蛇含委陵菜的三萜類成分及其細胞毒活性研究

摘 要：為研究蛇含委陵菜（Potentilla kleiniana）的化學成分及其腫瘤細胞毒活性，該研究采用D-101大孔樹脂、硅膠、ODS、Toyopearl HW-40、Sephadex LH-20等柱層析方法對蛇含委陵菜60%乙醇提取物進行分離純化，結(jié)合理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，并運用MTT法測試各化合物對人宮頸癌細胞株Hela的細胞毒活性。結(jié)果表明：（1）從蛇含委陵菜中分離鑒定了15個三萜類化合物，分別為烏蘇酸（1）、3β-O-乙?；履４妓幔?）、2-氧代坡模醇酸（3）、坡模醇酸（4）、覆盆子酸（5）、野椿酸（6）、委陵菜酸（7）、 2α-羥基烏蘇酸（8）、野薔薇苷（9）、積雪草苷A（10）、常春藤皂苷元（11）、山楂酸（12）、阿江欖仁酸（13）、甘草次酸（14）、甘草酸（15），其中化合物 10、11、13-15為首次從委陵菜屬植物中分離得到，化合物 2-5、9、12為首次從蛇含委陵菜中分離得到。（2）細胞毒活性試驗結(jié)果顯示，化合物1、2、4、6、12對人宮頸癌細胞株Hela具有一定的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）分別為（34.14±1.04）、（86.43±2.01）、（14.05±0.91）、（34.45±1.67）、（28.76±2.18） μmol·L^-1。該研究結(jié)果進一步豐富了蛇含委陵菜的化學成分，為抗宮頸癌藥物的研發(fā)提供了科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞：薔薇科，蛇含委陵菜，化學成分，結(jié)構(gòu)鑒定，三萜，細胞毒

中圖分類號：Q946

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2025）02-0306-11

基金項目：貴州省中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學技術(shù)研究專項（QZYY-2021-176）；貴陽市衛(wèi)生健康局高層次創(chuàng)新型青年衛(wèi)生人才培養(yǎng)計劃項目（［2022］筑衛(wèi)健科技合同字第010號）。

第一作者：張寶（1993—），碩士，主管藥師，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究，（E-mail）1004800340@qq.com。

^*通信作者：李悅，碩士，主任藥師，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理學研究，（E-mail）liyue_0407@163.com。

Triterpenoids from Potentilla kleiniana and their cytotoxicity

ZHANG Bao^1，2，JIN Qianqian³，CHEN Tingting^1，2，LI Li³，SUN Xu⁴，LIU Jia^1，2，LI Yongjun³，LI Yue^1，2*

（1. Department of Pharmacy，Guiyang Maternal and Child Health Hospital/Guiyang Childrens Hospital，Guiyang 550003，China; 2. College of Women and Children Clinical Medicine，Guizhou Medical University，Guiyang 550003，China; 3. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China; 4. Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550004，China）

Abstract：Potentilla kleiniana belongs to the family Rosaceae，which distributes in Central Asia，East Asia and Southeast Asia. In China，this plant is mainly found in eastern，southern and southwestern provinces. P. kleiniana has been prescribed for the treatment of various diseases in the field of traditional Chinese medicine，such as cough，fever，tuberculosis，mastitis，rheumatoid arthritis. Our previous study found that P. kleiniana had certain cytotoxicity on tumor cells，and 28 compounds were isolated and identified from P. kleiniana，some of which were cytotoxic to tumor cells. In order to further study the chemical constituents of P. kleiniana and their cytotoxicities，60% ethanol extracts of P. kleiniana were isolated by D-101 macroporous resins，silica gel，ODS，Toyopearl HW-40，Sephadex LH-20 and other column chromatography methods. Their chemical structures were elucidated on the basis of physicochemical properties and spectroscopic data. Meanwhile，all these compounds were evaluated for cytotoxic activities against human cervical cancer cell line Hela. The results were as follows：（1） Fifteen triterpenoids were isolated and identified as ursolic acid （1），3β-O-acetyl pomolic acid （2），2-oxopomolic acid （3），pomolic acid （4），fupenzic acid （5），euscaphic acid （6），tormentic acid （7），2α-hydroxyursolic acid （8），rosamultin （9），asiaticoside A （10），hederagenin （11），maslinic acid （12），arjunic acid （13），glycyrrhetinic acid （14），glycyrrhizic acid （15）. Among them，compounds 10，11，13-15 were isolated from genus Potentilla for the first time，and compounds 2-5，9 and 12 were isolated from P. kleiniana for the first time. （2） Cytotoxicity activity studies showed that compounds 1，2，4，6，12 display certain inhibitory activities against Hela cells with half maximal inhibitory concentration （IC₅₀） values of（34.14±1.04），（86.43±2.01），（14.05±0.91），（34.45±1.67），（28.76±2.18） μmol·L^-1，respectively. The study enriches the chemical constituents of P. kleiniana，and provides experimental basis for the development of anti-cervical cancer drugs.

