清營顆粒對大鼠的亞慢性毒性評價*

張瑜，劉月月，楊鵬，李克鑫，殷斌，趙增成，林樹乾

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，山東 濟南 250100；2.動物保健品山東省工程研究中心，山東 濟南 250100；3.山東森康三峰生物有限公司，山東 濟南 250023；4.山東鑫谷健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 濱州 256600）

清營湯出自清代著名溫病學家吳鞠通的《溫病條辨》[1]，該方在人醫(yī)臨床中應用廣泛[2-9]，在寵物臨床中也有報道[10]，主要功效為清營透熱，養(yǎng)陰活血。方中犀角（現(xiàn)用水牛角代之）可入營分，清解營分熱毒，為君藥；熱灼營陰，生地黃、麥冬、玄參共用既可清熱養(yǎng)陰生津，又可助君藥清營涼血解毒，共為臣藥；銀花、竹葉、連翹清熱解毒、輕清透泄，清解轉(zhuǎn)出之氣熱，因勢利導，使營分熱邪有外達之機，是“透熱轉(zhuǎn)氣”的重要體現(xiàn)；黃連清心瀉熱解毒，丹參涼血散瘀，防止血與熱結(jié)，同為佐藥。諸藥合用，清營養(yǎng)陰，使營分之邪熱轉(zhuǎn)出氣分而解，為治療營分證之主方[11]。據(jù)現(xiàn)代藥效學及臨床應用研究[12]表明，清營湯具有明顯的解熱、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用，在一定程度上可改善血液流變、心肌損害。在獸醫(yī)臨床方面，研究發(fā)現(xiàn)清營口服液對雞的大腸桿菌病[13]和流感病毒病[14]均具有較好的療效。為了更好地開發(fā)清營湯，本試驗將其改為顆粒劑，選用SD大鼠為研究對象，評估較長期攝入清營顆粒對大鼠的亞慢性毒性作用，為新藥研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

受試物清營顆粒，批號20220301，棕褐色顆粒，由山東德州神牛藥業(yè)有限公司提供，每1 g 產(chǎn)品含原生藥品1 g。

1.2 試驗動物

SPF 級5～6 周齡SD 大鼠80 只（雌雄各半），雄性大鼠體重為110.2～129.2 g，雌性大鼠體重為96.6～128.3 g，均由三峽大學實驗動物中心提供 [生產(chǎn)許可證號為SCXK（鄂）2022-0012]。

1.3 主要試劑

獸用血細胞分析用稀釋液、LH 溶血劑、Diff溶血劑及肌酐（Crea）、葡萄糖（Glu）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TCHO）、尿素（Urea）、總蛋白（TP）檢測試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.4 主要儀器

雙扉脈動真空蒸汽滅菌器（YMQ 型）購自連云港佑源醫(yī)藥設備制造有限公司。電子天平（SQP型）購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。全自動生化分析儀（BS-240 型）購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。組織脫水機（TP1020型）、組織包埋機（EG1105A 型）、石蠟切片機（RM2235 型）及染封一體機（ST5010/5020 型）均購自德國徠卡公司。正置顯微鏡（DS-Fi 型）購自尼康儀器（上海）有限公司。

1.5 試驗設計

將80 只5～6 周齡SPF 級SD 大鼠隨機分為4組，每組20 只（雌雄各半）。4 組為空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，分別灌服0、5、10、20 g/kg 體重的清營顆粒（按原生藥材計），連續(xù)灌服30 d。試驗期間每天觀察大鼠的臨床表現(xiàn)，每6 天稱量一次體重，并計算采食量和飲水量。試驗結(jié)束后，每組選取10 只大鼠（雌雄各半）收集血液和組織樣本用于后續(xù)分析。

1.6 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)環(huán)境要求達到SPF 級別，飲水、飼料符合國家標準（GB 14925、GB 5749、GB 14924.1、GB 14924.2、GB 14924.3）。大鼠飼養(yǎng)于聚丙烯塑料盒中，規(guī)格為423 mm×269 mm×192 mm，每籠飼養(yǎng)同組同性別3 只大鼠，溫度控制在20.0～26.0 ℃，相對濕度控制在40.0%～70.0% ，每日光照12 h，換氣頻率15 次/h，每周更換2 次墊料和籠具，試驗期間大鼠自由采食、飲水及活動。

