quán)的研究結(jié)果［29］相似，NtMYB305a可以對(duì)NtA622、NtPMT、NtBBL基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控；各處理沉默相應(yīng)目的基因后，會(huì)在一定程度上影響本研究中其他目的基因的表達(dá)，這與郭玉鴿等的研究結(jié)果［20］相似。根據(jù)本研究各處理沉默后各基因表達(dá)量的差異分析，NtA622基因的表達(dá)受其他基因的影響較小，原因可能是NtA622不僅參與吡啶環(huán)與吡咯環(huán)的結(jié)合，還參與其他生物堿合成的吡啶環(huán)形成途徑中煙酸衍生物前體的形成［11］。NtPMT基因的表達(dá)受其他基因的影響較大，有研究表明，NtPMT基因主要作用是在吡咯環(huán)形成途徑中催化腐胺能夠生成S-腺苷甲硫氨酸和N-甲基腐胺［30］，是煙堿代謝途徑中的上游基因；NtBBL基因的表達(dá)受其他基因的影響也較大。BBL蛋白雖然參與煙堿形成的最后階段，但NtBBL的作用階段是在吡啶環(huán)和N-甲基-吡咯環(huán)起始縮合之后，這個(gè)階段屬于煙堿代謝途徑中的下游［31］。

本研究結(jié)果表明，PMT、BBL活性與煙堿含量趨勢(shì)基本一致，A622活性與煙堿含量趨勢(shì)不完全一致，各處理的煙堿含量均顯著降低，表明各處理沉默對(duì)應(yīng)基因后對(duì)葉片煙堿含量的降低是有效果的，且蒲媛媛研究認(rèn)為，A622活性與煙堿含量達(dá)到顯著正相關(guān)，BBL活性與煙堿含量呈負(fù)相關(guān)［32］，本研究結(jié)果與之略有差異；有研究表明，PMT活性與煙堿含量成正比［7］，本研究結(jié)果與之一致。

貢獻(xiàn)度可以表示混合載體接種后的目的基因平均沉默效率對(duì)煙堿含量降低多少的影響力。本研究通過(guò)分析各處理基因平均沉默效率與煙堿降低率的關(guān)系，表明基因平均沉默效率低于煙堿含量降低率越多，說(shuō)明對(duì)煙堿降低的貢獻(xiàn)度越大；基因平均沉默效率高于煙堿含量降低率越多，說(shuō)明對(duì)煙堿降低的貢獻(xiàn)度越小。

本研究建立的VIGS技術(shù)體系同時(shí)沉默4個(gè)目的基因的表達(dá)，基因平均沉默效率46.78%，進(jìn)而有效降低煙堿含量，煙堿含量降低率55.85%，平均沉默效率對(duì)煙堿降低的貢獻(xiàn)度達(dá)1.194。在煙堿代謝途徑上，NtA622基因相對(duì)較穩(wěn)定，而NtPMT與NtBBL基因相對(duì)不穩(wěn)定；PMT、BBL活性與煙堿含量趨勢(shì)基本一致。本研究進(jìn)一步為煙堿合成的生物調(diào)控提供理論基礎(chǔ)，對(duì)于煙草栽培和育種工作等有重要科學(xué)意義。

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