Key words：Rosaceae，Potentilla kleiniana，chemical constituents，structural identification，triterpenoids，cytotoxicity

蛇含委陵菜（Potentilla kleiniana）為薔薇科委陵菜屬1年生、2年生或多年生宿根草本植物，又名五匹風、五皮風、地五甲、五爪龍等，廣泛分布于我國南北各省，盛產(chǎn)于貴州、廣西、云南、四川等地（中國科學院中國植物志編輯委員會，1985）。蛇含委陵菜具有祛風止咳、搜風剔邪、清熱解毒等功效，在貴州省苗族、布依族及侗族等民族地區(qū)，其單方或組方常用于治療乳腺炎、風濕關(guān)節(jié)炎等疾病，是貴州特色抗炎民族藥材之一（貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準編審委員會，2003；羅迎春和孫慶文，2013）。目前，國內(nèi)外對蛇含委陵菜的化學成分研究較少，僅有少量三萜類、黃酮類、酚酸類及鞣質(zhì)等成分被報道，藥理活性主要集中于粗提物的降血糖、抑菌、抗炎等方面（李勝華等，2011；Li et al.，2017；張晨光等，2018；Liu et al.，2019；Xuan et al.，2020；張寶等，2023，2024）。

近年來，炎性促癌學說越來越受到重視，炎癥被列為癌癥的第七大特征（于多，2020）。正常生理狀態(tài)下炎癥過程除了刺激細胞增殖和修復(fù)外，還可清除死亡細胞和其他碎片，但是當炎癥反應(yīng)不再受控制成為慢性過程，可誘發(fā)周圍組織惡性生長并形成腫瘤?；谏鲜霰尘?，課題組前期在考察蛇含委陵菜提取物抗炎活性的同時，還考察了其對腫瘤細胞的抑制作用，前期研究結(jié)果顯示，蛇含委陵菜60%乙醇提取物的50%乙醇洗脫部位對腫瘤細胞具有一定的抑制活性。為進一步明確該部位的物質(zhì)基礎(chǔ)和挖掘抗腫瘤活性成分，本研究綜合運用多種色譜分離技術(shù)、光譜鑒定技術(shù)及藥理研究技術(shù)，進行了以下研究：（1）分離和鑒定蛇含委陵菜抗腫瘤活性部位的化學成分；（2）將分離得到的化合物進行腫瘤細胞毒活性測定。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

實驗用蛇含委陵菜藥材采自貴州省貴陽市花溪區(qū)高坡鄉(xiāng)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學劉春花副教授鑒定為薔薇科委陵菜屬植物蛇含委陵菜（Potentilla kleiniana）全草。標本保存于貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，憑證號為 NO.20210416。

人宮頸癌細胞株Hela保存于中國科學院昆明細胞庫。

1.2 儀器

高分辨質(zhì)譜儀（Theemo Fisher Q Exactive-Plus 四級桿-靜電場軌道肼，美國Themo Fisher Scientific公司）；核磁共振波譜儀（Bruker AV-600型，德國Bruker公司）；核磁共振波譜儀（JEOL-ECS-400 MHz型，日本JEOL公司）；半制備型高效液相色譜儀（LC-20AP型，日本島津公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHIR-300型，瑞士BUCHI公司）；超純水機（KZ-20L型，上海科制環(huán)保設(shè)備有限公司）；多功能酶標儀（VARIOSKANLUX，美國 Themo Fisher Scientific 公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（HF240，上海力申科學儀器有限公司）；脫色搖床（TY-80B，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；D-101大孔樹脂（天津市海光化工有限公司）；Sephadex LH-20（瑞士Pharmacia Biotech公司）；Toyopearl HW 40F（日本JEOL公司）；ODS反相材料（日本Tosoh公司）；MCI（CHP20/P120，日本三菱公司）；柱層析硅膠及硅膠GF254預(yù)制板（青島海洋化工廠）。

1.3 試劑

阿霉素（批號：213S027，北京索萊寶生物科技有限公司）；MTT（批號：1117X0516，北京索萊寶生物科技有限公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基（批號：C11995500BT，美國Gbico公司）；胰酶消化液（0.25% EDTA）（批號：2046777，美國Gbico公司）；水為蒸餾水，甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚等化學試劑均為分析純。

2 研究方法

2.1 提取和分離

取蛇含委陵菜干燥全草15 kg，粉碎后用60%乙醇回流提取3次（分別為2、1.5、1.5 h），提取液合并后減壓濃縮至浸膏（2.1 kg）。浸膏加入適量蒸餾水，超聲振蕩分散，經(jīng)D-101大孔樹脂柱層析，用乙醇-水（0∶100，50∶50，95∶5，V/V）洗脫，收集各部分洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀。其中，50%乙醇部位浸膏（428.0 g）經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：200～300目；洗脫劑：氯仿-甲醇50∶1→1∶1，V/V），得到9個組分（Fr.A-Fr.I）。

Fr.A減壓濃縮后析出灰白色沉淀物，過濾，取沉淀用甲醇反復(fù)洗滌至白色，蒸干溶劑，得化合物2（35.9 mg）。

Fr.B減壓濃縮后析出難溶性沉淀物，過濾沉淀備用，濾液經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：二氯甲烷-甲醇100∶1，V/V）得到3個組分（Fr.B1-Fr.B3）。Fr.B3經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：石油醚-丙酮20∶1，V/V）得到6個組分（Fr.B3.1-FR.B3.6）。Fr.B3.4經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：二氯甲烷-甲醇25∶1→1∶1，V/V）得到2個組分（Fr.B3.4.1-Fr.B3.4.2）。Fr.B3.4.1依次經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：二氯甲烷-丙酮30∶1→4∶1，V/V）、ODS柱層析（甲醇-水15∶85，V/V）、Toyopearl HW 40F柱層析（甲醇），得到化合物5（4.8 mg）、化合物9（6.7 mg）。Fr.B3.4.2室溫放置自然結(jié)晶（甲醇-二氯甲烷25∶75，V/V），重結(jié)晶（甲醇），得到化合物1（18.7 mg）。Fr.B3.5依次經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：二氯甲烷-甲醇100∶1，V/V）、Sephadex LH-20柱層析（二氯甲烷-甲醇1∶1，V/V），得到化合物3（13.2 mg）。Fr.B3.6依次經(jīng)Sephadex LH-20柱層析（二氯甲烷-甲醇 1∶1，V/V）、正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：二氯甲烷-甲醇 100∶1，石油醚-丙酮15∶1，V/V），得到化合物4（25.2 mg）。

