辣椒內生煙管菌的分離鑒定與生長條件優(yōu)化

摘要" 以辣椒品種羊角椒為試驗材料，從中分離篩選內生真菌，并通過形態(tài)學觀察和序列分析對其進行鑒定，考察不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖及可溶性淀粉）、氮源（氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、酵母膏和蛋白胨）、促進劑（吐溫-80和油酸）及pH（5.0～12.0）對該菌株生長的影響。結果表明，從羊角椒中分離出的內生真菌菌絲正面白色絨毛狀，無色素產生，氣生生長，質地疏松；有隔膜，擔孢子橢圓形，頂端鈍圓；基因序列大小為515 bp，與Bjerkandera adusta在同一個分支上，可初步鑒定為煙管菌，并命名為煙管菌LJ-1。該菌生長的最適碳源為蔗糖、最適氮源為酵母膏、最適促進劑為油酸、最適pH在6.0～8.0，上述條件下菌絲生長速度較為理想，且呈現出良好的長勢狀態(tài)。研究結果為辣椒內生煙管菌的深入研究提供參考。

關鍵詞" 辣椒；內生真菌；煙管菌；分離鑒定；條件優(yōu)化

中圖分類號" Q939.5 """"""文獻標識碼" A"""""" 文章編號" 1007-7731（2025）05-0018-05

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.05.005

Isolation， identification and optimization of growth conditions of endophytic fungi of Bjerkandera adusta in pepper

OU Mingyun""" SONG Min""" HE Jia""" FENG Siyan""" HU Xiuhong

（School of Life and Health Science， Kaili University， Kaili 556011， China）

Abstract" The endophytic fungi was isolated and screened from" pepper variety Yangjiaojiao， and identified by morphological observation and sequence analysis. The effects of different carbon sources （glucose， maltose， sucrose， lactose and soluble starch）， nitrogen sources （ammonium chloride， ammonium sulfate， potassium nitrate， yeast extract and peptone）， accelerators （Tween-80 and oleic acid）， and pH （5.0-12.0） on the growth of this strain were investigated. The results showed that the front side of the endophytic fungi mycelium isolated from the pepper was white fluffy-like， no pigment production， air growth and loose texture. Septate， spore-bearing oval， apical obtuse; The gene sequence size was about 515 bp， and it was on the same branch as Bjerkandera adusta， which can be preliminarily identified as Bjerkandera adusta and named Bjerkandera adusta" LJ-1. The optimal carbon source for the growth of the bacteria was sucrose， the optimal nitrogen source was yeast extract， the optimal accelerator was oleic acid， and the optimal pH was 6.0-8.0. Under the above conditions， the mycelium growth rate was ideal and showed a good growth state. The results provide a reference for further study of Bjerkandera adusta.

Keywords" pepper; endophytic fungi; Bjerkandera adusta; isolation and identification; optimizing conditions

煙管菌（Bjerkandera adusta），又稱黑管菌，屬擔子菌綱（Basidiomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）煙管菌屬（Bjerkandera），是一種木腐型真菌[1]。多數大型真菌的子實體不易被病菌或昆蟲侵襲[2]，且受傷后的子實體能產生大量具有抗菌、殺蟲等效果的活性代謝產物[3]，可作為生物防治植物病蟲害的重要資源。Dománski等[4]研究表明，煙管菌可有效防治在櫟樹上發(fā)生的褐腐病。汪華等[5]和張旭輝[6]報道指出，煙管菌對紋枯病菌、黃萎病菌和青枯病菌等具有較好的防治效果，以該菌株制備的散粒劑可以防治番茄青枯病、立枯病，棉花根腐病、黃萎病以及西瓜根腐病等。

近年來，相關研究表明煙管菌對番茄灰霉病菌[7]、柑橘炭疽病菌[8]、小麥赤霉病菌[9]、西瓜蔓枯病菌[10]和油菜菌核病菌[11]等植物病原菌均有良好的抑制作用?；诖耍狙芯繌馁F州地區(qū)的植物辣椒中分離、篩選并鑒定出一株煙管菌，探究不同碳源、氮源、促進劑及pH對該菌株生長的影響，為進一步開發(fā)防治多種植物病害的生物制劑提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PDA培養(yǎng)基（分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司）；羊角椒，采購于貴州省黔東南州凱里經濟開發(fā)區(qū)農貿市場。

