三黃雞MDV、ALV和CIAV多重感染的臨床發(fā)病觀察與分析

摘 要：現(xiàn)場解剖來自廣西某養(yǎng)殖場一批110日齡疑似患腫瘤病的三黃雞，選取肝臟、心臟、脾臟、小腸、腺胃等剖檢病變明顯的內(nèi)臟組織用于病理學(xué)觀察，并通過PCR檢測病雞樣品所含的MDV、ALV、REV和CIAV等當(dāng)?shù)亓餍械拿庖咭种菩圆《咎禺惢蚱?。病雞肝臟、腺胃和小腸存在大量腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤；肝臟血管周圍有多種炎細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞索受壓萎縮；脾臟淤血，彌漫性實質(zhì)細(xì)胞凋亡，呈空泡狀，并可見大量異嗜性細(xì)胞浸潤和含鐵血黃素沉著；心臟發(fā)生心肌炎，心肌纖維壞死，細(xì)胞溶解并伴大量炎細(xì)胞浸潤。個別病雞檢出MDV或CIAV單一感染，而MDV、ALV和CIAV三種病毒共感染的檢出率最高，達63.88%，所有樣品均未檢測出REV。以上結(jié)果表明，這批臨近上市的三黃雞群發(fā)生臨床腫瘤病主要是由MDV、ALV和CIAV共感染所致，尤其是ALV-K亞群感染占比突出。

關(guān)鍵詞：三黃雞；馬立克病病毒；禽白血病病毒；雞傳染性貧血病病毒；共感染；病理變化

中圖分類號：S858.31 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-1085（2025）03-0027-08

我國南方地區(qū)地方品種雞資源豐富，這些優(yōu)質(zhì)雞多以散養(yǎng)或放養(yǎng)為主，因風(fēng)味獨特越來越受市場青睞，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，已成為我國養(yǎng)禽業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的一張重要名片。放養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)雞在實現(xiàn)經(jīng)濟效益和生態(tài)效益雙贏的同時，也面臨著巨大的防疫負(fù)擔(dān)和諸多挑戰(zhàn)，例如養(yǎng)殖時間較長、生物安全措施難以有效實施、種源垂直傳播疫病凈化難度大等。

廣西及周邊省份的地方優(yōu)質(zhì)雞發(fā)生的腫瘤病主要是由馬立克病病毒（Marek's disease virus， MDV）和禽白血病病毒（Avian leukosis virus， ALV）、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（Reticuloendotheliosis virus， REV）的單一感染或兩者共感染引起[1]。目前，多種病毒共感染所占比例仍在逐年攀升，造成的危害比單一感染更嚴(yán)重，病雞的臨床發(fā)病表現(xiàn)更加復(fù)雜多樣[2]。我國多地已出現(xiàn)雞群發(fā)生ALV與MDV共感染情況[3-6]，兩者協(xié)同可促進彼此致病力的增強[7-8]。其中最常見的是MDV與ALV-J亞群共感染，在復(fù)雜的放養(yǎng)條件下，甚至?xí)霈F(xiàn)ALV-A、ALV-J 和ALV-K等多個外源性ALV亞群與MDV超強毒株共感染，引起雞群暴發(fā)腫瘤病[6， 9-10]。

文章報道了一起廣西放養(yǎng)三黃雞群發(fā)生MDV、ALV和雞傳染性貧血病病毒（Chicken infectious anemia virus， CIAV）等多種病毒共感染的臨床病例，其中ALV-K亞群檢出率很高，導(dǎo)致多個內(nèi)臟器官出現(xiàn)嚴(yán)重病變。這是近年來當(dāng)?shù)爻霈F(xiàn)的免疫抑制性病毒共感染新模式，也提示在某些地區(qū)的特定雞群中ALV-K亞群帶來的潛在危害不可低估。因此，地方品種雞疫病凈化策略需要根據(jù)疾病流行新趨勢作出相應(yīng)調(diào)整，在各方面條件允許的前提下應(yīng)考慮同時加強針對ALV-J、ALV-K亞群以及CIAV感染陽性雞的檢測和淘汰。

