青錢柳根際微生物及其多糖累積的相關(guān)性分析

摘要 ［目的］了解不同產(chǎn)地青錢柳（Cyclocarya paliurus）根際土壤微生物多樣性及其差異，探討青錢柳多糖與其土壤微生物群落的聯(lián)系。［方法］以生長野生青錢柳的5個(gè)地區(qū)（XJC廣西小江村，GTC貴州格頭村，CBC湖南赤坂村，HGZ江西楊家坪林場，YQP湖北鴉丘坪村）的15個(gè)土壤樣品為研究對(duì)象，提取土壤微生物總 DNA，結(jié)合 Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)進(jìn)行研究。［結(jié)果］CBC土樣的細(xì)菌群落多樣性最高，GTC土樣的細(xì)菌群落多樣性最低。GTC土樣的真菌群落多樣性最高，CBC土樣的真菌群落多樣性最低。經(jīng)相關(guān)性分析可知，細(xì)菌Candidatus_Nitrosotalea（奇古菌門的一個(gè)未定菌屬）與真菌隱球酵母屬（Cryptococcus）對(duì)青錢柳中多糖類成分累積存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系。［結(jié)論］野生青錢柳土壤中微生物群落多樣性很豐富，存在大量的微生物類群。青錢柳根際土壤群落組成大部分與青錢柳多糖積累之間相關(guān)性不大，但青錢柳多糖的積累可能與其氮代謝有關(guān)，有望通過調(diào)節(jié)青錢柳氮代謝促進(jìn)其多糖積累。真菌隱球酵母屬（Cryptococcus）的增殖也有益提高其多糖含量。

關(guān)鍵詞 根際微生物；多糖累積；Illumina MiSeq 高通量測序；多樣性；相關(guān)性

中圖分類號(hào) R 284" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2025）04-0149-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.04.031

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Correlation Analysis of Rhizosphere Microorganisms and Polysaccharide Accumulation in Cyclocarya paliurus

CHEN Fei fei^1.2，LI Hong ying^1.2，SUN Ju zhi^1.2 et al

（1.Enshi Tujia amp; Miao Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences，Enshi，Hubei 445000;2.Hubei Selenium Industry Technology Research Institute，Enshi，Hubei 445000）

Abstract ［Objective］To understand the diversity and differences of rhizosphere soil microorganisms in Cyclocarya paliurus from different origins，and to explore the relationship between Cyclocarya paliurus polysaccharides and its soil microbial community.［Method］ 15 soil samples in soil growing Cyclocarya paliurus from five areas （XJC Xiaojiang Village，Guangxi;GTC Getou Village，Guizhou;CBC Chiban Village，Hunan;HGZ Yangjiaping Forest Farm，Jiangxi;YQP Yaqiuping Village，Hubei） were selected as the research objects.Total DNA of soil microorganisms was extracted and studied using Illumina MiSeq high throughput sequencing technology.［Result］The bacterial community diversity was the highest in CBC soil samples，and the lowest in GTC soil samples.The fungal community diversity was the highest in GTC soil samples，while the lowest in CBC soil samples.According to the correlation analysis，there was an extremely significant positive correlation between the bacterial Candidatus Nitrosotalea （an undetermined genus of thaumarchaeota） and the fungal Cryptococcus on the accumulation of polysaccharide components in Cyclocarya paliurus.［Conclusion］The diversity of microbial communities in the soil of wild Cyclocarya paliurus was very rich.There was little correlation between the composition of soil bacterial communities in the rhizosphere and the accumulation of polysaccharides.However，the polysaccharide accumulation maybe related to its nitrogen metabolism，which was expected to promote the accumulation of polysaccharides by regulating the nitrogen metabolism of Cyclocarya paliurus.The proliferation of Cryptococcus also was beneficial to increase its polysaccharide content.

