基于斑馬魚模型的人參阿膠口服液對氣血及免疫功能調(diào)節(jié)作用評估

摘要" 為研究人參阿膠口服液對氣血及免疫功能的調(diào)節(jié)作用，以受精后3 d（3 dpf）的野生型AB品系斑馬魚為試驗(yàn)對象，分別通過苯肼和酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)建立斑馬魚貧血和免疫力低下模型，分為正常對照組、模型對照組和人參阿膠口服液組，測定人參阿膠口服液的最大耐受濃度（MTC）；通過MTC和斑馬魚貧血及免疫力低下模型將試驗(yàn)分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組和人參阿膠口服液組，評估其調(diào)節(jié)氣血和免疫力的效果。結(jié)果表明，人參阿膠口服液調(diào)節(jié)氣血能力的MTC為31.20 μL/mL；與模型對照組相比，在濃度為15.60和31.20 μL/mL的處理組中，斑馬魚的心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度分別增加了276.64%和570.47%。人參阿膠口服液調(diào)節(jié)免疫力功能的MTC為3.91 μL/mL，與模型對照組相比，在0.98、1.95 和3.91 μL/mL的處理組中，斑馬魚體內(nèi)殘留熒光顆粒數(shù)量分別減少了34.35%、40.42%和52.10%；此外，在濃度為1.95和3.91 μL/mL的處理組中，斑馬魚體內(nèi)T細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯提高，分別比模型對照組增加了110.24%和126.94%。綜上，人參阿膠口服液具有改善貧血的效果，且能通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬和增強(qiáng)T細(xì)胞功能來調(diào)節(jié)免疫力。

關(guān)鍵詞" 人參阿膠口服液；斑馬魚；貧血；免疫調(diào)節(jié)

中圖分類號" R285.5 """文獻(xiàn)標(biāo)識碼" A """文章編號" 1007-7731（2025）05-0107-07

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.05.023

Evaluate the regulatory effects of ginseng donkey-hide gelatin solution on qi， blood and immune function based on zebrafish model

HAN Liang1 PEI Qinghua1 LI Li2 ZENG Aoqiong2

（1Shandong Gubentang Health Industry Development Group Co.， Ltd.， Jinan 250000， China；

2Jiangnan University， Wuxi 214000， China）

Abstract" To investigate the regulating effect of ginseng donkey-hide gelatin solution on qi， blood and immune function.The wild type AB strain zebrafish 3 dpf after insemination was used as the experimental object. The anemia and immune deficiency models of zebrafish were induced by phenylzine and vinorelbine tartrate， respectively， and were divided into normal control group， model control group and ginseng donkey-hide gelatin solution group. The maximum tolerance concentration （MTC） of ginseng donkey-hide gelatin solution was determined. The experiment was divided into normal control group， model control group， positive control group and ginseng donkey-hide gelatin solution group by MTC and zebrafish anemia and low immunity model to evaluate the effect of regulate qi， blood and immunity. The results showed that the MTC of ginseng donkey-hide gelatin solution to regulate the ability of qi， blood was 31.20 μL/mL. Compared with the model control group， in the treatment group of 15.60 and 31.20 μL/mL， the cardiac erythrocyte staining intensity of zebrafish increased by 276.64% and 570.47%， respectively. The MTC of ginseng donkey-hide gelatin solution regulating immune function was 3.91 μL/mL. Compared with the model control group， the number of residual fluorescent particles in zebrafish in 0.98， 1.95， and 3.91 μL/mL treatment groups decreased by 34.35%， 40.42%， and 52.10%， respectively. In addition， in the 1.95 and 3.91 μL/mL treatment groups， the fluorescence intensity of T cells in zebrafish was significantly increased， which was 110.24% and 126.94% higher than that in the model control group， respectively. To sum up， ginseng donkey-hide gelatin solution has the effect of improving anemia， and can regulating immunity by promoting macrophage phagocytosis and enhancing T cell function.