Fr.C經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：石油醚-乙酸乙酯 20∶1→1∶1，V/V）得到4個組分（Fr.C1-Fr.C4），其中Fr.C3經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：二氯甲烷-甲醇50∶1→10∶1，V/V）得到4個組分（Fr.C3.1-Fr.C3.4），F(xiàn)r.C3.4經(jīng)Sephadex LH-20柱層析（甲醇）得到2個組分（Fr.C3.4.1-Fr.C3.4.2），F(xiàn)r.C3.4.1經(jīng)ODS柱層析（甲醇-水 50∶50→18∶82，V/V）得到5個組分（Fr.C3.4.1.1-Fr.C3.4.1.5）。Fr.C3.4.1.2依次經(jīng)Toyopearl HW 40F柱層析（二氯甲烷-甲醇 1∶1，V/V）、ODS柱層析（甲醇-水20∶80，V/V）、Sephadex LH-20柱層析（甲醇），得到化合物13（8.5 mg）、化合物14（3.4 mg）。Fr.C3.4.1.3依次經(jīng)Sephadex LH-20柱層析（二氯甲烷-甲醇 1∶1，V/V）、正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：石油醚-乙酸乙酯 10∶1，V/V）、ODS柱層析（甲醇-水25∶75，V/V），得到化合物12（10.1 mg）。Fr.C4經(jīng)Sephadex LH-20柱層析（二氯甲烷-甲醇 1∶1，V/V）得到2個組分（Fr.C4.1-Fr.C4.2），F(xiàn)r.C4.2經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：二氯甲烷-甲醇30∶1→9∶1，V/V）得到6個組分（Fr.C4.2.1-Fr.C4.2.6）。Fr.C4.2.3依次經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：石油醚-乙酸乙酯 9∶1，V/V）、Sephadex LH-20柱層析（甲醇），得到化合物11（3.8 mg）。Fr.C4.2.5依次經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：石油醚-乙酸乙酯 7∶1，V/V）、Toyopearl HW 40F柱層析（甲醇）、半制備液相（甲醇-水22∶78，V/V）分離純化，得到化合物6（12.8 mg）、化合物7（5.9 mg）。

Fr.D經(jīng)MCI柱層析（乙醇-水30∶70，40∶60，50∶50，60∶40，70∶30，80∶20，90∶10，100∶0，V/V）得到8個組分（Fr.D1-Fr.D8）。Fr.D4經(jīng)正相硅膠柱層析（硅膠：300～400目；洗脫劑：二氯甲烷-甲醇25∶1→1∶1，V/V）得到9個組分（Fr.D4.1-Fr.D4.9），其中Fr.D4.6經(jīng)Sephadex LH-20柱層析（甲醇）分離純化，得到化合物8（20.6 mg）。

Fr. I減壓濃縮后析出少量白色晶體，快速過濾獲得晶體，晶體用甲醇-水（50∶50，V/V）溶解，經(jīng)Toyopearl HW 40F柱層析（甲醇-水 50∶50，V/V），得到化合物10（13.5 mg）、化合物15（18.1 mg）。

2.2 細胞毒活性測試

細胞毒活性測試參考張涵等（2022）中的MTT法，并略作修改。取對數(shù)生長期Hela細胞，調(diào)整細胞濃度為每毫升6×10⁴個，接種于96孔板中，每孔100 μL，實驗設(shè)置空白對照組、陽性對照組（阿霉素）和待測藥物組（各待測化合物），每組設(shè)置3個復(fù)孔，在5%CO₂、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h給藥，陽性對照組給予濃度為0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 μmol·L^-1的阿霉素，待測藥物組給予濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol·L^-1的各待測化合物。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于避光下每孔加20 μL MTT孵育4 h后取出，棄細胞上清液，并吸盡殘留，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上振蕩10 min，于酶標儀490 nm波長下檢測各孔吸光度（OD），根據(jù)OD值計算抑制率，采用Prism 8計算IC₅₀。實驗重復(fù)3次。

3 結(jié)果與分析

從蛇含委陵菜抗腫瘤活性部位中，分離鑒定了15個三萜類化合物（圖1），其中化合物1、2、4、6、12對人宮頸癌細胞株Hela具有一定的抑制作用。

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末；易溶于吡啶，溶于甲醇，微溶于丙酮、二氯甲烷，不溶于水、石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見深紫色斑點。HR-ESI-MS m/z：455.351 5 ［M-H］^-（C₃₀H₄₇O₃，理論值：455.352 0），分子式為C₃₀H₄₈O₃。¹H-NMR （400 MHz，C₅D₅N） δ：5.50 （1H，overlap，H-12），3.47 （1H，t，J = 8.0 Hz，H-3），2.64 （1H，d，J = 11.2 Hz，H-18），1.25 （3H，s，23-CH₃），1.23 （3H，s，27-CH₃），1.05 （3H，s，26-CH₃），1.03 （3H，s，24-CH₃），1.00 （3H，d，J = 6.4 Hz，30-CH₃），0.95 （3H，d，J = 6.0 Hz，29-CH₃），0.88 （3H，s，25-CH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz，C₅D₅N） δ：180.4 （C-28），139.7 （C-13），126.1 （C-12），78.6 （C-3），56.3 （C-5），54.0 （C-18），48.5 （C-9），42.7 （C-17），40.4 （C-14），40.0 （C-19），39.9 （C-4，8，20），39.5 （C-1），37.9 （C-13），37.8 （C-10），34.0 （C-7），31.5 （C-21），29.3 （C-23），29.2 （C-15），28.6 （C-2），25.4 （C-16），24.4 （C-27），24.1 （C-11），21.9 （C-30），19.3 （C-6），18.0 （C-26），17.9 （C-29），17.0 （C-24），16.1 （C-25）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Sidjui et al.，2014）報道的基本一致，故鑒定化合物1為烏蘇酸（ursolic acid）。