Key words Rhizosphere microorganisms;Polysaccharide accumulation;Illumina MiSeq high throughput sequencing;Diversity;Correlation

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560579）；湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022BBA0059）；恩施州科技計(jì)劃項(xiàng)目（D20230067）。

作者簡介 陳菲菲（1988—），女，湖北恩施人，助理研究員，碩士，從事微生物學(xué)研究。*通信作者，農(nóng)藝師，從事微生物學(xué)研究。

收稿日期 2024-04-19

青錢柳常生長在海拔500～2 500 m的多云多霧的森林之中，是我國南方特有的藥食同源植物，具有降血糖、降血壓、提高免疫力等功效^［1］。青錢柳在醫(yī)學(xué)界被稱為“天然胰島素”，被美國FDA認(rèn)可^［2］，但其成分復(fù)雜，有效成分更是難以分析。

近年來，關(guān)于青錢柳的研究越來越多。李磊等^［3］研究發(fā)現(xiàn)青錢柳葉富含有胰島素樣作用的微量元素，尤其適合糖尿病人飲用。易醒等^［4-5］研究發(fā)現(xiàn)青錢柳提取物能有效降低實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型小鼠的餐后血糖，且分析其主要降糖成分為多糖類^［6］、甾體類化合物及內(nèi)酯成分^［7］。有學(xué)者認(rèn)為，青錢柳能夠降低血糖，可能是因?yàn)樗械墓δ苄猿煞帜軌蚧謴?fù)已病變胰島細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能^［8］。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖是青錢柳起降糖作用的主要活性成分之一^［9-11］。Xie等^［10］研究發(fā)現(xiàn)青錢柳水提物能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性^［10］；王曉敏等^［11］研究發(fā)現(xiàn)青錢柳水提物能夠保護(hù)胰腺細(xì)胞，從而達(dá)到降糖的目的；Ning等^［12］從青錢柳提取物中篩選出了11個(gè)α-葡萄糖苷酶的潛在抑制劑，發(fā)現(xiàn)大部分這些潛在抑制劑與活性位點(diǎn)的結(jié)合作用強(qiáng)于阿卡波糖，從而抑制效果也更好。

綜上所述，此前針對(duì)青錢柳的研究主要圍繞其降糖成分和降糖機(jī)理方面，對(duì)其生長環(huán)境的根際微生物群落與其成分積累的相關(guān)性少有研究。因此，該研究以生長野生青錢柳（Cyclocarya paliurus）的5個(gè)地區(qū)（廣西桂林龍勝各族自治縣平等鄉(xiāng)小江村、貴州省黔東南苗族侗族自治州雷山縣方祥鄉(xiāng)格頭村、湖南省懷化市綏寧縣黃桑坪苗族鄉(xiāng)赤坂村、江西省九江市修水縣黃港鎮(zhèn)柘坑村楊家坪林場、湖北省恩施市屯堡鄉(xiāng)鴉丘坪村）的15個(gè)土壤樣品為材料，分析野生青錢柳根際微生物群落與其多糖積累的相關(guān)性，以期為青錢柳的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域

從自然生長青錢柳的5個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行采樣，即廣西桂林龍勝各族自治縣平等鄉(xiāng)小江村（XJC）、貴州省黔東南苗族侗族自治州雷山縣方祥鄉(xiāng)格頭村（GTC）、湖南省懷化市綏寧縣黃桑坪苗族鄉(xiāng)赤坂村（CBC）、江西省九江市修水縣黃港鎮(zhèn)柘坑村楊家坪林場（HGZ）、湖北省恩施市屯堡鄉(xiāng)鴉丘坪村（YQP），采樣點(diǎn)基本信息詳見表1。

1.2 樣品采集

每個(gè)采樣點(diǎn)采集3～5株生長良好的青錢柳的根際土壤50～100 g，樣品保存于滅菌的密封袋中，在-80 ℃下保存，備用。

1.3 儀器與設(shè)備

土壤DNA提取試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；凝膠成像儀，美國伯樂生物科技公司；核酸蛋白濃度測定儀Nanodrop One，賽默飛世爾科技公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；H-1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 土壤總DNA的提取及PCR擴(kuò)增。采用土壤DNA提取試劑盒提取樣品基因組DNA，并用核酸蛋白濃度測定儀Nanodrop One測定其濃度。將每個(gè)樣品按照下述引物及反應(yīng)體系配制好，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后混合每個(gè)樣品的3個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行凝膠電泳（1%瓊脂糖、120 V、30 min）試驗(yàn)。

引物：①擴(kuò)增土壤微生物16S rRNA 基因V4V5區(qū)引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和907R （5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTT-3′）；②擴(kuò)增ITS1區(qū)引物ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4-R （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

