鱉甲煎丸調控AKT/mTOR信號通路在肝癌細胞有氧糖酵解中的作用

摘要：目的利用細胞實驗探索鱉甲煎丸對肝細胞癌增殖、遷移及有氧糖酵解的抑制作用，并探索其內在機制。方法選取人肝癌細胞株（Huh7）作為研究對象，隨機將SD大鼠分為空白血清組、鱉甲煎丸高、中、低劑量組及抑制劑組，制備含藥大鼠血清，用以孵育Huh7細胞。CCK-8、劃痕實驗探索鱉甲煎丸對肝癌細胞的增殖、遷移的影響，糖酵解限速酶及代謝產物檢測探索鱉甲煎丸對肝癌細胞有氧糖酵解的影響，RT-qPCR、Western Blot實驗探索鱉甲煎丸對AKT/mTOR信號通路的mRNA、相關蛋白及磷酸化的表達。多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t或Dunnettg T3檢驗。結果與空白血清組相比，鱉甲煎丸組的OD值、不同時間段的遷移率、糖酵解限速酶（己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶）及糖酵解代謝產物（丙酮酸、乳酸、ATP）檢測均顯著降低（P值均lt;0.05）；RT-qPCR結果顯示，與空白血清組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組的mTOR mRNA表達水平均下調，高、低劑量組的AKT mRNA表達水平下調（P值均lt;0.05）；Western Blot結果顯示，與空白血清組比較，鱉甲煎丸高、中、低劑量組的mTOR相關蛋白及磷酸化蛋白表達水平均下調，高、中劑量組的AKT相關蛋白及磷酸化蛋白表達水平均下調（P值均lt;0.05）。結論初步驗證了鱉甲煎丸含藥血清可以抑制人肝癌細胞Huh7細胞的有氧糖酵解，從而抑制其增殖、遷移，其機制可能與抑制AKT/mTOR信號通路的相關蛋白表達有關。

關鍵詞：鱉甲煎丸；肝腫瘤，實驗性；瓦爾堡效應，腫瘤學

基金項目：廣西自然科學基金（2022GXNSFAA035460，2024GXNSFDA010005）；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目（YCSW2023395，YCSY2023021）；廣西中醫(yī)藥大學引進博士科研啟動基金項目（2022BS026）

Effect of Biejia Decoction Pill on aerobic glycolysis in hepatocellular carcinoma by regulating the protein kinase B/mammalian target of rapamycin signaling pathway

TAN Qinwen1，HUANG Jingjing2，3，ZHONG Ruixi1，DU Yuanqin1，XU Jian1，NONG Jinli1，PENG Yujiao1

1.Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China；2.Department of Spleen，Stomach and Hepatology，The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China；3.Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine，Nanning 530023，China

Corresponding author：HUANG Jingjing，55869563@qq.com（ORCID：0000-0002-4932-0838）

Abstract：Objective To investigate the inhibitory effect of Biejia Decoction Pill on the proliferation，migration，and aerobic glycolysis of hepatocellular carcinoma（HCC）using cell experiments，as well as related mechanisms.Methods Human liver cancer cell line Huh7 was selected，and Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank serum group，inhibitor group，and high-，middle-，and low-dose Biejia Decoction Pill groups.Rat serum containing the drug was prepared for the incubation of Huh7 cells.CCK8 assay and scratch assay were used to explore the effect of Biejia Decoction Pill on the proliferation and migration of"HCC cells；glycolytic rate-limiting enzymes and metabolites were measured to explore the effect of Biejia Decoction Pill on aerobic glycolysis of liver cancer cells；RT-qPCR and Western blot were used to explore the effect of Biejia Decoction Pill on the mRNA expression，related proteins，and phosphorylation of the protein kinase B（AKT）/mammalian target of rapamycin（mTOR）signaling pathway.A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups，and the least significant difference t-test or the Dunnett’s T3 test were used for further comparison between two groups.Results Compared with the blank serum group，the Biejia Decoction Pill groups had significant reductions in OD value，migration rate during different periods of time，glycolytic rate-limiting enzymes（hexokinase，phosphofructokinase，pyruvate kinase），and glycolytic metabolites（pyruvate，lactic acid，ATP）（all Plt;0.05）.RT-qPCR results showed that compared with the blank serum group，the high-，middle-，and low-dose Biejia Decoction Pill groups had a significant reduction in the mRNA expression level of mTOR，and the high-and low-dose Biejia Decoction Pill groups had a significant reduction in the mRNA expression level of AKT（all Plt;0.05）.Western blot results showed that compared with the blank serum group，the high-，middle-，and low-dose Biejia Decoction Pill groups had significant reductions in the expression levels of mTOR-related proteins and phosphorylated proteins，and the high-and middle-dose Biejia Decoction Pill groups had significant reductions in the expression levels of AKT-related proteins and phosphorylated proteins（all Plt;0.05）.Conclusion This study preliminarily verifies that the serum containing Bijia Decoction Pill can inhibit the aerobic glycolysis of human hepatoma Huh7 cells，thereby inhibiting their proliferation and migration，possibly by inhibiting the expression of the proteins related to the AKT/mTOR signaling pathway.