1" 材料與方法

1.1" 病料來源及處理

病料來源于2023年8月廣西某養(yǎng)殖場一批110日齡的三黃雞，送檢數(shù)量36只，主要表現(xiàn)為貧血且生長緩慢、體型瘦小，疑似患腫瘤病。無菌采集其肝臟、心臟以及脾臟、小腸和腺胃等，分別研磨后加入5倍組織體積的滅菌PBS配成懸液，反復(fù)凍融3次，用于DNA的提取。

1.2" 組織病理學(xué)觀察

1.2.1" 病理切片制作" （1）病料處理：取有明顯病變的新鮮器官組織浸泡在10%中性福爾馬林中固定。24 h后將組織器官從固定液取出，用手術(shù)刀將病變明顯的部位修平整，并放入脫水盒內(nèi)做好相應(yīng)標(biāo)記；（2）脫水：將脫水盒置于脫水機內(nèi)，進行脫水浸蠟處理；（3）包埋：將經(jīng)過上一步脫水浸蠟處理后的組織放進包埋機內(nèi)進行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，在蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出，放入包埋框并貼上對應(yīng)的標(biāo)簽。置于-20 ℃冷卻，待蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊；（4）切片：將修整好的蠟塊用石蠟切片機切成片厚4～10 μm的切片，并將切片漂浮于50 ℃ 溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進60 ℃ 烘箱內(nèi)烤片。待水烤干、蠟烤化后取出，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2" 染色" （1）石蠟切片脫蠟：依次將切片放入透明劑Ⅰ10 min、透明劑Ⅱ10 min、無水乙醇Ⅰ10 min、無水乙醇Ⅱ10 min、95%酒精10 min、90%酒精10 min、80%酒精10 min、70%酒精10 min、蒸餾水洗；（2）蘇木素染色：切片放入蘇木素染液1～2 min，用自來水沖洗；鹽酸酒精分化30 s，并用自來水沖洗；（3）伊紅染色：切片放入伊紅染液中染色5 min；（4）脫水封片：將切片依次放入95%酒精Ⅰ 3 min、95%酒精Ⅱ 3 min、無水乙醇Ⅰ 3 min、無水乙醇Ⅱ 3 min 、透明劑Ⅰ 3 min、透明劑Ⅱ 3 min中脫水透明，將切片從透明劑拿出來稍晾干，中性樹膠封片；（5）顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.3" 主要試劑

通用型柱式基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA 純化回收試劑盒，購于TIANGEN 生化科技（北京）有限公司； 2×Taq PCR Mix、DL5 000 DNA Marker和DL2 000 DNA Marker，購自南京諾維贊生物科技股份有限公司。

1.4" 引物設(shè)計

根據(jù)參考文獻，設(shè)計引物擴增MDV 的Meq基因和132 bp重復(fù)片段；ALV 三個亞群（A、B和J亞群）的gp85基因，共用上游引物；ALV-K 的env基因；CIAV 的VP1基因；REV的LTR、env基因，相關(guān)信息見表1。引物由廣州華大基因科技股份有限公司合成。

1.5" PCR

取病雞的肝臟、脾臟、心臟組織勻漿，用DNA抽提試劑盒提取病料的總DNA，作為PCR擴增的模板。PCR反應(yīng)體系為10 μL，含2×Taq PCR Mix 5 μL、ddH2O 3 μL、上下游引物各 0.5 μL、DNA模板 1 μL。擴增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，按照表1中退火溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復(fù)變性、退火、延伸35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。

2" 結(jié)果

2.1" 臨床癥狀及剖檢病變

病雞表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、羽毛松亂，蹲伏，雞冠發(fā)白、眼睛半閉，死亡率約10%。剖檢可見部分病雞脾臟腫大（圖1A）和心臟腫大（圖1B），腺胃壁增厚、腺胃乳頭出血（圖1C），肝臟出現(xiàn)大量腫瘤樣結(jié)節(jié)（圖1D）。

2.2" 組織病理變化

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，病雞肝臟血管周圍異嗜性細(xì)胞浸潤，以異嗜性細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞為主，血管周圍和肝血竇彌漫性腫瘤細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞索受壓萎縮（圖2A）；肝臟大量腫瘤細(xì)胞增殖，腫瘤細(xì)胞胞核呈圓形、橢圓形、多邊形，染色質(zhì)明顯，并可見核分裂象，肝細(xì)胞受壓消失（圖2B）；脾臟顯示彌漫性實質(zhì)細(xì)胞凋亡，呈空泡狀，并可見大量異嗜性細(xì)胞浸潤和含鐵血黃素沉著（圖2C），同時發(fā)現(xiàn)脾臟有淤血現(xiàn)象（圖2D）；小腸和腺胃均發(fā)現(xiàn)大量腫瘤細(xì)胞浸潤（圖2E、圖2F）；心臟發(fā)生心肌炎，心肌纖維壞死，細(xì)胞溶解（圖2G，黑箭頭），伴大量炎細(xì)胞浸潤（圖2G，紅箭頭），心臟間質(zhì)有少量單核炎細(xì)胞浸潤（圖2H）。