50 μL 16S rRNA 基因V4V5區(qū)PCR反應(yīng)體系：引物515F（20 ng/μL）1 μL，引物907R （20 ng/μL）1 μL，2× Premix Taq 25 μL，模板（20 ng/μL）3 μL，滅菌超純水20 μL。

50 μL ITS1區(qū)PCR反應(yīng)體系：引物ITS5-1737F（20 ng/μL）1 μL，引物ITS4-R（20 ng/μL））1 μL，2× Premix Taq 25 μL，模板（20 ng/μL）3 μL，滅菌超純水20 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保持。

1.4.2 測序及分析。

將擴(kuò)增后的產(chǎn)物樣品送往武漢中圣泰克生物科技有限公司進(jìn)行測序分析。

1.4.3 多糖的測定。

在每個(gè)采樣點(diǎn)采集15～20株生長良好的青錢柳，按照保健食品功效成分檢測方法（2011版）中多糖檢測方法進(jìn)行檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理

土壤微生物測序結(jié)束之后，所得數(shù)據(jù)及多糖檢測結(jié)果均用Excel 2016軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理分析，用OriginPro 2021軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU 聚類分析序列統(tǒng)計(jì)及多樣性分析

該試驗(yàn)選取 5 個(gè)地區(qū)的野生青錢柳的根際土壤進(jìn)行測定。細(xì)菌基因序列測定結(jié)果（表2）顯示，共獲得122 984條有效序列數(shù)，XJC、GTC、CBC、HGZ、YQP所含OTU數(shù)分別為1 823、1 783、1 784、2 331、2 557；不同組別的土壤中Shannon指數(shù)從高到低依次為CBCgt;YQPgt;XJCgt;HGZgt;GTC，說明CBC土樣的細(xì)菌群落多樣性最高，GTC土樣的細(xì)菌群落多樣性最低，即CBC土樣的細(xì)菌類群最豐富，GTC土樣的細(xì)菌類群最少。真菌基因序列測定結(jié)果（表3）顯示，共獲得217 558條有效序列數(shù)，XJC、GTC、CBC、HGZ、YQP所含OTU數(shù)分別為823、1 308、366、1 089、1 312；不同組別的土壤中Shannon指數(shù)從高到低依次為GTCgt;YQPgt;XJCgt;HGZgt;CBC，說明GTC土樣的真菌類群最豐富，CBC土樣的真菌類群最少。

5個(gè)樣品的細(xì)菌、真菌Shannon 指數(shù)及覆蓋率的分析結(jié)果（表2、表3和圖1b）表明，5個(gè)樣品中大部分微生物類群已完成測序，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析。

從圖2可以看出，5個(gè)區(qū)域土壤樣品高通量測序后共獲得14個(gè)門和未確定類群，且5個(gè)區(qū)域土壤樣品均有14門的微生物。

在這些土壤中占優(yōu)勢的菌門及其相對(duì)豐度分別為酸桿菌門（Acidobacteria，24.81%～36.13%）、變形菌門（Proteobacteria，25.13%～32.82%）、浮霉菌門（Planctomycetes，6.88%～10.57%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，4.77%～8.97%）。且5個(gè)區(qū)域的土樣中占優(yōu)勢的菌門均是酸桿菌門、變形菌門；XJC組土樣、 GTC組土樣、YQP組土樣中酸桿菌門所占比例高于變形菌門，而CBC組土樣、HGZ組土樣中變形菌門所占比例高于酸桿菌門。

5個(gè)區(qū)域土壤樣品高通量測序后共獲得887個(gè)菌屬。如圖3所示，優(yōu)勢類群為一未能分類的細(xì)菌屬，隨后依次為酸桿菌屬（Acidibacter，0.91%～5.20%）、熱酸菌屬（Acidothermus，0.32%～2.94%）、鞘氨醇單胞菌屬（Bryobacter，1.84%～2.82%）、黃桿菌屬（Flavobacterium，0.11%～2.41%）。

2.2.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析。

從圖4可以看出，5個(gè)區(qū)域土壤樣品高通量測序后共獲得6個(gè)門和未確定類群，且5個(gè)區(qū)域土壤樣品均有6個(gè)門的微生物。6個(gè)門及其相對(duì)豐度分別為纖毛屬菌門（Ciliophora，0.05%～1.21%）、子囊菌門（Ascomycota，37.07%～55.72%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota，17.95%～35.76%）、壺菌門（Chytridiomycota，0.11%～1.25%）、羅澤洛菌塔門（Rozellomycota，0.06%～5.41%）、接合菌門（Zygomycota，1.25%～18.50%）。且5個(gè)區(qū)域的土樣中占優(yōu)勢的菌門均是子囊菌門、擔(dān)子菌門。