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺（上海蘇凈實業(yè)有限公司）；BGZ-246型電熱鼓風干燥箱和LDZX-50kbs型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；光學顯微鏡和倒置光學顯微鏡（日本OlympusPCR）；Gel DOC XT凝膠成像系統(tǒng)儀 （美國BIO-RAD）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化 無菌條件下，將洗凈的新鮮羊角椒切成小塊（5 mm×5 mm），依次放入1%次氯酸鈉溶液中30 s后取出吸干，再放入75%乙醇中消毒20 s，最后用無菌水漂洗3次，吸干表面水分。將消毒好的辣椒組織小塊呈“品”字形置于PDA固體培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱于28 ℃培養(yǎng)3～5 d。待菌落長出后，從中選取典型的白色單菌落進行多次劃線分離培養(yǎng)，直至獲得純菌種。

1.2.2 菌株的分類鑒定 觀察平板培養(yǎng)中的菌株菌落形態(tài)特征，測定其生長速率，于顯微鏡下觀察其孢子及菌絲形態(tài)特征。按照SK8259試劑盒操作步驟提取真菌基因組DNA，采用真菌通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增。引物序列：ITS（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），由上海生工合成。擴增體系為25 μL：10×PCR Buffer 5 μL，50 mmol/L MgSO4 5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL TaqDNA酶0.5 μL，正反向引物（10 μmol/L ITS1和ITS4）各1 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序設定：預變性 95 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火57 ℃，30 s，延伸72 ℃，90 s，30個循環(huán)；后延伸 72 ℃，10 min，4 ℃保存。

PCR擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR反應產物純化后送上海生工生物工程股份有限公司進行測序。使用NCBI數據庫GenBank中的BLAST對測序所獲的ITS序列進行同源性比對，下載數據庫中相似度較高的同源序列，通過MEGA 5.0軟件采用Neighbor-joining法（檢驗值Bootstap為1 000）構建系統(tǒng)發(fā)育樹[12-13]。

1.2.3 菌株生長條件優(yōu)化 參照文獻[14]將菌種活化后，加入2 mL/L的吐溫-80孢子洗脫液，以接種環(huán)輕刮菌落表面反復吹打，之后將洗脫液保存在離心管中，使用血細胞計數板計數，再用孢子洗脫液將濃度調至1×106/mL，備用。以碳源、氮源、促進劑及pH為考察因素，探討不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖及可溶性淀粉）、氮源（氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、酵母膏和蛋白胨）、促進劑（吐溫-80和油酸）及pH（5.0～12.0）條件下菌株的生長情況。配制不同的真菌液體培養(yǎng)基時，分別將基礎培養(yǎng)基中的20 g葡萄糖換算成有效成分含量相當的其他碳源、氮源或促進劑物質，調節(jié)pH，添加20 g/L瓊脂粉制成固體培養(yǎng)基；以不添加任何碳源或氮源物質的培養(yǎng)基為對照組。平板接種后置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)，并開始每天對不同生長條件下的菌絲生長速度進行測量，直至菌絲長滿整個平皿，平行試驗3次。

1.3 數據處理

利用Excel軟件進行數據處理，用GraphPad Prism 5 軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

將純化獲得的菌株編號為LJ-1，該菌在PDA培養(yǎng)基上生長較快，培養(yǎng)第1天菌落直徑為17～18 mm，第2天菌落直徑為41～45 mm，第3天菌落直徑為72～74 mm；菌落整體呈圓形，菌絲正面白色絨毛狀，無色素產生，氣生生長，質地疏松（圖1A～B）；顯微鏡下菌絲具有隔膜，擔孢子橢圓形，頂端鈍圓（圖1C）。

2.2 菌株的分子生物學鑒定

經測序，菌株LJ-1的基因序列大小約為515 bp。由圖2可知，LJ-1的基因序列與Bjerkandera adusta 在同一個分支上，親緣關系最近，序列相似性為82%，與Trichoderma harzianum親緣關系最遠。初步判斷LJ-1菌株可能為Bjerkandera adusta，并命名Bjerkandera adusta LJ-1。

2.3 菌株的生長條件優(yōu)化

2.3.1 碳源 由圖3可知，同一菌株在不同碳源條件下的菌絲生長速度有所不同。當蔗糖為碳源時，菌株菌絲生長速度最快，平均為2.27 cm/d，當葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉為碳源時，菌絲生長速度較快，分別為2.17、2.10和2.04 cm/d；當乳糖為碳源時，菌絲生長速度較慢，平均為1.58 cm/d，與蔗糖碳源組差異具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。由此可知，菌株在固體培養(yǎng)基中生長的最適碳源為蔗糖。

