河南汝南縣禽源致病性大腸桿菌血清型鑒定和毒力基因分布

摘 要：本研究旨在了解汝南縣禽源致病性大腸桿菌（APEC）血清型和毒力基因分布情況，采集來(lái)自汝南縣部分家禽養(yǎng)殖場(chǎng)疑似感染APEC家禽的腦、心臟、肝臟等病料，利用細(xì)菌分離培養(yǎng)、血清型PCR和凝集試驗(yàn)鑒定及毒力基因檢測(cè)。結(jié)果顯示，O1、O2、O18、O78血清型占比分別為43.2%、21.5%、15.8%、12.5%，其它血清型為7.0%。毒力基因iucD、tsh、iss、irp2檢出率較高，分別為100.0%、95.4%、87.1%、82.3%。所有菌株至少攜帶2種毒力因子，以攜帶3～5種最多。研究結(jié)果為開(kāi)展汝南縣禽大腸桿菌病的防控提供參考。

關(guān)鍵詞：禽致病性大腸桿菌；PCR；血清型；毒力基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C 文章編號(hào)：1673-1085（2025）03-0022-05

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）屬于腸桿菌科的兼性厭氧、革蘭氏陰性菌，也是人類(lèi)和動(dòng)物正常腸道微生物群的重要成員，廣泛存在于環(huán)境中[1]。禽大腸桿菌病（ APEC）引起最典型的病變是氣囊炎、心包炎、肝周炎、漿膜炎、腹膜炎和敗血癥等[2]，由于高發(fā)病率和死亡率，APEC是造成家禽業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的致病原因之一，也是人類(lèi)公共衛(wèi)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素，因?yàn)锳PEC菌株大多屬于腸外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenic E. coli，ExPEC），可引起敗血癥、新生兒腦膜炎和尿路感染等感染[3]。

E.coli抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血清型眾多，不同血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù)；不同血清型菌株致病力存在差異，且不同地區(qū)、不同時(shí)期的E.coli菌株血清型種類(lèi)也差別很大[4]。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)50余種對(duì)禽致病的大腸桿菌血清型[5]，國(guó)外流行的血清型主要有O1、O2和O78[6]。研究表明，大腸桿菌的致病性并不只與血清型有關(guān)，毒力因子在決定其致病性方面也很重要[7]。APEC含有多種毒力因子，如菌毛、毒素、侵襲素、鐵攝取系統(tǒng)、溶血素和外膜蛋白等[8]，但APEC攜帶的毒力因子情況差異較大。因此，了解APEC血清型、毒力因子流行分布情況對(duì)于控制E.coli傳播、流行病學(xué)研究、疫病診斷、疫苗研制以及致病機(jī)制至關(guān)重要。

本研究通過(guò)采集河南省汝南縣部分蛋雞、肉雞、鴨和鵝養(yǎng)殖場(chǎng)的病料，分離鑒定出276株APEC菌株，進(jìn)一步對(duì)分離菌進(jìn)行血清型鑒定和毒力基因檢測(cè)，為有效防治禽致病性大腸桿菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 病料來(lái)源" 2023年3月～2024年7月，在汝南縣部分蛋雞、肉雞、鴨和鵝養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采集疑似感染APEC病死家禽腦、心臟、肝臟、腸道、脾臟等組織病料，裝入塑料自封袋，共1 274份。

1.2" 主要試劑和儀器" 麥康凱平板培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA" Marker 2 000、2×PCR Mix，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；革蘭氏染液試劑盒（貨號(hào)：SP02274），購(gòu)自南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司；大腸桿菌O1、O2和O78單因子血清，購(gòu)自華南生物工程有限公司；梯度PCR儀（型號(hào)：OSE-GP-06），購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；一體式凝膠成像分析系統(tǒng)（型號(hào)：WD-9413B）、快速凝膠電泳儀（型號(hào)：DYCP-44P），購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.3" 引物" 參考文獻(xiàn)[5，8-9]設(shè)計(jì)用于鑒定E.coli及其血清型特異性引物和8種毒力基因引物，引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