2.3" 病毒核酸片段擴增結(jié)果

利用針對REV的LTR、env基因的特異性引物，均未擴增出特異性目的片段，表明這批病雞沒有被REV感染。利用針對MDV、ALV和CIAV的特異引物，從部分病雞肝臟、脾臟、心臟組織中擴增到與預(yù)期大小相符的目的條帶，MDV或CIAV單一感染的檢出率相同，僅為2.78%；兩種病毒共感染的比例較高，其中MDV和CIAV共感染的檢出率為13.89%，MDV和ALV共感染的檢出率為8.33%，ALV和CIAV共感染的檢出率為5.56%；而MDV、ALV和CIAV三種病毒共感染的檢出率最高，達63.88%（表2）。

在檢出ALV感染陽性的28只病雞中（圖3），沒有出現(xiàn)ALV-A或ALV-B亞群陽性個體，ALV-K亞群陽性病雞數(shù)明顯多于ALV-J亞群。在多重感染組別中，16只病雞存在ALV-J和ALV-K亞群與MDV和CIAV共感染，數(shù)量最多；其次是ALV-K亞群與MDV和CIAV共感染。只有個別雞只是ALV-J與MDV或ALV-J與CIAV共感染。

3" 討論

廣西是我國最大的三黃雞放養(yǎng)產(chǎn)區(qū)，以三黃雞為代表的優(yōu)質(zhì)雞產(chǎn)業(yè)在當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)產(chǎn)值中占據(jù)重要地位。在生物安全措施難以保障的飼養(yǎng)環(huán)境下，放養(yǎng)的三黃雞群更容易受到多種病原感染的威脅，導(dǎo)致死淘率增加，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟損失。此外，廣西本地優(yōu)質(zhì)雞的疫病凈化工作起步較晚，種源垂直傳播疫病在多個地方品種中廣泛流行，這也加劇了疫病凈化的實施難度。文章首次報道在放養(yǎng)的上市日齡三黃雞群中，存在MDV、ALV和CIAV等免疫抑制性病毒的多重感染。通過深入分析感染模式，我們發(fā)現(xiàn)該病例的ALV-K亞群感染占比相當(dāng)突出，提示現(xiàn)階段地方優(yōu)質(zhì)雞疫病凈化工作不能忽略ALV新亞群帶來的潛在危害。

據(jù)悉，這批三黃雞已接種含814株的MD疫苗，但仍有大量發(fā)病雞感染MDV野毒（圖3），這可能與初生雞苗被CIAV感染有關(guān)。這種推測也得到相關(guān)的動物感染試驗佐證，CIAV可以促進MDV感染導(dǎo)致的免疫抑制[6， 16]，增強MDV野毒的致病性，使MD疫苗的保護效果明顯減弱[17]。雖然廣西多個地方品種雞已開展ALV凈化[18-19]，但受技術(shù)條件、資金等因素限制大多數(shù)本地育種公司尚未將CIAV納入凈化目標(biāo)，這也是本群三黃雞普遍感染CIAV的主要原因之一。