1.7 檢測指標

1.7.1 臨床觀察 觀察頻率：染毒前1 次，染毒后每天1 次，直至試驗結(jié)束；觀察例數(shù)：染毒前全部大鼠，染毒后所有存活大鼠；觀察方法：每天觀察記錄大鼠的皮毛、眼睛和黏膜、分泌物、排泄物、呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主活動（如流淚、豎毛反應、瞳孔大小、異常呼吸）和行為的改變（如步態(tài)、姿勢、對觸摸的反應、反常行為等），注意有無震顫、驚厥、流涎、腹瀉、昏睡和昏迷癥狀。記錄局部和全身反應。

1.7.2 生長性能測定 染毒期間，每2 d 一次測定所有存活大鼠的體重，每6 d 一次測定采食量和飲水量。

1.7.3 血液指標的測定 試驗結(jié)束時，每組選取10 只大鼠（雌雄各半），禁食12 h 后腹腔注射10 %水合氯醛麻醉，腹主動脈采血獲得全血和血清樣品。血液學指標包括Hg、Ec、Lc、 NL、AL、BL、LM、ML 的數(shù)量；血清生化指標包括ALT、AST、Urea、Cr、Glu、ALB、TP、TCH 和TG。

1.7.4 病理檢查 大體解剖：采血結(jié)束后進行剖檢，稱量主要臟器（包括肝、腎、脾、胃腸、睪丸、肺、心、卵巢、子宮等）重量，計算各臟器的相對重量（臟器重/體重）。對對照組及高劑量組大鼠主要臟器進行組織病理學檢查，若有病變則再對較低劑量組大鼠的相應器官進行檢查，其中肝、腎、脾、胃腸、睪丸及卵巢的組織病理學檢查為必測項目。

1.8 數(shù)據(jù)分析

應用SPSS 18.0 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA），各試驗參數(shù)在方差齊時，用LSD 檢驗作多重比較，方差不齊時，用Dunnett’s 檢驗作多重比較，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床觀察

試驗期間各組大鼠無死亡，精神狀態(tài)良好，采食正常，中、高劑量組個別雄性大鼠偶見大便細軟，其他大鼠大小便良好，未見明顯異常的臨床表現(xiàn)。

2.2 生長性能

2.2.1 周體重和增重率 圖1 為雄性和雌性大鼠周平均體重。由圖1 可知，各組雄性大鼠體重均大于雌性大鼠，符合大鼠正常生長發(fā)育規(guī)律。

圖1 大鼠周平均體重

表1 為大鼠周增重率。由表1 可知，各處理組間雄性大鼠周增重率均無顯著性差異。而與空白組相比，雌性大鼠中劑量組第3 周增重率極顯著提高（P＜0.01）；高劑量組雌性大鼠第2 周增重率顯著降低（P＜0.05），第3 周增重率極顯著升高（P＜0.01）。表明不同劑量的清營顆粒對雄性大鼠的生長無明顯影響，20 g/kg 體重劑量對雌性大鼠個別周期的生長有影響，但無明顯規(guī)律性。

表1 大鼠周增重率 單位：%

2.2.2 采食量和增重耗料比 大鼠各周平均采食量的結(jié)果如表2 所示。與空白組相比，中劑量組雄性大鼠第2、3、4 周采食量顯著降低（P＜0.05），高劑量組雄性大鼠第1～5 周采食量均顯著降低（P＜0.05），中劑量組和高劑量組雌性大鼠第1～5周采食量顯著降低（P＜0.05）。

表2 大鼠各周平均采食量 單位：%

大鼠各周增重耗料比的結(jié)果如表3 所示。與空白組相比，高劑量組雄性大鼠第2、4 周增重耗料極顯著升高（P＜0.01），高劑量組雌性大鼠第2、3 周增重耗料極顯著升高（P＜0.01），而中、低劑量的清營顆粒對大鼠采食量及增重耗料比未產(chǎn)生明顯影響。