1.4" APEC分離鑒定

使用接種環(huán)無(wú)菌挑取病料接種于麥康凱培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)。挑取亮紅色、圓形、表面光滑的菌落制作涂片、革蘭氏染色、鏡檢。將鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性菌的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)18～24 h以增菌純化。以純化的增菌液為PCR擴(kuò)增模板，利用E.coli特異性引物phoA-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR體系20 μL：菌液模板2 μL，2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，加入ddH2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，50 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸40 s，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，使用一體式凝膠成像分析系統(tǒng)拍照記錄。

1.5" APEC血清型鑒定

采用PCR和傳統(tǒng)的血清凝集方法確定所有樣本的O血清型，參考文獻(xiàn)[9]采用PCR擴(kuò)增方法鑒定APEC的O1、O2、O18、O78血清型，PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，分離菌DNA模板1.0 μL，加入ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性35 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下觀察。再采用E.coli O抗原單因子血清玻片凝集試驗(yàn)對(duì)PCR陽(yáng)性菌株進(jìn)行驗(yàn)證。取純化培養(yǎng)的菌液10 mL，8 000 g離心5 min，棄上清，加入5 mL生理鹽水重懸，121 ℃高壓滅菌2 h，即為菌體O抗原。各取E.coli抗O多因子血清和菌體O抗原10 μL在玻片上進(jìn)行凝集試驗(yàn)，30 s內(nèi)凝集者為陽(yáng)性。陽(yáng)性者，再用該多因子血清對(duì)應(yīng)的單因子血清進(jìn)一步進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，以確定菌株的O血清型。同時(shí)，設(shè)菌體O抗原與生理鹽水混勻作為對(duì)照組，排除自凝現(xiàn)象。

1.6" APEC毒力基因檢測(cè)

參考孟慶美等[8]建立的多重PCR檢測(cè)方法并適當(dāng)修改，對(duì)8種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)。

2" 結(jié)果

2.1" APEC的分離鑒定

分離菌在麥康凱培養(yǎng)基中產(chǎn)生亮紅色、圓形、表面光滑的菌落，革蘭氏染色鏡檢可見(jiàn)分離菌為兩端鈍圓、無(wú)芽孢、散在或成對(duì)排列的陰性菌。PCR擴(kuò)增獲得大小為761 bp左右的條帶，與預(yù)期相吻合（圖1）。根據(jù)細(xì)菌分離培養(yǎng)、菌體形態(tài)結(jié)果，結(jié)合PCR擴(kuò)增結(jié)果，證實(shí)分離菌為APEC菌株，共分離到526株。

2.2" APEC的血清型鑒定

利用APEC的血清型特異性引物對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR（圖2），并對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行凝集試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果可知，526株APEC菌株血清型分布如下：O1、O2、O18、O78血清型占比分別為43.2%（227/526）、21.5%（113/526）、15.8%（83/526）、12.5%（66/526），其它血清型為7.0%（37/526）。

2.3" APEC毒力基因檢測(cè)

采用多重PCR方法對(duì)APEC的8種毒力基因檢測(cè)（圖3），結(jié)果顯示：iucD、tsh、iss、irp2檢出率較高，分別為100.0%（526/526）、95.4%（502/526）、87.1%（458/526）、82.3%（433/526），均高于80.0%；cva/cvi、aatA檢出率分別為43.7%（230/526）、37.3%（196/526），papC、vat檢出率相對(duì)較低，分別為9.9%（52/526）、7.6%（40/526）（圖4）。所有菌株至少攜帶2種毒力因子，最多達(dá)8種，以攜帶3～5種最多，占比82.9%（436/526）。