Keywords" ginseng donkey-hide gelatin solution; zebrafish; anemia; immune regulation

血液不足，易造成其滋養(yǎng)和營養(yǎng)功能下降，可能引起相應(yīng)的疾病發(fā)生[1]。補(bǔ)血是一種治療方法，常見的功能性食品原料包括阿膠、人參和鹿茸等，被廣泛譽(yù)為補(bǔ)血圣藥[2]。阿膠是一種類似明膠的塊狀制劑，由干皮或鮮皮經(jīng)過蒸煮濃縮而成[3]，具有調(diào)節(jié)氣血的功能，被廣泛用作貧血治療的營養(yǎng)補(bǔ)充劑[4]。宋怡敏等[5]研究表明，阿膠對鹽酸苯肼型貧血小鼠具有補(bǔ)血效果，能夠促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，從而促進(jìn)造血恢復(fù)。人參作為一種常見的中草藥，具有補(bǔ)氣、滋陰、清熱和生津等功能，被廣泛應(yīng)用于氣虛、血虛和津虛等，還有強(qiáng)身健體功能[6]。將這些中藥類補(bǔ)血藥進(jìn)行組合，能夠發(fā)揮協(xié)同作用并放大其優(yōu)勢效果。

斑馬魚作為一種新興的模式生物，生長周期較短，養(yǎng)殖成本較低，具有研究造血和免疫系統(tǒng)的天然優(yōu)勢，適合進(jìn)行高通量藥物篩選[7-8]。近年來，斑馬魚模型在功能性食品領(lǐng)域的功效評價(jià)中得到了廣泛應(yīng)用，主要用于評估功能物質(zhì)的調(diào)節(jié)免疫力[9]、抗氧化[10]和降血脂[11]等作用。本研究利用斑馬魚建立了貧血和低免疫力試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探究了由人參和阿膠為主要成分制備的人參阿膠口服液改善貧血及調(diào)節(jié)免疫力的作用。

1 材料與方法

1.1 樣品配制信息

人參阿膠口服液主要由阿膠和人參制備，使用時(shí)吸取原液。配方采用藥食同源的成分，以確保長期服用的安全性，無毒副作用。陽性對照：瑞克?生血寧片（簡稱生血寧，武漢聯(lián)合藥業(yè)），用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水作為溶劑；破壁靈芝孢子粉（中國金日制藥），用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水作為溶劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

斑馬魚在28 ℃的水中均勻飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（浙）2022-0004；IACUC倫理審查號：IACUC-2023-8073-01。

1.3 試劑與儀器

甲基纖維素（上海阿拉?。?；苯肼（上海依赫生物）；鄰聯(lián)茴香胺（Sigma）；無水乙酸鈉（國藥集團(tuán)）；無水乙醇（上海阿拉丁）；酒石酸長春瑞濱注射液（江蘇豪森藥業(yè)）；氯化鈉注射液（湖南科倫制藥）；熒光微球（Sigma）。

解剖顯微鏡（OLYMPUS）；CCD相機(jī)（上海土森視覺科技）；精密電子天平（OHAUS）；6孔板（浙江貝蘭伯生物）；共聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（Nikon）；顯微注射儀（Narishige）；拉針儀（Narishige）。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 最大耐受濃度（MTC） （1）調(diào)節(jié)氣血。將受精后3 d（3 dpf）的野生型AB品系斑馬魚放入6孔板中，分成正常對照組、模型對照組和人參阿膠口服液組。其中，人參阿膠口服液組濃度分別為7.81、15.60、31.20、62.50和125.00 μL/mL。6孔板置于28 ℃，6 h后，除正常對照組外，其余各組均加入苯肼。隨后28 ℃，24 h后，測定其調(diào)節(jié)氣血的最大耐受濃度（MTC）。（2）調(diào)節(jié)免疫力功能。取受精后3 d（3 dpf）的野生型AB品系斑馬魚放置于6孔板中，分成正常對照組、模型對照組和人參阿膠口服液組。其中，人參阿膠口服液組的濃度分別為0.98、1.95、3.91、7.81和15.60 μL/mL。6孔板置于28 ℃，培養(yǎng)6 h后，除正常對照組外，其余各組均通過靜脈注射酒石酸長春瑞濱注射液。隨后28 ℃，96 h后，測定其調(diào)節(jié)免疫力的最大耐受濃度（MTC）。