5個(gè)區(qū)域土壤樣品高通量測序后共獲得653個(gè)菌屬。如圖5所示，優(yōu)勢類群為葉杯菌屬（Ciborinia，0.58%～35.54%）、牛肝菌屬（Boletus，0.09%～14.58%）、孢霉屬（Mortierella，0.09%～13.06%）、濕傘屬（Hygrocybe，0.10%～11.68%）、絲瑚菌屬（Aphanobasidium，0.06%～11.28%）、古根菌屬（Archaeorhizomyces，0.10%～9.67%）。

2.3 多糖含量測定結(jié)果

依據(jù)保健食品功效成分檢測方法（2011版）測定青錢柳多糖的含量，結(jié)果表明（圖6），YQP（湖北鴉丘坪村）組青錢柳中多糖含量高于其他組，且與XJC（廣西小江村）組、GTC（貴州格頭村）組差異不顯著，與CBC（湖南赤坂村）組、HGZ（江西楊家坪林場）組差異顯著。由此可知，不同地區(qū)青錢柳樣本中的多糖含量有很大差異，這可能與它們所處的生存環(huán)境有關(guān)。

2.4 不同地區(qū)青錢柳多糖含量聚類分析

為了研究不同地區(qū)青錢柳多糖含量的相似性，利用SPSS 19.0系統(tǒng)軟件中的系統(tǒng)聚類法，對(duì)5個(gè)不同地區(qū)青錢柳的多糖含量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，5個(gè)青錢柳產(chǎn)地分為三大類， 其中YQP樣本中多糖含量與其他幾個(gè)地方距離較遠(yuǎn)，為一類；而CBC組、HGZ組樣本質(zhì)量相似性最高，為一類；XJC組、GTC組為一類。以CBC（湖南赤坂村）樣本為基準(zhǔn)點(diǎn)，其距離由近及遠(yuǎn)依次為HGZ（江西楊家坪林場）、 XJC（廣西小江村）、GTC（貴州格頭村）、YQP（湖北鴉丘坪村）。

2.5 不同地區(qū)青錢柳根際土壤微生物群落與其多糖含量的相關(guān)性分析

2.5.1 細(xì)菌群落與其多糖含量的相關(guān)性分析。

為了進(jìn)一步分析青錢柳根際微生物與青錢柳多糖含量的相關(guān)性，利用皮爾森相關(guān)性分析青錢柳屬水平的細(xì)菌與其多糖含量的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4），大部分細(xì)菌類群與多糖含量的相關(guān)性不大，但Candidatus_Nitrosotalea（奇古菌門的一個(gè)未定菌屬）與其多糖含量呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01）。這些結(jié)果表明，青錢柳根際土壤細(xì)菌群落組成與青錢柳多糖積累之間存在一

定相關(guān)性。

2.5.2 真菌群落與其多糖含量的相關(guān)性分析。

為了進(jìn)一步分析青錢柳根際微生物與青錢柳多糖含量的相關(guān)性，利用皮爾森相關(guān)性分析青錢柳屬水平的真菌與其多糖含量的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表5），真菌中隱球酵母屬（Cryptococcus）對(duì)青錢柳中多糖類成分累積存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01），說明隱球酵母屬可能是青錢柳潛在的促生微生物。