Key words：Bie Jia Jian Wan；Liver Neoplasms，Experimental；Warburg Effect，Oncologic

Research funding：Guangxi Natural Science Foundation（2022GXNSFAA035460，2024GXNSFDA010005）；Guangxi Graduate Education Innovation Program（YCSW2023395，YCSY2023021）；Guangxi University of Traditional Chinese Medicine Introduction of Doctoral Research Fund Project（2022BS026）

肝臟是人體代謝中心，是糖代謝重要的場所。正常細胞在有氧條件下，主要通過線粒體氧化磷酸化獲得能量；而無氧環(huán)境下，細胞會在己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的催化下，產生丙酮酸、乳酸、ATP等代謝產物，為細胞提供能量。“瓦伯格”效應指出，癌細胞在有氧情況下也依賴糖酵解提供能量，有氧糖酵解是肝癌細胞代謝的主要方式之一。中醫(yī)認為，肝癌具有寒熱錯雜、虛實夾雜的特點，治療上以扶正固本、活血化瘀、解毒散結為原則。鱉甲煎丸是中醫(yī)經典方劑，具有調節(jié)寒熱，補益氣血、活血散瘀、解毒散結的功效。現(xiàn)代研究［1］也表明，鱉甲煎丸可抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展，且具有確切的臨床療效，是目前常用的抗癌方劑，但其抗癌內在機制尚未有統(tǒng)一的說法。蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路是細胞內信號通路之一，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，具有調節(jié)癌細胞周期、增殖、凋亡、代謝、炎癥以及血管生存等作用［2-4］。基于此，本研究探討鱉甲煎丸是否通過調控AKT/mTOR通路，參與干預肝癌細胞有氧糖酵解，從而發(fā)揮抑制肝癌細胞增殖、遷移的作用。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞株本實驗使用人肝癌細胞株（Huh7），購買于武漢普諾賽生命科技有限公司，細胞貨號：CL-0120。

1.1.2實驗用藥項目組采用鱉甲煎丸中成藥（武漢中聯(lián)藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準字號：Z42020772，產品批號：211970，3 g/袋），鱉甲煎丸：鱉甲、烏扇、黃芩、柴胡、鼠婦、干姜、大黃、芍藥、桂枝、葶藶、石葦、厚樸、牡丹、瞿麥、紫葳、半夏、人參、土鱉蟲、阿膠、蜂窠、赤硝、蜣螂、桃仁。

1.1.3實驗動物32只SD大鼠，體質量為（180±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號：SYXK（湘）2019-0001，使用許可證編號：SYXK桂2019-0001，在廣西中醫(yī)藥大學SPF級動物房內常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：22℃，自由進食、飲水，適應性喂養(yǎng)7天后進行相關實驗。

1.2主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑2-Deoxy-D-glucose（貨號：HY-13966，MCE）、Huh-7細胞專用培養(yǎng)基（貨號：CM-0120，普諾賽）、CCK-8細胞增殖試劑盒（貨號：C6005M，UElandy）、HK試劑盒（貨號：A077-3，南京建成）、PFK活性測定試劑盒（貨號：A129-1-1，南京建成）、PK活性檢測試劑盒（貨號：BC0540，Solarbio）、ATP含量檢測試劑盒（貨號：BC0300，Solarbio）、高效RIPA組織/細胞裂解液（貨號：ZJ102L，Solarbio）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：ZJ102，雅酶）、丙酮酸試劑盒（貨號：A081-1-1，南京建成）、乳酸測試盒（貨號：A019-2-1，南京建成）、細胞/動物組織/植物組織RNA提取試劑盒（貨號：A077-3，Solarbio）、AKT抗體（兔多抗）（貨號：AA326，碧云天）、mTOR兔單抗（貨號：AF1648，碧云天）、p-AKT抗體（貨號：PAB43158-P，Bioswamp）、p-mTOR抗體（貨號：AF3308，Affinity）、MonAmp?SYBR?Green qPCR Mix（貨號：MQ10301S，UElandy）。