化合物2 白色粉末；易溶于吡啶，溶于二氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于水、石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見暗紅色斑點。HR-ESI-MS m/z：513.357 5 ［M-H］^-（C₃₂H₄₉O₅，理論值：513.358 5），分子式為C₃₂H₅₀O₅。¹H-NMR （400 MHz，CDCl₃） δ：5.31 （1H，t，J = 2.4 Hz，H-12），4.47 （1H，dd，J = 8.8，6.8 Hz，H-3），2.50 （1H，s，H-18），2.02 （3H，s，COCH₃），1.21 （3H，s，27-CH₃），1.18 （3H，s，29-CH₃），0.92 （6H，overlap，25，30-CH₃），0.84 （3H，s，23-CH₃），0.82 （3H，s，24-CH₃），0.69 （3H，s，29-CH₃）; ¹³C-NMR （10 MHz，CDCl₃） δ：184.6 （C-28），171.1 （COCH₃），137.8 （C-13），129.3 （C-12），80.9 （C-3），73.0 （C-19），55.1 （C-5），52.6 （C-18），47.7 （C-17），47.0 （C-9），41.0 （C-20），40.9 （C-14），39.9 （C-8），38.0 （C-1），37.6 （C-4），37.5 （C-22），36.9 （C-10），32.5 （C-7），28.1 （C-15），28.0 （C-29），27.4 （C-23），25.9 （C-21），25.2 （C-16），24.5 （C-27），23.6 （C-2），23.5 （C-11），21.3 （COCH₃），18.2 （C-6），17.0 （C-26），16.6 （C-24） ，16.2 （C-30），15.3 （C-25）。以上數(shù)據(jù)與文獻（譚欽剛等，2013）報道的基本一致，故鑒定化合物2為3β-O-乙?；履４妓幔?β-O-acetyl pomolic acid）。

化合物3 白色粉末；易溶于吡啶，溶于甲醇、二氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于水、石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見暗紅色斑點。HR-ESI-MS m/z：485.327 0 ［M-H］^-（C₃₀H₄₅O₅，理論值：485.327 3），分子式為C₃₀H₄₆O₅。¹H-NMR （400 MHz，C₅D₅N） δ：5.54 （1H，overlap，H-12），4.18 （1H，s，H-3），3.02 （1H，s，H-18），2.45 （1H，d，J = 12.0 Hz，H-1），1.72 （3H，s，27-CH₃），1.42 （3H，s，29-CH₃），1.29 （3H，s，23-CH₃），1.10 （3H，d，J = 6.4 Hz，30-CH₃），1.02 （3H，s，25-CH₃），0.85 （3H，s，26-CH₃），0.84 （3H，s，24-CH₃）; ¹³C-NMR（100 MHz，C₅D₅N） δ：211.1 （C-2），180.6 （C-28），140.1 （C-13），127.4 （C-12），83.4 （C-3），72.7 （C-19），54.9 （C-5），54.6 （C-18），53.7 （C-1），48.3 （C-17），47.3 （C-9），45.8 （C-4），43.6 （C-10），42.3 （C-20），42.2 （C-14），40.7 （C-8），38.4 （C-22），33.1 （C-7），29.5 （C-15），29.3 （C-23），27.1 （C-21），26.9 （C-29），26.3 （C-16），24.5 （C-27），23.7 （C-11），19.1 （C-6），17.3 （C-24），16.7 （C-25、26），16.3 （C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻（劉意等，2014）報道的基本一致，故鑒定化合物3為2-氧代坡模醇酸（2-oxopomolic acid）。

化合物4 白色粉末；易溶于吡啶，微溶于甲醇、二氯甲烷、丙酮，不溶于水、石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見暗紅色斑點。HR-ESI-MS m/z：471.347 5 ［M-H］^-（C₃₀H₄₇O₄，理論值：471.348 0），分子式為C₃₀H₄₈O₄。¹H-NMR （400 MHz，C₅D₅N） δ：5.61 （1H，d，J = 2.8 Hz，H-12），3.44 （1H，m，H-3α），3.13 （1H，t，J = 8.8，12.8 Hz，H-16α），3.07 （1H，s，H-18），2.35 （1H，t，J = 12.0，13.6 Hz，H-15β），1.73 （3H，s，27-CH₃），1.45 （3H，s，29-CH₃），1.24 （3H，s，23-CH₃），1.12 （3H，s，30-CH₃），1.11 （3H，s，26-CH₃），1.03 （3H，s，24-CH₃），0.91 （3H，s，25-CH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz，C₅D₅N） δ：180.8 （C-28），140.0 （C-13），128.0 （C-12），78.2 （C-3），72.7 （C-19），55.9 （C-5），54.7 （C-18），48.3 （C-17），47.8 （C-9），42.4 （C-20），42.1 （C-14），40.4 （C-8），39.4 （C-4），39.0 （C-1），38.5 （C-22），37.4 （C-10），33.6 （C-7），29.3 （C-15），28.8 （C-28），28.1 （C-2），27.1 （C-29），27.0 （C-21），26.4 （C-16），24.7 （C-27），24.0 （C-11），18.9 （C-6），17.2 （C-26），16.8 （C-30），16.5 （C-25），15.6 （C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻（An et al.，2005）報道的基本一致，故鑒定化合物4為坡模醇酸（pomolic acid）。