3 討論與結(jié)論

在植物的根上聚居著各種微生物，形成了一個(gè)特殊的微生態(tài)環(huán)境——植物根際微生物。植物根系的生長發(fā)育直接影響這些微生物的生長、分布和繁殖，對(duì)植物有效成分累積有重要作用^［13-15］。路哲^［16］研究不同土壤環(huán)境華細(xì)辛根際微生物群落與其揮發(fā)油組分間的關(guān)系，利用DGGE技術(shù)探索華細(xì)辛揮發(fā)油各主要組分積累與細(xì)菌群落的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者之間關(guān)系較為密切。謝巧妮^［17］利用高通量測序技術(shù)研究烏頭生長過程中根際土壤微生物群落與植物體有效成分變化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)烏頭有效成分中新烏頭堿（MA）、烏頭堿（AC）、次烏頭堿（HA）的含量均與根際土壤微生物生物量碳（MBC）呈負(fù)相關(guān)，MBC含量的增加會(huì)抑制這幾種有效成分的積累；與前3種有效成分不同，苯甲醜新烏頭堿（BMA）與根際土壤MBC呈正相關(guān)。越來越多的學(xué)者運(yùn)用高通量測序技術(shù)研究根際微生物與植物有效成分含量的相關(guān)性，它能夠?qū)颖镜目侱NA逐一測序^［18］，從而分析出樣本中微生物群落的多樣性和復(fù)雜性^［19-21］。隨著研究的深入，學(xué)者們對(duì)微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)、功能以及影響有了更多、更深入的了解^［22-23］。很多學(xué)者陸續(xù)研究了包括黃芩、青蒿、羊蹄、銀杏等在內(nèi)的藥食原料^［24-27］。童炳麗^［28］研究了米槁根際微生物與其活性成分積累的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了與米槁果實(shí)4種藥用成分呈明顯的正相關(guān)關(guān)系的菌屬。李巧玲等^［29］研究發(fā)現(xiàn)箭葉淫羊藿根際微生物與土壤理化性質(zhì)及酶活性一起參與調(diào)控有效成分的合成與積累。

該試驗(yàn)研究了5個(gè)不同區(qū)域青錢柳根際微生物及其與多糖含量的相關(guān)性，結(jié)果表明，大部分微生物類群與多糖含量的相關(guān)性不大，但細(xì)菌菌屬Candidatus_Nitrosotalea（奇古菌門的一個(gè)未定菌屬）與其多糖含量呈極顯著正相關(guān)。氨氧化古菌（Ammonia oxidizing archaea，AOA）屬于奇古菌門 （Thaumarchaeota）^［30］，包括 Nitrososphaera、Nitrosopumilus、Nitrosotalea、Nitrosocaldus、Nitrososphaera 共5個(gè)屬^［31-32］，它們?cè)谌虻h(huán)中氧化氨氮成亞硝酸鹽起關(guān)鍵性作用^［33］。因此，青錢柳多糖的積累可能與其氮代謝有關(guān)。眾所周知，氮素是促進(jìn)植物生長的重要營養(yǎng)元素，對(duì)保障農(nóng)作物高產(chǎn)極為關(guān)鍵。而植物生長的直觀體現(xiàn)為生物量的積累。植物吸收氮素后通過氮同化等一系列代謝過程，生成核酸、蛋白等大量功能元件以滿足光合作用及生長所需。光合作用固定CO 2生成碳水化合物，其中70%以上轉(zhuǎn)化為纖維素等結(jié)構(gòu)，多糖用于植物體自身的生長發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)氮素吸收與利用等生理過程。Gao等^［34］利用正向遺傳學(xué)手段將水稻中控制纖維素水平的QTL-qCel1與氮利用效率的QTL-qNLA1共定位，并通過基因克隆將其確定為同一個(gè)基因，即轉(zhuǎn)錄因子均為MYB61，發(fā)現(xiàn)纖維素調(diào)控因子可促進(jìn)氮利用，并揭示了相關(guān)的分子機(jī)制。同時(shí)，真菌菌屬與多糖含量的相關(guān)性分析表明，隱球酵母屬（Cryptococcus）對(duì)青錢柳中多糖類成分累積存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系。隱球酵母屬（Cryptococcus）的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一些胞內(nèi)儲(chǔ)存物，有效抑制細(xì)胞壁代謝酶活性，延緩細(xì)胞壁多糖降解，從而提高多糖含量^［35-36］。

綜上所述，通過該研究初步發(fā)現(xiàn)青錢柳多糖積累與在氮代謝中起重要作用的氨氧化古菌呈正相關(guān)，下一步可通過人工接菌試驗(yàn)來證明，或者通過直接調(diào)節(jié)青錢柳氮代謝關(guān)鍵因子來觀察其多糖的積累量。對(duì)于青錢柳本身生長環(huán)境和根際微生物對(duì)其生長及其有效成分積累的影響均可進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，以期可以通過改變其土壤生態(tài)因子來影響其生長或有效成分的積累。

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