1.4.2 調(diào)節(jié)氣血 取受精后3 d（3 dpf）的野生型AB品系斑馬魚放置于6孔板中，分成正常對照組、模型對照組、陽性對照組和人參阿膠口服液組。其中，陽性對照組生血寧濃度250.00 μg/mL，人參阿膠口服液組的濃度分別為7.81、15.60和31.20 μL/mL。樣品板置于28 ℃，6 h后，除正常對照組外，其余各組均加入苯肼。28℃，1 h后，使用鄰聯(lián)茴香胺進(jìn)行染色。隨后，選取斑馬魚在顯微鏡下拍照，并用NIS-Elements D 3.20軟件處理數(shù)據(jù)。

1.4.3 調(diào)節(jié)免疫力 （1）促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬。取受精后3 d（3 dpf）的野生型AB品系斑馬魚放置于6孔板中，分成正常對照組、模型對照組、陽性對照組和人參阿膠口服液組。其中，陽性對照組的破壁靈芝孢子粉濃度125.00 μg/mL，人參阿膠口服液組的濃度分別為0.98、1.95和3.91 μL/mL。正常對照組僅注射熒光微球，其余各試驗(yàn)組均通過靜脈注射酒石酸長春瑞濱和熒光微球建立斑馬魚免疫力低下模型。28 ℃，96 h后，選取斑馬魚在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照，并使用Image-J軟件處理數(shù)據(jù)。（2）T細(xì)胞減少。取受精后3 d（3 dpf）的轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞紅色熒光斑馬魚放置于6孔板中，分成正常對照組、模型對照組、陽性對照組和人參阿膠口服液組。其中，陽性對照組的破壁靈芝孢子粉濃度125.00 μg/mL，人參阿膠口服液組的濃度分別為0.98、1.95和3.91 μL/mL。除正常對照組外，其余各試驗(yàn)組均通過靜脈注射酒石酸長春瑞濱注射液建立斑馬魚免疫力低下模型。28 ℃，48 h后，選取斑馬魚在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照，并使用NIS-Elements D 3.20軟件采集數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參阿膠口服液調(diào)節(jié)氣血的MTC測算

由表1可知，正常對照組和模型對照組中的斑馬魚均未死亡。人參阿膠口服液濃度在7.81～31.20 μL/mL未見斑馬魚死亡現(xiàn)象，與模型對照組狀態(tài)相似。人參阿膠口服液在濃度為62.50 μL/mL時(shí)造成37%的斑馬魚死亡，在濃度為125.00 μL/mL時(shí)造成47%的斑馬魚死亡?？梢?，人參阿膠口服液的最大安全濃度（MTC）為31.20 μL/mL。因此，在進(jìn)行調(diào)節(jié)氣血試驗(yàn)時(shí)，選擇人參阿膠口服液的低、中和高濃度分別為7.81、15.60和31.20 μL/mL。

2.2 人參阿膠口服液調(diào)節(jié)氣血評價(jià)

由表2可知，正常對照組的斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度值為4 936，而模型對照組的染色強(qiáng)度值僅為779，其心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度顯著降低（Plt; 0.001），說明斑馬魚貧血模型建立成功。陽性對照組給予生血寧（250.00 μg/mL）的斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度值為4 956，與模型對照組相比明顯升高（Plt;0.001）。7.81 μL/mL的人參阿膠口服液組紅細(xì)胞染色強(qiáng)度值雖有上升趨勢，但與模型對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。人參阿膠口服液濃度為15.60和31.20 μL/mL時(shí)，心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度與模型對照組相比，分別增強(qiáng)了276.64%和570.47%。說明在15.60和31.20 μL/mL濃度下，人參阿膠口服液對苯肼誘導(dǎo)的斑馬魚貧血具有顯著的改善作用。