化合物5 白色粉末；易溶于吡啶，溶于甲醇，微溶于二氯甲烷、丙酮，不溶于水、石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見深藍色斑點。HR-ESI-MS m/z：483.311 5 ［M-H］^-（C₃₀H₄₃O₅，理論值：483.311 6），分子式為C₃₀H₄₄O₅。¹H-NMR （400 MHz，CD₃OD） δ：6.28 （1H，s，H-1），5.34 （1H，br.s，H-12），2.53 （1H，s，H-18），1.35 （3H，s，27-CH₃），1.22 （3H，s，25-CH₃），1.20 （3H，s，29-CH₃），1.18 （3H，s，23-CH₃），1.10 （3H，s，24-CH₃），0.93 （3H，d，J = 7.2 Hz，30-CH₃），0.87 （3H，s，26-CH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz，CD₃OD） δ：202.4 （C-3），182.4 （C-28），146.0 （C-2），140.4 （C-13），130.1 （C-1），129.0 （C-12），73.5 （C-19），55.3 （C-5），55.1 （C-18），49.1 （C-17），45.6 （C-4），44.1 （C-9），43.1 （C-20），43.0 （C-10），41.7 （C-14），39.4 （C-8），39.0 （C-22），34.0 （C-7），29.6 （C-15），28.1 （C-23），27.3 （C-21），27.0 （C-29），26.6 （C-26），24.8 （C-27），24.6 （C-11），22.3 （C-24），20.3 （C-25），20.0 （C-6），17.9 （C-26），16.6 （C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Song et al.，2013）報道的基本一致，故鑒定化合物5為覆盆子酸（fupenzic acid）。

化合物6 白色粉末；易溶于DMSO，溶于吡啶、甲醇、丙酮，微溶于二氯甲烷、水，不溶于石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見深藍色斑點。HR-ESI-MS m/z：487.342 9 ［M-H］^-（C₃₀H₄₇O₅，理論值：487.342 9），分子式為C₃₀H₄₈O₅。¹H-NMR （600 MHz，DMSO-d₆） δ：5.17 （1H，t，J = 3.0 Hz，H-12），3.15 （1H，s，H-3），2.36 （1H，s，H-18），1.28 （3H，s，27-CH₃），1.08 （3H，s，29-CH₃），0.88 （3H，s，23-CH₃），0.88 （3H，s，26-CH₃），0.84 （3H，d，J = 6.6 Hz，30-CH₃），0.78 （3H，s，25-CH₃），0.68 （3H，s，24-CH₃）; ¹³C-NMR （150 MHz，DMSO-d₆） δ：179.1 （C-28），138.7 （C-13），126.9 （C-12），78.0 （C-3），71.7 （C-19），64.8 （C-2），53.3 （C-18），47.7 （C-5），47.0 （C-17），46.6 （C-9），41.6 （C-1），41.5 （C-20），41.3 （C-14），39.6 （C-8），38.1 （C-4），37.9 （C-10），37.4 （C-22），32.7 （C-7），29.0 （C-15），28.1 （C-23），26.5 （C-21），26.0 （C-29），25.2 （C-16），24.2 （C-27），23.3 （C-11），21.9 （C-6），17.8 （C-26），16.7 （C-30），16.4 （C-25），16.2 （C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻（劉意等，2014）報道的基本一致，故鑒定化合物6為野椿酸（euscaphic acid）。

化合物7 白色粉末；易溶于DMSO，溶于吡啶、甲醇、丙酮，微溶于二氯甲烷、水，不溶于石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見深藍色斑點。HR-ESI-MS m/z：487.342 8 ［M-H］^-（C₃₀H₄₇O₅，理論值：487.342 9），分子式為C₃₀H₄₈O₅。¹H-NMR （400 MHz，DMSO-d₆） δ：5.17 （1H，s，H-12），3.43 （1H，m，H-2），2.75 （1H，d，J = 8.8 Hz，H-3），2.38 （1H，s，H-18），0.85 （3H，d，J = 6.4 Hz，30-CH₃），0.70，0.71，0.91，0.93，1.08，1.29 （各3H，s，23～29-CH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz，DMSO-d₆） δ：179.5 （C-28），139.2 （C-13），127.3 （C-12），82.8 （C-3），72.2 （C-19），67.7 （C-2），55.4 （C-5），53.7 （C-18），47.5 （C-17），47.4 （C-1），47.2 （C-9），41.9 （C-20），41.7 （C-14），39.9 （C-8），39.5 （C-4），38.1 （C-10），37.8 （C-22），33.1 （C-7），29.3 （C-23），28.6 （C-15），26.9 （C-21），26.5 （C-29），25.7 （C-16），24.5 （C-27），23.7 （C-11），18.7 （C-6），17.7 （C-26），17.1 （C-30），16.8 （C-24，25）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Wu et al.，2019）報道的基本一致，故鑒定化合物7為委陵菜酸（tormentic acid）。

化合物8 白色粉末；易溶于吡啶，溶于甲醇，微溶于丙酮、二氯甲烷、水，不溶于石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見深紫色斑點。HR-ESI-MS m/z：471.347 7 ［M-H］^-（C₃₀H₄₇O₄，理論值：471.348 0），分子式為C₃₀H₄₈O₄。¹H-NMR （400 MHz，C₅D₅N） δ：5.48 （1H，s，H-12），4.13 （1H，m，H-2），3.43 （1H，d，J = 9.2 Hz，H-3），2.65 （1H，d，J = 11.2 Hz，H-18），1.30 （3H，s，27-CH₃），1.22 （3H，s，23-CH₃），1.10 （3H，s，26-CH₃），1.05 （3H，s，24-CH₃），0.99 （3H，d，J = 5.6 Hz，25-CH₃），0.99 （3H，s，29-CH₃），0.96 （3H，d，J = 6.0 Hz，30-CH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz，C₅D₅N） δ：180.4 （C-28），139.6 （C-13），125.8 （C-12），84.1 （C-3），68.9 （C-2），56.2 （C-5），53.8 （C-18），48.4 （C-17，9），48.3 （C-1），42.8 （C-14），40.2 （C-8），39.8 （C-4），39.7 （C-19，20），38.7 （C-10），37.8 （C-22），33.8 （C-7），31.4 （C-21），29.7 （C-23），28.9 （C-15），25.2 （C-16），24.2 （C-27），24.0 （C-11），21.8 （C-30），19.1 （C-6），18.1 （C-29），17.9 （C-25），17.8 （C-26），17.3 （C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Sun amp; Hong，2000）報道的基本一致，故鑒定化合物8為2α-羥基烏蘇酸（2α-hydroxyursolic acid）。