1.2.2主要儀器非接觸式超聲波細胞粉碎機（型號：SCIENTZ08-Ⅲ，寧波新芝生物科技股份有限公司）、紫外分光光度計（型號：UV-2600，島津儀器公司）、全波長酶標儀（型號：Epoch，Biotek）、熒光定量PCR儀（型號：Roche，LightCycler?96）、生物分析儀（型號：Agilent 5400，Agilent Technologies Co Ltd）、PCR儀（型號：T100PCR，Bio-Rad）、凝膠成像系統(tǒng)（型號：Tanon 5200，上海天能）。

1.3實驗方法

1.3.1含藥血清的制備將32只SD大鼠隨機分為空白血清組（對照）、鱉甲煎丸高、中、低劑量組，每組8只大鼠，鱉甲煎丸組根據成人（60 kg）的臨床劑量來換算，從而得到大鼠（250 g/只）的鱉甲煎丸用藥劑量為1.1 g/kg（此設為中劑量組），高、低劑量組分別為中劑量組的2、0.5倍，即分別為2.2、0.55 g/kg，空白血清組以生理鹽水代替藥物，各組灌胃2次/d，連續(xù)給藥3 d。第4天，禁食禁水12 h，給藥1次，并在給藥1h后予2%戊巴比妥鈉（0.01 mL/g）腹部麻醉，麻醉滿意后行腹主動脈采血，室溫靜置2h，3 000 r/min離心，56℃、30 min滅活，0.22μm濾膜過濾，得到含藥血清保存于?80℃冰箱中，用于后續(xù)細胞實驗。

1.3.2抑制劑的制備及使用抑制劑組使用5μmol/L的MK-2206直接加入細胞培養(yǎng)液進行直接干預。

1.3.3細胞培養(yǎng)及分組Huh7細胞均采用Huh-7細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞貼壁且生長密度達到80%～90%時，分別加入空白血清組血清（20%）、鱉甲煎丸低劑量組血清（20%）、鱉甲煎丸中劑量組血清（20%）、鱉甲煎丸高劑量組血清（20%）以及含有MK-2206的Huh-7細胞培養(yǎng)液。

1.3.4 CCK-8檢測細胞的增殖情況各組以每孔1×104個細胞的密度接種到96個孔中，分別加入100μL含藥培養(yǎng)液，藥物干預24 h后，加入CCK-8試劑10μL，后將96孔板放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，于酶標儀上檢測450 nm吸光度時每孔的OD值。

1.3.5劃痕實驗檢測細胞的遷移能力按照密度8×105/孔接種于6孔板中，用10μL槍頭在直尺輔助下進行劃痕。分別加入2 mL含藥培養(yǎng)液進行藥物干預。顯微鏡下觀察細胞遷移情況，在0、24、48 h時進行拍照記錄，隨后用Image J軟件進行圖片處理計算劃痕面積。

1.3.6糖酵解激酶（HK、PFK、PK）活性測定藥物干預后，使用細胞刮刀將各組細胞收集到離心管中，并用超聲波進行破碎（采用冰浴，功率為20%，超聲波持續(xù)3 s，間隔10 s，重復30次），根據每個試劑盒的說明書，對樣本進行操作和計算，并對各組細胞蛋白（HK、PFK、PK）濃度進行測定，隨后進行歸一化處理。

1.3.7糖酵解代謝產物（丙酮酸、乳酸、ATP）水平測定藥物干預后，分別按照說明書要求收集各組細胞及上清液，利用酶標儀及紫外分光光度計進行檢測，并根據說明書提示計算丙酮酸、乳酸含量及ATP水平，同時測定各組細胞蛋白濃度進行歸一化處理。