模型對照組的心臟紅細(xì)胞染色較淺，強(qiáng)度明顯低于正常對照組，而陽性對照組給予生血寧（250.00 μg/mL）后，染色程度明顯高于模型對照組。人參阿膠口服液在中濃度組（15.60 μL/mL）和高濃度組（31.20 μL/mL）中斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色程度比低濃度組（7.81 μL/mL）明顯，其中高濃度組中斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色程度明顯比模型組高（圖1）。結(jié)果表明，在15.60 和31.20 μL/mL試驗(yàn)濃度條件下，人參阿膠口服液可增強(qiáng)斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度，其結(jié)果與表2一致。

2.3 人參阿膠口服液調(diào)節(jié)免疫力MTC測算

由表3可知，正常對照組和模型對照組中的斑馬魚均未見死亡。人參阿膠口服液在0.98～3.91 μL/mL的濃度范圍內(nèi)未見斑馬魚死亡現(xiàn)象，與模型對照組狀態(tài)相似。人參阿膠口服液在濃度為7.81 μL/mL時(shí)造成10%的斑馬魚死亡，在濃度為15.60 μL/mL時(shí)造成60%的斑馬魚死亡。由此可見，人參阿膠口服液的增強(qiáng)免疫力功效的MTC為3.91 μL/mL。因此，進(jìn)行增強(qiáng)免疫力功效試驗(yàn)時(shí)，選擇的人參阿膠口服液低、中和高濃度分別為0.98、1.95和3.91 μL/mL。

2.4 人參阿膠口服液調(diào)節(jié)免疫力評價(jià)

2.4.1 促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬 模型對照組斑馬魚體內(nèi)剩余熒光顆粒數(shù)目顯著高于正常對照組（Plt;0.001），這說明酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)的斑馬魚免疫力低下模型建立成功。與模型對照組相比，陽性對照組（破壁靈芝孢子粉125.00 μg/mL）斑馬魚體內(nèi)剩余熒光顆粒數(shù)目明顯降低（Plt;0.001）；人參阿膠口服液在低濃度組（0.98 μL/mL）、中濃度組（1.95 μL/mL）和高濃度組（3.91 μL/mL）的斑馬魚體內(nèi)剩余熒光顆粒數(shù)目明顯降低（Plt;0.001），分別降低了34.35%、40.42%和52.10%，且人參阿膠口服液呈劑量依賴性。說明在低、中和高3種濃度條件下，人參阿膠口服液顯著減少了酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)殘留熒光顆粒數(shù)量，能夠調(diào)節(jié)免疫力（表4）。

模型對照組的斑馬魚體內(nèi)剩余熒光顆粒數(shù)目明顯比正常對照組和陽性對照組多。人參阿膠口服液在低濃度組、中濃度組和高濃度組的斑馬魚體內(nèi)剩余熒光顆粒數(shù)目明顯比模型對照組少。當(dāng)體內(nèi)殘留的熒光微球數(shù)量較少時(shí)，這表明斑馬魚體內(nèi)的巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬外來異物的能力。結(jié)果表明，在0.98、1.95 和3.91 μL/mL濃度下，人參阿膠口服液具有增強(qiáng)免疫力作用，其結(jié)果與表4一致（圖2）。

2.4.2 增強(qiáng)T細(xì)胞 如表5所示，模型對照組斑馬魚T細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著低于正常對照組（Plt;0.001），表明酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)的斑馬魚免疫力低下模型建立成功。而陽性對照組使用破壁靈芝孢子粉（125.00 μg/mL）后，斑馬魚T細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著高于（Plt;0.001）模型對照組。與模型對照相比，0.98 μL/mL的人參阿膠口服液組T細(xì)胞熒光強(qiáng)度值雖有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.01）。在人參阿膠口服液中濃度組（1.95 μL/mL）和高濃度組（3.91 μL/mL）中，斑馬魚T細(xì)胞熒光強(qiáng)度值分別為23 229和25 075，與模型對照組相比，分別提高了110.24%和126.94%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）。說明在1.95和3.91 μL/mL濃度下，人參阿膠口服液具有增強(qiáng)T細(xì)胞功能的作用，可調(diào)節(jié)免疫功能。