化合物9 白色粉末；易溶于吡啶、甲醇、丙酮，微溶于二氯甲烷、水，不溶于石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見深紫色斑點。HR-ESI-MS m/z：695.400 5 ［M+HCOO］^-（C₃₇H₅₉O₁₂，理論值：695.401 2），分子式為C₃₆H₅₈O₁₀。¹H-NMR （600 MHz，CD₃OD） δ：5.32 （1H，d，J = 8.4 Hz，H-1′），5.31 （1H，overlap，H-12），3.80 （1H，dd，J = 12.0，1.8 Hz，H-6′a），3.68 （1H，dd，J = 12.0，4.8 Hz，H-6′b），3.63 （1H，m，H-2），2.91 （1H，d，J = 9.6 Hz，H-18），1.33 （3H，s，23-CH₃），1.20 （3H，s，24-CH₃），1.01 （6H，s，25，26-CH₃），0.93 （3H，d，J = 13.8 Hz，30-CH₃），0.81 （3H，s，21-CH₃），0.78 （3H，s，29-CH₃）; ¹³C-NMR （150 MHz，CD₃OD） δ：178.7 （C-28），139.9 （C-13），129.7 （C-12），95.9 （C-1′），84.7 （C-3），78.8 （C-5′），78.5 （C-3′），74.0 （C-2′），73.8 （C-19），71.2 （C-4′），69.7 （C-2），62.5 （C-6′），56.8 （C-5），55.1 （C-18），49.4 （C-9），48.8 （C-17），48.4 （C-1），43.1 （C-14），42.8 （C-20），41.4 （C-8），40.7 （C-10），39.3 （C-4），38.5 （C-22），34.2 （C-7），29.8 （C-15），29.4 （C-23），27.4 （C-29），27.2 （C-21），26.6 （C-16），24.9 （C-11），24.8 （C-27），19.8 （C-6），17.7 （C-25），17.6 （C-24） ，17.3 （C-26），16.8 （C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻（吳敏等，2012）報道的基本一致，故鑒定化合物9為野薔薇苷（rosamultin）。

化合物10 白色粉末；易溶于甲醇、DMSO，溶于吡啶、丙酮、水，微溶于二氯甲烷，不溶于石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見紫色斑點。HR-ESI-MS m/z：973.501 5 ［M-H］^-（C₄₈H₇₇O₂₀，理論值：973.500 2），分子式為C₄₈H₇₈O₂₀。¹H-NMR （400 MHz，DMSO-d₆） δ：5.14 （3H，overlap，H-12，1′，1″），5.08 （1H，d，J = 4.8 Hz，H-1），4.88 （1H，d，J = 5.2 Hz，H-6），2.09 （1H，d，J = 10.8 Hz，H-18），1.26 （3H，s，6-CH₃），1.07 （3H，d，J = 6.0 Hz，30-CH₃），0.97 （3H，s，25-CH₃），0.94 （3H，s，24-CH₃），0.90 （3H，s，27-CH₃），0.88 （3H，s，26-CH₃），0.82 （3H，d，J = 6.0 Hz，29-CH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz，DMSO-d₆） δ：175.0 （C-28），137.1 （C-13），125.1 （C-12），102.8 （C-1″），100.4 （C-1），94.2 （C-1′），76.7 （C-3），76.5 （C-3′），76.2 （C-4″），75.7 （C-3″），75.5 （C-5′），75.2 （C-5″），73.8 （C-2″），72.1 （C-2′），72.0 （C-2），70.7 （C-6，4，3），69.3 （C-6′），68.6 （C-4′），67.8 （C-5），67.5 （C-2），65.8 （C-23），63.6 （C-6″），60.0 （C-18），52.5 （C-17），49.4 （C-1），48.7 （C-5），47.4 （C-9，14），46.5 （C-4），43.2 （C-8），42.3 （C-20），38.5 （C-22），38.4 （C-10），36.8 （C-7），35.9 （C-21），30.2 （C-15），27.7 （C-11），23.9 （C-16），23.1 （C-27），21.1 （C-30），18.4 （C-6），18.2 （C-25），17.8 （C-26），17.1 （C-29），15.1 （C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻（匡蕾等，2019）報道的基本一致，故鑒定化合物10為積雪草苷A（asiaticoside A）。

化合物11 白色粉末；易溶于吡啶，溶于甲醇，微溶于二氯甲烷、丙酮、水，不溶于石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見紫色斑點。HR-ESI-MS m/z：471.347 8 ［M-H］^-（C₃₀H₄₇O₄，理論值：471.348 0），分子式為C₃₀H₄₈O₄。¹H-NMR （400 MHz，C₅D₅N） δ：5.49 （1H，m，H-12），4.19 （2H，m，H-3，23a），3.71 （1H，d，J = 10.4 Hz，H-23b），3.29 （1H，dd，J = 13.2，3.6 Hz，H-18），1.23 （3H，s，27-CH₃），1.05 （3H，s，25-CH₃），1.04 （3H，s，30-CH₃），0.99 （3H，s，29-CH₃），0.96 （3H，s，24-CH₃），0.92 （3H，s，26-CH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz，C₅D₅N） δ：180.2 （C-28），144.8 （C-13），122.6 （C-12），73.1 （C-3），67.6 （C-23），48.4 （C-5），48.1 （C-8），46.6 （C-19），46.4 （C-17），42.9 （C-4），42.1 （C-14），41.9 （C-18），39.7 （C-8），38.7 （C-1），37.2 （C-10），34.1 （C-21），33.2 （C-22，29），32.9 （C-7），28.3 （C-15），27.7 （C-2），26.1 （C-27），23.8 （C-30），23.7 （C-16），23.6 （C-11），18.5 （C-6），17.4 （C-26），15.9 （C-25），13.2 （C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Inada et al.，1988）報道的基本一致，故鑒定化合物11為常春藤皂苷元（hederagenin）。