表3 大鼠各周增重耗料比 單位：%

2.2.3 飲水量 大鼠各周平均飲水量結(jié)果見表4。各處理組雄性及雌性大鼠間飲水量均無顯著差異。

表4 大鼠各周平均飲水量 單位：mL

2.3 血液學檢查結(jié)果

2.3.1 血常規(guī)檢查結(jié)果 大鼠血常規(guī)各項指標檢測結(jié)果如表5 所示。與空白組相比，低劑量組雄性大鼠各項指標差異不顯著；中劑量組HGB、MCHC、MPV 顯著降低（P＜0.05）；高劑量組MCHC、MPV 顯著降低，PLT 顯著升高（P＜0.05），各處理組間雌性大鼠的各項指標差異不顯著。

表5 大鼠血液學檢測結(jié)果

2.3.2 血液生化檢查結(jié)果 大鼠血清生化各項指標檢測結(jié)果如表6 所示。與空白對照組相比，雄性大鼠低劑量組各指標差異不顯著；中劑量組Glu偏低，AST 偏高，差異顯著（P＜0.05）；高劑量組Glu、TG 偏低，差異顯著（P＜0.05），各處理組間雌性大鼠的各項指標差異不顯著。

表6 大鼠血清生化檢測結(jié)果

由此可見，給予10、20 g/kg 體重劑量的清營顆粒對雄性大鼠的個別血液學及血清生化指標有影響，但是對雌性大鼠無影響。

2.4 器官指數(shù)

大鼠各器官指數(shù)結(jié)果如表7 所示。與空白對照組相比，低、中劑量組雄性和雌性大鼠各器官指數(shù)均差異不顯著，高劑量組胃器官指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；高劑量雌性大鼠心臟器官指數(shù)偏高，差異顯著（P＜0.05）。表明給予20 g/kg 體重的清營顆粒對大鼠的個別器官指數(shù)有一定影響。

表7 大 鼠器官 指數(shù) 單位：g/100g

2.5 組織病理學檢查

2.5.1 大體剖檢 剖檢顯示，各處理組大鼠外觀無明顯病變，呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等無明顯異常，主要臟器如肺臟、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺、胃腸、腦、卵巢、子宮或睪丸、附睪等未見肉眼可觀明顯病變。

2.5.2 組織病理學結(jié)果 組織病理學結(jié)果見圖2。對于雄性和雌性大鼠：各組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝索排列緊密，肝細胞胞核清晰，未見壞死及炎癥細胞；匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)結(jié)構(gòu)正常。各組脾組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理改變，脾小結(jié)結(jié)構(gòu)正常，紅白髓界限清晰，未見細胞壞死。各組腎組織腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管排列緊密，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理改變。各組睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理改變，精原細胞和各級精母細胞梯次排列，細胞形態(tài)規(guī)則，管腔內(nèi)可見大量精細胞。各組胃組織結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯病理改變，黏膜上皮細胞完整，黏膜層內(nèi)胃底腺排列整齊，主細胞、壁細胞間雜排列，未見炎癥細胞。各組腸組織結(jié)構(gòu)正常，視野內(nèi)黏膜層上皮細胞排列整齊緊密，未見脫落；黏膜層結(jié)構(gòu)完整，黏膜下層未見水腫或炎癥。表明給予5、10、20 g/ kg 體重的清營顆粒不會引起大鼠重要組織器官的明顯病變。

圖2 組織病理學結(jié)果

3 小結(jié)

綜上所述，5 g/kg 體重的清營顆粒未對大鼠表現(xiàn)明顯的毒性作用，10、20 g/ kg 體重的清營顆粒對大鼠的采食量及雄性大鼠個別血液指標有一定的影響，20 g/kg 體重的清營顆粒對大鼠個別器官指數(shù)有影響，但均未引起大鼠重要器官的組織病理學顯著變化。因此，清營顆粒的無作用劑量（NOEL）為5 g/kg 體重。