如圖3所示，模型對照組的斑馬魚體內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯比正常對照組和陽性對照組弱。人參阿膠口服液中濃度和高濃度組的斑馬魚體內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯比模型對照組強(qiáng)。結(jié)果表明，在1.95和3.91 μL/mL濃度下，人參阿膠口服液具有增強(qiáng)T細(xì)胞熒光強(qiáng)度的作用，其結(jié)果與表5一致。

3 結(jié)論與討論

人參作為一種藥食同源的植物，能夠補(bǔ)脾益肺，生津安神，是補(bǔ)益和治療虛勞的首選藥物，有助于預(yù)防疾病[12]。從人參中提取的各種生物活性化合物具有多種功能，包括抗氧化[13]、加強(qiáng)造血功能[14]、抗癌[15]、降血糖[16]、皮膚保護(hù)[17]、抗骨質(zhì)疏松[18]和抗感染[19]等。董思穎等[20]研究了人參肉桂膏對增強(qiáng)斑馬魚免疫力、緩解疲勞和減少肌肉流失的效果，結(jié)果表明，人參肉桂膏在高濃度組（0.4和0.8 mg/mL）中巨噬細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度高于破壁靈芝孢子粉膠囊組，而在其他濃度組（0.2 mg/mL）中，其熒光強(qiáng)度較模型組有明顯改善。人參肉桂膏對巨噬細(xì)胞減少癥的斑馬魚有顯著的改善作用，并能增強(qiáng)斑馬魚的免疫力。貧血患者在食用阿膠28 d后，血清鐵和血紅蛋白濃度顯著增加，這表明阿膠可以改善貧血[21]。林健等[22]通過使用黃芪阿膠補(bǔ)鐵口服液來改善大鼠的缺鐵性貧血，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過32 d的治療，各劑量組的大鼠血紅蛋白水平均顯著高于低鐵對照組，表明黃芪阿膠補(bǔ)鐵口服液對缺鐵性貧血具有改善作用。陳永剛[23]研究了健脾益腎方與復(fù)方阿膠漿聯(lián)合治療貧血的效果，發(fā)現(xiàn)接受這種聯(lián)合治療的貧血患者，其紅細(xì)胞計(jì)數(shù)等外周血象指標(biāo)均顯著優(yōu)于對照組，有助于改善貧血癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，人參阿膠口服液具有改善貧血和增強(qiáng)免疫力功效，與以上研究結(jié)果相似。

綜上，本研究采用斑馬魚模型，探究人參阿膠口服液在調(diào)節(jié)氣血和免疫力方面的作用。結(jié)果表明，人參阿膠口服液濃度在7.81～31.20 μL/mL對斑馬魚無毒性；在濃度為15.60和31.20 μL/mL的人參阿膠口服液處理組中，能夠明顯提升苯肼誘導(dǎo)的貧血斑馬魚的心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度，與模型對照組相比，分別增強(qiáng)了276.64%和570.47%。人參阿膠口服液濃度在0.98～3.91 μL/mL對斑馬魚無毒性；濃度為0.98、1.95 和3.91 μL/mL的人參阿膠口服液減少了石酸長春瑞濱誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)殘留熒光顆粒數(shù)目，與模型對照組相比，分別降低了為34.35%、40.42%和52.10%，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功效；濃度為1.95 和3.91 μL/mL的人參阿膠口服液顯著增強(qiáng)了T細(xì)胞熒光強(qiáng)度，與模型對照組相比分別提高了110.24%和126.94%，增強(qiáng)了T細(xì)胞功效。綜上所述，人參阿膠口服液具有調(diào)節(jié)氣血和免疫力的作用。

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