基于高通量測序技術(shù)的活性干酵母中的微生物多樣性分析

摘要" 為明確酵母產(chǎn)品的菌相構(gòu)成，本研究采用純培養(yǎng)法和高通量測序技術(shù)對活性干酵母及其原料糖蜜和酵母蛋白胨的微生物多樣性進(jìn)行分析。純培養(yǎng)法結(jié)果表明，活性干酵母的主要微生物菌群為葡萄球菌和乳酸乳球菌。高通量測序結(jié)果表明，活性干酵母的主要微生物菌群為桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬以及威克漢姆酵母屬；糖蜜的主要微生物菌群為明串珠菌屬、威克漢姆酵母屬和結(jié)合酵母屬；酵母蛋白胨的主要微生物菌群為葡萄球菌屬、威克漢姆酵母屬。研究結(jié)果為了解活性干酵母的菌相成分提供參考，為有針對性地在酵母發(fā)酵中對雜菌進(jìn)行精準(zhǔn)地抑制提供一定參考。

關(guān)鍵詞" 活性干酵母；菌相分析；高通量測序；微生物多樣性

中圖分類號" S-3 """文獻(xiàn)標(biāo)識碼" A """文章編號" 1007-7731（2025）05-0093-04

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.05.020

Analysis of microbial diversity in active dry yeast based on high-throughput sequencing technology

LI Yanli JIANG Yifei QIN Leilei HU Yan ZHANG Xiaoji HAN Shujun

（Three Gorges Public Inspection and Testing Center， Yichang 443000， China）

Abstract" To determine the microbial composition of yeast products， the microbial diversity of active dry yeast， its raw molasses and yeast peptone were analyzed by pure culture method and high-throughput sequencing technology. The results of pure culture showed that the main microbial groups of active dry yeast were Staphylococcus and Lactococcus lactis. The results of high-throughput sequencing showed that the main microbial groups of active dry yeast were Bacillus， Leuconostoc， Weissella， Staphylococcus and Wickerhamomyces. The main microbial community of molasses were Leuconostoc， Wickerhamomyces and Zygosaccharomyces. The main microbial group of yeast peptone were Staphylococcus and Wickerhamomyces. The results of this study provide a reference for understanding the composition of active dry yeast， and provide a reference for the precise inhibition of hybrid bacteria in yeast fermentation.

Keywords" active dry yeast; microbial facies analysis; high-throughput sequencing; microbial diversity

活性干酵母是鮮酵母經(jīng)脫水干燥、復(fù)水活化后仍具有較強發(fā)酵能力的干酵母制品[1]。其以淀粉或糖蜜為原料，輔以粗加工原料如酵母蛋白胨等，是一種以顆粒形式存在但不失去生物活性的酵母產(chǎn)品[2]。隨著現(xiàn)代檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物多樣性的研究方法也得到了發(fā)展壯大，目前的研究方法主要集中在傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)和現(xiàn)代的分子生物學(xué)技術(shù)上，前者主要包括平板劃線培養(yǎng)、Biolog技術(shù)等，后者主要包括DNA探針雜交、PCR擴增技術(shù)等。高通量測序技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確的突出特點，被廣泛應(yīng)用于分析食品中的微生物多樣性[3]。與傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)技術(shù)等方法相比，該方法可一次性對樣品中的幾十萬到幾百萬條脫氧核糖核酸分子序列進(jìn)行測定，從而快速確定微生物的種類和豐度[4]。該技術(shù)不僅可以展示微生物在門、屬等水平的豐度及結(jié)構(gòu)組成，還能合理預(yù)測相關(guān)功能，是微生物代謝分析的有效手段[5]。傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)技術(shù)和高通量測序技術(shù)目前已得到較多的應(yīng)用，這兩種方法各有特點，比如傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)技術(shù)難以準(zhǔn)確反映微生物的實際構(gòu)成情況，而高通量測序技術(shù)由于數(shù)據(jù)量大，對數(shù)據(jù)的處理和解析過程較煩瑣，且成本較高，限制了其在食品工業(yè)中的推廣[6]。因此在研究過程中，將兩類方法有效結(jié)合，取長補短，才能更好地對產(chǎn)品的微生物多樣性進(jìn)行研究。