過去十多年，不管在我國南方地區(qū)的優(yōu)質(zhì)雞還是普通蛋雞，腫瘤病的發(fā)生主要是由MDV和ALV-J亞群共感染造成，占比呈逐年上升趨勢[20-21]。新發(fā)現(xiàn)的ALV-K是我國特有的亞群，已從多個地方品種雞中分離鑒定[22-23]。與ALV-J亞群相比，大部分ALV-K分離株的復(fù)制能力較差，抗原表達水平低，致病性不明顯[24]，因此該亞群對種雞及其后代的影響容易被忽略和低估。研究的多數(shù)病雞存在MDV、CIAV和ALV-J等免疫抑制性病毒多重感染，因而增加了ALV-K亞群感染的概率，而且感染ALV-K的病雞多個器官均產(chǎn)生不同程度的病變，如肝臟和脾臟發(fā)生大量炎性細(xì)胞浸潤（圖2A、2C），脾臟淤血（圖2D），小腸和腺胃有大量腫瘤細(xì)胞增殖等（圖2E、F）。值得注意的是，未感染ALV-K的病雞心肌間質(zhì)僅發(fā)現(xiàn)少量單核炎細(xì)胞浸潤（圖2H），而感染ALV-K的病雞心臟不僅出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤，并且發(fā)生心肌炎、心肌纖維壞死、細(xì)胞溶解等（圖2G），這意味著ALV-K的感染可能會加重病雞的病情。雖然尚不清楚這些病毒是如何彼此協(xié)同促進腫瘤形成，但這起病例中三黃雞感染ALV-K亞群的比例已超過ALV-J亞群，這一新情況值得注意。

為減少雞群因感染MDV造成的損失，養(yǎng)殖場要保持良好的衛(wèi)生條件，定期消毒，采取封閉管理以降低病原污染風(fēng)險，排除應(yīng)激因素；其次，要保證飼料營養(yǎng)水平均衡，適當(dāng)添加微生態(tài)制劑和中草藥提取物以提高雞只的免疫力。為應(yīng)對MDV新變異株的出現(xiàn)及可能造成的免疫失敗，養(yǎng)殖戶可考慮選用新近獲批上市的國產(chǎn)MD活疫苗，如rMDV-MS-ΔMeq株、CVTR株、SC-9株等[25-28]。針對CIAV、ALV等種源垂直傳播病原，育種公司應(yīng)健全生物安全措施并嚴(yán)格執(zhí)行，加強檢測力度及時淘汰陽性種雞，以確保供應(yīng)的商品雞苗健康可靠。

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Clinical observations and analysis of co-infection with MDV， ALV and CIAV viruses in Three-yellow chickens

CHEN Xin1， 2，" LIU Linmin1， GAO Xin1，" WEI Tianchao1，" HUANG Teng1， 3， 4

（1.College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning" 530004， China;

2.College of Animal Science and Technology， Guangxi Agricultural Engineering Vocational Technical College， Chongzuo" 530028， China;

3.Guangxi Zhuang Autonomous Region Engineering Research Center of Veterinary Biologics， Nanning" 530004， China;

4.Guangxi Key Laboratory of Animal Breeding， Disease Control and Prevention， Nanning" 530004， China）

Abstract： A group of 110-day-old Three-yellow chickens with suspicious tumor onset were collected from a farm in Guangxi Province and then subjected to necropsy in field. Visceral tissues with apparent lesions， including the liver， heart， spleen， small intestine and proventriculus， were processed and examined for pathological changes. PCR tests were used to detect the target gene fragments specific for immunosuppressive viruses circulating in the region， for example MDV， ALV， REV and CIAV. Numerous tumor cells were found to proliferate and overwhelm the liver， proventriculus and small intestine. In the liver， the periphery of blood vessel was swarmed by various inflammatory cells， and the compressed hepatic cord was seen to shrink. The apoptotic parenchymal cells appeared vacuolar and diffused in the ecchymotic spleen， where a considerable amount of heterophils and deposition of hemosiderin were observed. In the heart， myocarditis was characterized by necrosis of myocardial fibers and cell lysis along with an abundance of inflammatory cells. Single infection with MDV or CIAV was detected in only few birds， while most chickens were concurrently infected with MDV， ALV and CIAV， accounting for 63.88% of the diagnosed individuals. Nevertheless， all tissue samples were tested negative for REV. Taken together， these Three-yellow chickens ready for being sold were diagnosed with tumors， which were largely attributed to the co-infection of MDV， ALV as well as CIAV， especially with the ALV-K subgroup.

Keywords： Three-yellow chickens; Marek's disease virus; Avian leukosis virus; Chicken infectious anemia virus; Co-infection; Pathological changes

基金項目：廣西科技重大專項（桂科AA23062050）；國家自然科學(xué)基金項目（32060793）

第一作者：陳鑫（1998—），女，碩士研究生，E-mail：1446562355@qq.com

通信作者：黃騰（1985—），男，博士，從事禽病防治與病原分子生物學(xué)研究，E-mail：thomashwang@gxu.edu.cn