1.3.8 RT-qPCR檢測按照試劑盒說明書的方法，利用雙離心柱法提取RNA并進行逆轉錄。RT-qPCR檢測，引物設計，AKT：正向引物5'-CCATCACACCACCTGACCAA-3'，反向引物5'-CGAGTAGGAGAACTGGGGGA-3'，擴增產物大小為83 bp。mTOR正向引物5'-CGCGCGAATATTAA AGGAAACT-3'，反向引物5'-CAGGACGCTCACATTGCTAG A-3'，擴增產物大小為：113 bp。GAPDH：正向引物5'-GG AAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3'，反向引物5'-TGATGA CCCTTTTGGCTCCC-3'，擴增產物大小為：168 bp。使用MonAmp?SYBR?Green qPCR Mix試劑盒對合成的基因進行擴增，檢測AKT、mTOR的基因表達，以GAPDH作為內部對照。以2?ΔΔCt表示實驗組與對照組中基因的倍數(shù)關系。

1.3.9 Western Blot檢測使用高效RIPA細胞裂解液對細胞進行裂解，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定。凝膠電泳后，濕轉到PVDF膜上，室溫孵育二抗2 h，TBST洗膜，滴加ECL發(fā)光液，使用發(fā)光成像系統(tǒng)進行成像并拍照，以GAPDH為內參，計算蛋白相對表達。

1.4統(tǒng)計學方法使用SPSS 27.0軟件，并利用GraphPad Prism 8設計相應的圖像。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較若方差齊采用LSD-t檢驗，不齊則用Dunnettg T3檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1鱉甲煎丸對肝癌細胞增殖的影響與空白血清組相比，鱉甲煎丸高、中、低劑量組的OD值均降低（P值均lt;0.05）（表1），藥物濃度越大，OD值越低。

2.2鱉甲煎丸對肝癌細胞遷移的影響藥物干預24、48 h后，鱉甲煎丸高、中、低劑量組遷移率均低于空白血清組（P值均lt;0.05）（圖1、表2），濃度越大，遷移率越低。

2.3鱉甲煎丸對肝癌細胞糖酵解限速酶活性的影響利用糖酵解激酶試劑盒對HK、PFK、PK這3個限速酶進行檢測，結果顯示：與空白血清組相比，鱉甲煎丸高、中、低劑量組的3個限速酶活性均降低（P值均lt;0.05）（表3）。

2.4鱉甲煎丸對肝癌細胞糖酵解代謝產物的影響利用乳酸、丙酮酸、ATP試劑盒對藥物干預后的代謝產物含量進行檢測，結果提示：與空白血清組相比，鱉甲煎丸高、中、低劑量組的乳酸、丙酮酸、ATP含量均減少（P值均lt;0.05）（表4）。

2.5鱉甲煎丸含藥血清對AKT、mTOR的mRNA表達的影響如表5所示，鱉甲煎丸高、低劑量組AKT的mRNA表達均低于空白血清組（P值均lt;0.05），中劑量組與空白血清組比較沒有明顯差異（Pgt;0.05）。鱉甲煎丸高、中、低劑量組mTOR的mRNA表達均低于空白血清組（P值均lt;0.05）。

2.6鱉甲煎丸對含藥血清對AKT、mTOR蛋白及磷酸化蛋白表達的影響如表6及圖2所示，鱉甲煎丸高、中劑量組AKT的蛋白表達均低于空白血清組（P值均lt;0.05），濃度越高，表達越低，但低劑量組與空白血清組比較沒有明顯差異（Pgt;0.05）。而鱉甲煎丸高、中、低劑量組mTOR的蛋白表達均低于空白血清組（P值均lt;0.05），濃度越高，表達越低。

3討論

癌細胞過度增殖與遷移是肝癌形成、生長與轉移的前提條件［5］。中醫(yī)認為，正虛是肝癌發(fā)生的前提條件，正虛則內外邪氣有侵襲人體的機會，引起機體臟腑功能失調，氣血津液失司，寒、熱、濕、毒、瘀、痰等邪氣結聚于脅下［6］，癌細胞不斷增殖，形成腫塊。然濕毒、痰毒等具有流竄之性，加之機體抗邪不利，陰陽失衡，固澀失司，使癌細胞不斷遷移、擴散，從而發(fā)生肝內外轉移［7-8］。由此可見，寒熱錯雜、虛實夾雜是肝癌的基本病機。鱉甲煎丸是由東漢醫(yī)家張仲景所提出的，治療癥瘕、瘧母的主方，全方由23味中藥組成。其中，人參、阿膠、芍藥、桂枝能補益氣血、調和營衛(wèi)；大黃、紫葳、土鱉蟲、蜣螂、鼠婦、牡丹皮、芍藥、桃仁、鱉甲、半夏、烏扇、赤硝具有活血化瘀、軟堅散結的功效；蜂房、黃芩、柴胡清熱解毒散結，這些藥物的功效與肝癌病機相契合，是目前常用的抗肝癌方劑之一?，F(xiàn)代研究［9-11］也表明，鱉甲煎丸不僅抑制癌細胞生長、代謝，調控血管生成，也能通過改善癌細胞代謝以及調節(jié)機體免疫等途徑來抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