3" 討論

由APEC引起的禽大腸桿菌病是一種復(fù)雜的綜合性疾病，發(fā)病廣泛，對(duì)世界范圍內(nèi)的家禽業(yè)產(chǎn)生了不良的影響。本研究對(duì)來(lái)自河南省汝南縣部分家禽養(yǎng)殖場(chǎng)的1 274份病料，通過(guò)APEC的分離培養(yǎng)、鏡檢和PCR檢測(cè)，共獲得526株APEC菌株，檢出率為41.3%，表明汝南縣家禽感染APEC情況比較嚴(yán)重，威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。對(duì)鑒定菌株進(jìn)一步進(jìn)行血清型分析，發(fā)現(xiàn)流行血清型主要為O1、O2、O18、O78，其中優(yōu)勢(shì)血清型為O1，其次為O2、O18、O78，提示血清型種類(lèi)較多給疫病防控帶來(lái)困難。區(qū)分致病性大腸桿菌菌株需要鑒定其所屬的血清型，與其他ExPEC相比，大多數(shù)APEC分離株可能是O1、O2、O18 和O78血清型[10]。國(guó)內(nèi)APEC血清型流行情況存在較大差異。Afayibo等[11]報(bào)道，中國(guó)東部APEC約80%屬于O1（12.17%）、O2（23.48%）和O78（44.78%）血清型，優(yōu)勢(shì)血清型為O78，與本研究結(jié)果一致。殷鶴予等[12]報(bào)道，河北省唐秦地區(qū)蛋雞APEC優(yōu)勢(shì)血清型為O2、O45、O78。劉伯承等[7]從湖南省部分地區(qū)APEC分離鑒定出15種血清型，其中O1、O2、O14、O78為優(yōu)勢(shì)血清型。不同地區(qū)禽致病性大腸桿菌血清型呈現(xiàn)多樣化，推測(cè)可能與其所處地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)環(huán)境、用藥習(xí)慣及疫苗防控等有關(guān)，提示應(yīng)在掌握當(dāng)?shù)匮逍土餍刑攸c(diǎn)基礎(chǔ)上有針對(duì)性地制定防控措施，以提高防治效果。

毒力基因主要是由細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒產(chǎn)生和釋放的蛋白質(zhì)。不同毒力因子在APEC感染宿主過(guò)程中發(fā)揮不同的作用機(jī)制，破壞宿主免疫系統(tǒng)，引起宿主炎癥反應(yīng)。研究APEC毒力基因攜帶情況有助于了解其致病力和致病機(jī)制。papC、iucD、irp2、tsh、vat、astA、iss、cva/cvi等8個(gè)毒力基因是禽源大腸桿菌致病性的關(guān)鍵[13]。這些毒力基因可能通過(guò)促進(jìn)大腸桿菌的入侵、定植和粘附，保護(hù)大腸桿菌免受宿主防御的攻擊，從而對(duì)致病性大腸桿菌菌株起保護(hù)作用[14]。多項(xiàng)研究表明，APEC可能通過(guò)增強(qiáng)cva / cvi、iss、tsh、irp2等多種基因編碼的毒力因子的致病性而引起大腸桿菌病[11]。本研究對(duì)526株APEC相關(guān)毒力基因檢測(cè)，結(jié)果顯示均檢出8種毒力基因，其中iucD、tsh、iss、irp2檢出率較高，攜帶毒力基因種類(lèi)在2～8種之間。禽源大腸桿菌的致病性與其所攜帶的毒力基因數(shù)量之間呈正相關(guān)[15]，研究結(jié)果表明，汝南縣APEC毒力基因譜分布廣泛，致病性強(qiáng)，這是導(dǎo)致家禽發(fā)病率和死亡率升高的原因之一。本研究與劉璨穎等[13]對(duì)廣東省佛山市禽源致病性大腸桿菌毒力因子攜帶情況調(diào)查結(jié)果基本一致。從已有眾多報(bào)道看[5，7，12，16]，不同地區(qū)的大腸桿菌毒力因子也有較大的差異。只有了解本地區(qū)禽源APEC毒力基因分布情況，才能正確判斷本地APEC致病力。本研究只對(duì)APEC的8種毒力基因檢測(cè)，盡管不夠全面，但在一定程度反映了汝南縣禽源大腸桿菌病毒力因子流行特點(diǎn)，為今后疫病防控和疫苗研制提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)支撐。

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