2.3.2 氮源 以酵母膏和蛋白胨為氮源時，菌株在固體培養(yǎng)基中菌絲生長速度較快，分別為2.41和1.97 cm/d，且兩者的菌絲長勢均致密均勻；其次為硝酸鉀和硫酸銨，平均生長速度分別為1.77和1.74 cm/d，但前者菌絲長勢不良，菌絲體較稀疏，而后者菌絲長勢均勻且密集；以氯化銨為氮源時，菌絲生長速度最慢，為1.09 cm/d，長勢較好，菌絲較均勻。酵母膏組、氯化銨組與對照組差異具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。綜合菌絲生長速度和生長勢可知，菌株生長最適氮源為酵母膏（圖4）。

2.3.3 促進劑 由圖5可知，同一菌株在不同促進劑處理下的菌落生長速度有所不同，在以油酸為促進劑的固體培養(yǎng)基中菌絲平均生長速度較快，為2.26 cm/d，菌絲長勢較好，致密均勻；在以吐溫-80為促進劑的固體培養(yǎng)基中菌絲平均生長速度較慢，為1.77 cm/d，菌絲長勢稀疏。綜合可知，菌株生長最適促進劑為油酸。

2.3.4 pH 由圖6可知，在pH 5.0～12.0的固體培養(yǎng)基上，菌株LJ-1具備一定的生長能力。但其長勢以及生長速度存在一定的差異。在pH 6.0時，菌絲生長速度較快，為1.61 cm/d，但菌絲生長較稀疏不均勻；在pH為10.0時，菌絲生長速度為1.59 cm/d，菌絲生長致密均勻；pH為5.0和9.0時，菌絲生長速度分別為1.54和1.52 cm/d，菌絲的分布極為稀疏且不均勻。在pH為11.0時，菌絲生長速度為1.56 cm/d，菌絲長勢較好且致密均勻；pH為12.0時，菌絲生長速度較慢，為1.50 cm/d，菌絲長勢不均勻，有的區(qū)域僅有少量菌絲勉強生長，而大片的區(qū)域則完全沒有菌絲的蹤跡。與對照組相比，不同pH組間生長速度差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。綜合考量菌絲的生長速度以及長勢情況，確定該菌株生長的最適pH為 6.0～8.0。在這個pH范圍內，菌絲生長速度較為理想，且呈現出良好的長勢狀態(tài)。

3 結論與討論

蔡文韜[15]從辣椒果肉中分離獲得一株解淀粉芽孢桿菌，發(fā)現該菌株對辣椒疫霉病菌、辣椒黑霉病菌及辣椒炭疽病菌3種病原菌均有明顯的抑制作用。朱曉琴等[16]成功從辣椒內生菌中篩選出1株解淀粉芽孢桿菌SQ6菌株，該菌株對膠孢炭疽菌呈現出明顯的抑制作用。本研究從健康新鮮辣椒中分離獲得了1株內生真菌，經形態(tài)學和分子生物學鑒定，初步確定該真菌為煙管菌，拓寬了辣椒內生菌的種類。內生菌來源不同、種屬不一，所需的營養(yǎng)成分有所不同；其生長的環(huán)境條件不同，導致各內生菌的代謝途徑及產物、功能活性也必然存在差異[6，8，17]。因此，本研究從碳源、氮源、促進劑及pH幾個因素探究了煙管菌 LJ-1生長的最佳條件，發(fā)現該菌生長的最適碳源是蔗糖，能夠為其生長提供充足的能量來源；最適氮源為酵母膏，為其生命活動提供關鍵的營養(yǎng)支持；最適促進劑是油酸，可有效促進其生長發(fā)育；最適 pH為6.0～8.0，在此條件下，其能夠良好地生長繁殖。

綜上，本研究通過菌株的分離純化與鑒定，成功從辣椒上分離獲得了1株內生真菌，命名為煙管菌LJ-1；該菌的最適碳源、氮源和促進劑分別為蔗糖、酵母膏和油酸，最適pH為6.0～8.0。研究結果為辣椒內生菌煙管菌的深入研究提供了參考，也為進一步探索其生物學特性和應用價值奠定了基礎。

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（責任編輯：胡立萍）