化合物12 白色粉末；易溶于吡啶，溶于甲醇、丙酮，微溶于二氯甲烷、水，不溶于石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見深紫色斑點。HR-ESI-MS m/z：471.347 9 ［M-H］^-（C₃₀H₄₇O₄，理論值：471.348 0），分子式為C₃₀H₄₈O₄。¹H-NMR （600 MHz，C₅D₅N） δ：5.49 （1H，s，H-12），4.12 （1H，m，H-2），3.42 （1H，d，J = 9.6 Hz，H-3），3.32 （1H，dd，J = 13.2，4.8 Hz，H-18），1.29 （3H，s，23-CH₃），1.28 （3H，s，27-CH₃），1.10 （3H，s，24-CH₃），1.03 （3H，s，26-CH₃），1.01 （3H，s，30-CH₃），1.00 （3H，s，25-CH₃），0.96 （3H，s，29-CH₃）; ¹³C-NMR （150 MHz，C₅D₅N） δ：180.7 （C-28），145.2 （C-13），122.8 （C-12），84.1 （C-3），68.9 （C-2），56.2 （C-5），48.5 （C-9），48.1 （C-1），47.0 （C-17），46.8 （C-19），42.5 （C-14），42.3 （C-18），40.2 （C-4），40.1 （C-8），38.9 （C-10），34.5 （C-21），33.6 （C-29），33.5 （C-7，22），31.3 （C-20），29.7 （C-23），28.6 （C-25），26.5 （C-27），24.3 （C-16），24.1 （C-30），24.0 （C-11），19.2 （C-6），18.0 （C-24），17.8 （C-26），17.2 （C-25）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Huang et al.，2009）報道的基本一致，故鑒定化合物12為山楂酸（maslinic acid）。

化合物13 白色粉末；易溶于吡啶，溶于甲醇、丙酮，微溶于二氯甲烷、水，不溶于石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見深紫色斑點。HR-ESI-MS m/z：487.342 7 ［M-H］^-（C₃₀H₄₇O₅，理論值：487.342 9），分子式為C₃₀H₄₈O₅。¹H-NMR （400 MHz，C₅D₅N） δ：5.49 （1H，br s，H-12），4.12 （1H，m，H-2），3.62 （2H，m，H-18，19），3.39 （1H，d，J = 9.6 Hz，H-3），2.28 （2H，dd，J = 12.4，4.4 Hz，H-1），1.63 （3H，s，27-CH₃），1.27 （3H，s，23-CH₃），1.18 （3H，s，29-CH₃），1.10 （3H，s，30-CH₃），1.09 （3H，s，26-CH₃），1.05 （3H，s，24-CH₃），1.02 （3H，s，25-CH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz，C₅D₅N） δ：181.7 （C-28），145.2 （C-13），123.1 （C-12），83.8 （C-3），81.2 （C-19），68.5 （C-2），56.0 （C-5），48.4 （C-9），47.5 （C-1），46.1 （C-17），44.9 （C-18），42.1 （C-14），40.0 （C-8），39.9 （C-4），38.6 （C-10），35.7 （C-20），33.8 （C-22），33.2 （C-7），29.3 （C-29），29.2 （C-15，16），28.9 （C-23），28.4 （C-21），24.8 （C-27，30），24.2 （C-11），19.0 （C-6），17.6 （C-24，26），16.8 （C-25）。以上數(shù)據(jù)與文獻（陳封政等，2001）報道的基本一致，故鑒定化合物13為阿江欖仁酸（arjunic acid）。

化合物14 白色粉末；易溶于吡啶，溶于甲醇、丙酮，微溶于二氯甲烷、水，不溶于石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見暗紅色斑點。HR-ESI-MS m/z：471.347 3 ［M+H］ ⁺（C₃₀H₄₇O₄，理論值：471.346 8），分子式為C₃₀H₄₆O₄。¹H-NMR （400 MHz，C₅D₅N） δ：6.01 （1H，s，H-12），3.49 （1H，d，J = 8.0 Hz，H-3），3.27 （1H，d，J = 13.6 Hz，H-5），1.39 （3H，s，27-CH₃），1.34 （9H，overlap，25，26，28-CH₃），1.12 （3H，s，23-CH₃），1.08 （3H，s，29-CH₃），0.79 （3H，s，24-CH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz，C₅D₅N） δ：199.7 （C-11），179.2 （C-30），169.7 （C-13），128.7 （C-12），77.8 （C-3），62.2 （C-9），55.3 （C-5），48.7 （C-18），45.5 （C-8），44.1 （C-20），43.4 （C-14），41.6 （C-19），39.8 （C-1，4），38.4 （C-22），37.6 （C-10），32.9 （C-7），32.1 （C-17），31.5 （C-21），28.7 （C-23，28，29），28.2 （C-2），26.8 （C-16），26.6 （C-15），23.5 （C-17），18.8 （C-26），17.9 （C-6），16.8 （C-25），16.6 （C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻（Orihara amp; Furuya，1990）報道的基本一致，故鑒定化合物14為甘草次酸（glycyrrhetinic acid）。