目前對活性干酵母的微生物多樣性分析較少，本研究采用純培養(yǎng)法與高通量測序技術(shù)對活性干酵母及其原料糖蜜和酵母蛋白胨的菌相構(gòu)成進(jìn)行研究，并對其中雜菌來源進(jìn)行初步探討，識別產(chǎn)品中可能存在潛在的危害或影響因子，有利于針對性改善工藝，降低生產(chǎn)成本，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量，為產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)修訂及產(chǎn)品創(chuàng)新提供參考，并為產(chǎn)品應(yīng)用后期風(fēng)味影響研究提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同種類的活性干酵母（7種），糖蜜和酵母蛋白胨均來自市售，PCA培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌擴增引物：標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌16S V3V4（a），真菌擴增引物：標(biāo)準(zhǔn)真菌ITS1（a）；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit、瓊脂糖和TAE，購自Invitrogen。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動微生物鑒定系統(tǒng)（梅里埃）、PCR擴增儀（ABI）、酶標(biāo)儀（BioTek）、電泳儀（北京六一）、凝膠成像系統(tǒng)（北京百晶）。

1.3 微生物的分離鑒定

1.3.1 微生物的分離篩選 （1）平板計數(shù)瓊脂篩選。參考GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》；稱取25 g酵母于225 mL生理鹽水中，均質(zhì)2 min制成1∶10的樣品勻液。吸取1∶10樣品勻液1 mL于 9 mL生理鹽水中，渦旋混勻，制成1∶100的樣品勻液。依次制備10倍稀釋系列樣品勻液。吸取各樣品勻液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，并加入平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)動混勻。待瓊脂凝固后將平板倒置，（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h，觀察平板上菌落生長情況，挑取不同的特征菌進(jìn)行分離純化。（2）營養(yǎng)肉湯增菌篩選。在無菌條件下，稱取25 g酵母，加入225 mL營養(yǎng)肉湯，均質(zhì)。于（36±1）℃培養(yǎng)20 h，劃線轉(zhuǎn)接營養(yǎng)瓊脂平板，（36±1）℃培養(yǎng)24 h后，觀察平板上菌落生長情況，對不同的特征菌落進(jìn)行分離純化。

1.3.2 微生物的鑒定 將分離純化得到的不同特征菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并用生化鑒定儀對分離的目標(biāo)菌進(jìn)行生化鑒定。

1.4 高通量測序

按照DNA 提取試劑盒說明提取樣品的微生物群落總DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，采用Nanodrop測定DNA濃度和純度。采用Pfu高保真DNA聚合酶，細(xì)菌使用16S V3-V4 區(qū)特異性引物（上游引物：ACTCCTACGGGAGGCAGCA；下游引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）進(jìn)行PCR擴增，真菌使用ITS1（a）（上游引物：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；下游引物：GCTGCGTTCTTCATCGATGC）進(jìn)行PCR擴增。具體體系見表1。

PCR 擴增程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)該循環(huán)27次；最后72 ℃穩(wěn)定延伸5 min。將擴增得到的DNA產(chǎn)物進(jìn)行 2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段用Axygen 凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit將PCR擴增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量分析，根據(jù)熒光定量結(jié)果，根據(jù)每個樣本的測序量要求，對各個樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫進(jìn)行質(zhì)檢，再采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對文庫進(jìn)行定量，將合格的上機測序文庫梯度稀釋后，根據(jù)測序量按比例混合，經(jīng)NaOH變性后上機測序；建庫與測序等工作委托武漢百易匯能生物科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對于細(xì)菌的16S rRNA基因，選用Silva數(shù)據(jù)庫[7]，采用QIIME2的classify-sklearn算法[8]；對于真菌ITS序列，選用UNITE數(shù)據(jù)庫（Release 9.0）[9]。首先將測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，然后使用QIIME2（2023.7）軟件用DADA2方法[10]進(jìn)行去重，以100%相似度聚類，生成特征序列ASVs。這些序列在樣本中的豐度表稱為特征表（對應(yīng)于OTU表）。使用R語言將ASV/OTU數(shù)目繪制成柱狀圖，對ASV/OTU進(jìn)行統(tǒng)計，可以獲得每個樣本中微生物群落在各分類水平上的物種組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離鑒定