癌細胞在發(fā)生增殖、轉移時需要消耗大量的能量，當微環(huán)境中能量缺乏時，癌細胞往往會調整代謝方式，以應對自身的能量需求［12-13］。研究［14］發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞在侵襲和轉移時有氧糖酵解相關基因（PKM2、HK、LDHA、葡萄糖轉運蛋白1）的表達增強。AKT/mTOR信號通路在癌癥多個方面都起著重要的作用，包括影響癌細胞的周期性、增殖、凋亡、代謝、炎癥和血管生成等［15］。最近的研究［16-17］顯示，AKT能夠直接磷酸化PRAS40（40 kD的富含脯氨酸蛋白激酶B底物蛋白），導致其失去對mTORC1（雷帕霉素靶蛋白復合物1）的抑制作用，以此來激活mTORC1通路，而且這種激活可以促使p70核糖體蛋白S6激酶磷酸化，進而激活核糖體蛋白S6，以此來促進蛋白質的合成，促使腫瘤細胞增殖，同時也能通過調控下游的轉錄因子影響糖酵解相關代謝酶（HK2、PFK、PK）以及葡萄糖轉運蛋白1的表達水平，從而調控糖酵解。且許多研究［18-20］指出，在肺癌、膽管細胞癌等多種腫瘤中觀察到激活的AKT/mTOR信號通路可以調控癌細胞糖酵解抑制腫瘤細胞代謝。比如，淫羊藿素可以通過AKT/mTOR信號通路呈劑量依賴方式抑制人肝內膽管癌HuCCT1細胞的增殖，同時抑制其葡萄糖消耗，抑制糖酵解限速酶HK1、HK2、PKM1、PKM2的活性，抑制肝內膽管細胞癌的生長及糖酵解［21］。

本研究以不同劑量鱉甲煎丸含藥血清干預Huh7細胞，結果顯示，與空白血清相比，鱉甲煎丸含藥血清明能抑制Huh7細胞的增殖、遷移活動，減少有氧糖酵解中相關激酶的活性及代謝產物的產生。同時，鱉甲煎丸含藥血清還能使AKT/mTOR信號通路中的mRNA及蛋白表達下調。這提示鱉甲煎丸可以通過抑制肝癌細胞有氧糖酵解，從而發(fā)揮抑制肝癌細胞增殖、遷移的作用，其作用機制可能與調控AKT/mTOR信號通路的表達有關。

綜上所述，本研究結果從側面驗證了鱉甲煎丸能抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展，也為鱉甲煎丸干預癌細胞代謝提供了相關依據。與傳統(tǒng)、廣譜治療方式不同，針對信號通路、細胞因子及基因表達的治療是更為精準的治療方式。AKT/mTOR信號通路在癌細胞能量代謝方面發(fā)揮重要的調控作用，開發(fā)更多靶向AKT/mTOR信號通路的藥物可能具有廣泛的研究前景，探索AKT/mTOR信號通路與肝癌發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系對于指南的制定可能具有重要意義。但實驗也存在較多未能排除的干擾因素，如其他通路、因子等。本研究團隊將在后續(xù)實驗中不斷改進及進行更深入的探索。

倫理學聲明：本研究方案于2023年8月30日經由廣西中醫(yī)藥大學倫理委員會審批，批號：DW20230830-162，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：譚欽文、鐘瑞熙負責課題設計，起草論文；譚欽文、鐘瑞熙、杜沅沁、徐健負責實驗操作，研究過程的實施；譚欽文負責數(shù)據收集，統(tǒng)計學分析，繪制圖表；杜沅沁、農金麗、彭玉姣負責擬定寫作思路；黃晶晶指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-06-22；錄用日期：2024-09-24

本文編輯：王瑩