化合物15 白色粉末；易溶于甲醇、DMSO，溶于吡啶、丙酮、水，微溶于二氯甲烷，不溶于石油醚；薄層色譜法用10%硫酸-乙醇顯色見紫色斑點。HR-ESI-MS m/z：821.396 2 ［M-H］^-（C₄₂H₆₁O₁₆，理論值：821.395 4），分子式為C₄₂H₆₂O₁₆。¹H-NMR （400 MHz，DMSO-d₆） δ：5.37 （1H，s，H-12），4.47 （1H，d，J = 7.6 Hz，H-1″），4.39 （1H，d，J = 7.6 Hz，H-1′），3.62 （1H，d，J = 9.2 Hz，H-5″），3.54 （1H，d，J = 9.6 Hz，H-5′），3.28 （4H，overlap，H-2′，3′，4′，4″），3.02 （2H，overlap，H-3，2″），2.31 （1H，s，H-9），1.32 （3H，s，27-CH₃），1.08 （3H，s，28-CH₃），1.00 （6H，s，25，26-CH₃），0.92 （3H，s，26-CH₃），0.74 （3H，s，29-CH₃），0.69 （3H，s，24-CH₃）; ¹³C-NMR （100 MHz，DMSO-d₆） δ：199.1 （C-11），177.8 （C-30），170.3 （C-6′），170.1 （C-6″），169.8 （C-13），127.3 （C-12），104.8 （C-1″），103.5 （C-1′），88.2 （C-3），82.7 （C-2′），76.2 （C-5″），75.9 （C-3′），75.6 （C-3″），75.2 （C-5′），74.9 （C-2″），71.5 （C-4″），71.2 （C-4′），61.1 （C-9），54.3 （C-5），48.1 （C-18），44.9 （C-8），43.1 （C-20），42.9 （C-14），40.6 （C-19），39.0 （C-4），38.5 （C-1），37.5 （C-22），36.3 （C-10），32.1 （C-7），31.6 （C-17），30.4 （C-21），28.4 （C-29），27.8 （C-28），27.1 （C-23），26.1 （C-15），25.8 （C-16），25.7 （C-2），23.0 （C-27），18.4 （C-26），16.9 （C-6），16.3 （C-25），16.0 （C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻（王呈文等，2014）報道的基本一致，故鑒定化合物15為甘草酸（glycyrrhizic acid）。

3.2 細胞毒活性測試結(jié)果

由表１可知，化合物1、2、4、6、12對Hela細胞均具有一定的抑制作用，IC₅₀值分別為（34.14 ± 1.04）、（86.43 ± 2.01）、（14.05 ± 0.91）、（34.45 ± 1.67）、（28.76 ± 2.18） μmol·L^-1。

4 討論與結(jié)論

本研究綜合運用多種分離分析方法及結(jié)構(gòu)鑒定手段對蛇含委陵菜抗腫瘤活性部位的化學成分進行研究，得到15個三萜類化合物，包括10個烏蘇烷型五環(huán)三萜（化合物1-10）和5個齊墩果烷型五環(huán)三萜（化合物11-15）。除了化合物1、6-8以外，其余化合物均首次從委陵菜屬中分離得到。本研究通過腫瘤細胞毒活性試驗且結(jié)合文獻報道，對本文中部分化合物構(gòu)效關(guān)系進行了探討。

烏蘇酸可作用于多種信號通路，從而誘導腫瘤細胞凋亡和分化，對多種腫瘤細胞具有抑制作用，C-3位、C-17位、C-28位取代基的變化對其抑制作用影響較大（孟艷秋等，2004；楊夕鳴等，2022）。在本研究細胞毒活性試驗中有新的發(fā)現(xiàn)，烏蘇酸（1）C-2位上α-H被OH取代后（2α-羥基烏蘇酸，8）對Hela細胞的抑制作用顯著降低。坡模醇酸不僅對乳腺癌細胞具有一定的抑制作用（劉蒲和王國權(quán)，2018），而且本研究發(fā)現(xiàn)坡模醇酸還對Hela細胞具有顯著的抑制作用［IC₅₀（14.05 ± 0.91） μmol·L^-1］，而當其C-3位羥基被酯化（3β-O-乙?；履４妓?，2）或C-2位引入羰基（2-氧代坡模醇酸，3）后對Hela細胞的抑制作用卻顯著降低。野椿酸（6）和委陵菜酸（7）的結(jié)構(gòu)差異在于前者C-3位上的OH是α型，后者是β型，前者對Hela細胞具有一定的抑制作用，而后者則無明顯抑制作用，由此推測烏蘇烷型五環(huán)三萜的細胞毒活性可能受到C-3位取代基構(gòu)型的影響。

5個齊墩果烷型五環(huán)三萜中，僅山楂酸（12）具有一定的Hela細胞毒活性，就本研究而言，齊墩果烷型五環(huán)三萜細胞毒活性的構(gòu)效關(guān)系不甚明確。此外，常春藤皂苷元、甘草酸、甘草次酸等化合物對Hela細胞無明顯抑制作用，而文獻報道其對多種腫瘤細胞具有抑制作用（邢穎等，2017；王若寧等，2019；汪海燕等，2022），可能是這些化合物對Hela細胞的敏感性較弱。未來，可針對蛇含委陵菜抗腫瘤活性部位中的三萜類化合物進一步擴大腫瘤細胞株的篩選范圍，明確其構(gòu)效關(guān)系，對活性突出的化合物進行相應(yīng)的結(jié)構(gòu)修飾、藥效學、藥代動力學、代謝組學及成藥性方面的深入研究。

綜上所述，本研究進一步明確了蛇含委陵菜抗腫瘤活性部位的物質(zhì)基礎(chǔ)，并通過細胞毒活性試驗推測三萜類化合物可能是蛇含委陵菜發(fā)揮抗腫瘤藥理活性的重要成分。同時，還分析了部分烏蘇烷型五環(huán)三萜的構(gòu)效關(guān)系，在一定程度上可為該類成分的結(jié)構(gòu)修飾和抗腫瘤藥物的研究提供參考，也為蛇含委陵菜的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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（責任編輯 蔣巧媛 王登惠）