根據(jù)菌落典型特征，從活性干酵母中分離出了4種菌，包括木糖葡萄球菌、雞葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、乳酸乳球菌乳亞種（表2）。

2.2 高通量測序

如圖1～2所示，細(xì)菌的分類學(xué)在屬水平（genus）上獲得了較多的ASV/OTU數(shù)目，而真菌的分類學(xué)在種水平（species）上獲得了較多的ASV/OTU數(shù)目。

2.2.1 細(xì)菌物種組成分析 本研究在屬水平上統(tǒng)計出相對豐度排名前10的物種，繪制出各樣品對應(yīng)的物種相對豐度圖。如圖3所示，J-1酵母中主要有不動細(xì)菌屬（Acinetobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、桿菌屬（Bacillus）；J-2酵母中主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、土芽孢桿菌屬（Geobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）；J-3酵母中主要有腸球菌屬、土地桿菌屬（Pedobacter）；J-4酵母中主要有桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）；J-5酵母中主要有魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬；J-6糖蜜中主要有明串珠菌屬（Leuconostoc）；J-7酵母蛋白胨中主要有葡萄球菌屬（Staphylococcus）；J-8、J-9酵母中主要有魏斯氏菌屬（Weissella）、桿菌屬、葡萄球菌屬。綜上，活性干酵母中通過高通量測序分析得到的酵母屬水平的細(xì)菌主要集中在桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌以及葡萄球菌屬。

2.2.2" 真菌物種組成 由圖4可知，J-5酵母中，僅有威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）；J-6糖蜜中，威克漢姆酵母屬豐度比達(dá)到75%以上，還有少量結(jié)合酵母屬（Zygosaccharomyces）；J-7酵母蛋白胨中，威克漢姆酵母屬豐度比接近50%。由此可以看出，活性干酵母中主要的真菌為威克漢姆酵母屬。

綜上，結(jié)合細(xì)菌和真菌的物種組成，表明活性干酵母的主要微生物菌群為桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬以及威克漢姆酵母屬；糖蜜的主要微生物菌群為明串珠菌屬、威克漢姆酵母屬和結(jié)合酵母屬；酵母蛋白胨的主要微生物菌群為葡萄球菌屬、威克漢姆酵母屬。

3 結(jié)論與討論

純培養(yǎng)法和高通量測序技術(shù)是常見的微生物多樣性分析方法。賈鑫等[3]基于純培養(yǎng)法結(jié)合高通量測序技術(shù)，成功解析了脹袋輻照鳳爪中的微生物多樣性。本研究通過純培養(yǎng)法及高通量測序技術(shù)分析活性干酵母中的微生物多樣性。純培養(yǎng)法結(jié)果表明，活性干酵母的主要微生物菌群為葡萄球菌和乳酸乳球菌。而高通量測序結(jié)果表明，活性干酵母的主要微生物為桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌以及葡萄球菌屬和威克漢姆酵母屬。作為活性干酵母生產(chǎn)的原料，糖蜜主要微生物菌群為明串珠菌屬、威克漢姆酵母屬和結(jié)合酵母屬；酵母蛋白胨的主要微生物菌群為葡萄球菌屬、威克漢姆酵母屬。本研究為活性干酵母的微生物群落多樣性研究提供一定理論參考，但其具體的酵母菌相分析，還需進(jìn)行進(jìn)一步的分析與研究。

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（責(zé)任編輯：胡立萍）