CLIC1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究

【摘要】 目的 研究CLIC1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞系U251、T98凋亡的影響。方法 根據(jù)癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析CLIC1相關(guān)臨床表達(dá)差異、生存曲線等。設(shè)計(jì)兩條慢病毒序列，穩(wěn)定敲低U251、T98細(xì)胞系中CLIC1表達(dá)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)估對(duì)照組、敲低組GBM細(xì)胞增殖能力。使用流式檢測(cè)對(duì)照組、敲低組細(xì)胞凋亡率。使用免疫熒光、Western Blot檢測(cè)對(duì)照組、敲低組凋亡相關(guān)蛋白變化。裸鼠異種移植模型建立，觀察CLIC1對(duì)裸鼠顱內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響、腫瘤大小、凋亡及增殖蛋白染色強(qiáng)度，Western Blot檢測(cè)鼠腦凋亡蛋白表達(dá)量。結(jié)果 泛癌分析表明，CLIC1在廣泛腫瘤中較正常組織高表達(dá)，包括膠質(zhì)瘤，且在膠質(zhì)瘤中CLIC1表達(dá)隨級(jí)別呈遞增趨勢(shì)，高表達(dá)CLIC1的患者整體生存期縮短。敲低CLIC1可抑制GBM細(xì)胞克隆形成，降低細(xì)胞活力，且能增加GBM細(xì)胞系凋亡率，增加凋亡蛋白BAX、Cleaved-Caspase3表達(dá)，減少抗凋亡蛋白BCL2表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CLIC1在維持腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。結(jié)論 敲低CLIC1可抑制GBM細(xì)胞增殖，促進(jìn)GBM細(xì)胞凋亡和延緩顱內(nèi)進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；氯離子胞內(nèi)通道 1；細(xì)胞凋亡

【中圖分類號(hào)】 R739.41" 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A" 【文章編號(hào)】 1672-7770（2025）01-0047-08

Experimental study on the effect of CLIC1 on apoptosis in glioblastoma cell lines

Abstract： Objective To investigate the effect of CLIC1 on apoptosis in glioblastoma（GBM） cell lines U251 and T98. Methods The clinical expression differences and survival curves related to CLIC1 were analyzed using data from The Cancer Genome Atlas（TCGA） database. Two lentiviral sequences were designed to stably knock down CLIC1 expression in U251 and T98 cell lines. A plate clone formation assay and CCK-8 cell proliferation assay were conducted to evaluate the proliferation ability of GBM cells in control and knockdown groups. The apoptosis rate in these groups was assessed via flow cytometry. Immunofluorescence and Western blotting were employed to detect changes in apoptosis-related protein expression. A nude mouse xenograft model was established to study the impact of CLIC1 on intracranial tumor growth. The tumor size， the intensity of apoptotic and proliferative protein expression were observed. Western blotting was used to detect apoptotic protein expression in the mouse brain." Results Pan-cancer analysis revealed that CLIC1 was significantly overexpressed in various tumors， including gliomas， compared to normal tissues. In gliomas， CLIC1 expression increased with tumor grade， and high CLIC1 expression correlated with shorter overall survival in patients. Knockdown of CLIC1 inhibited GBM cell clone formation， reduced cell viability， and increased the apoptosis rate. Additionally， knockdown enhanced the" expression of pro-apoptotic proteins BAX and Cleaved-Caspase3， while decreasing the anti-apoptotic protein BCL2. In vivo experiments demonstrated that CLIC1 played a critical role in sustaining tumor"progression. Conclusions Knockdown of CLIC1 inhibits GBM cell proliferation， promotes GBM cell apoptosis， and delays intracranial progression.

Key words： glioblastoma; CLIC1; cell apoptosis

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，大約每10萬(wàn)人中有4人患病，可占全部原發(fā)惡性中樞系統(tǒng)腫瘤的50%［1］。GBM具有高病死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率，GBM患者目前采用的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是以手術(shù)治療為主，術(shù)后輔以放化療［2］。目前最常用的化療方案是熟知的Stupp方案，但是對(duì)于O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）未甲基化的GBM患者，整體生存率并沒(méi)有明顯的延長(zhǎng)［1］。目前，正在積極尋找更加有效的化療藥物來(lái)延長(zhǎng)患者生存期。胞內(nèi)氯離子通道1（chlo-ride intracellular channel 1，CLIC1）是豐富的細(xì)胞內(nèi)陰離子通道蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)多種功能，包括膜電位調(diào)節(jié)、細(xì)胞體積穩(wěn)態(tài)、鹽酸分泌和攝取的控制等［3］。現(xiàn)有研究表明，CLIC1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤侵襲遷移等［45］，CLIC1對(duì)GBM細(xì)胞凋亡的影響研究尚少，本文主要研究CLIC1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響，為日后靶向化療藥物的研究提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)樣本分析 從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.com） 獲得了33種腫瘤的RNAseq數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息。使用R軟件V4.0.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。秩和檢驗(yàn)檢測(cè)兩組數(shù)據(jù)的差異，Plt;0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 生存分析 從TCGA數(shù)據(jù)集（https：//portal.gdc.com）獲得膠質(zhì)瘤的RNAseq數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息。GTEx數(shù)據(jù)來(lái)自V8版本（https：//gtexportal.org/home/datasets）。使用R軟件v4.0.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Plt;0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 基因集富集分析 為了探索CLIC1潛在的生物學(xué)功能，針對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤樣本CLIC1的表達(dá)水平，分為CLIC1高表達(dá)、低表達(dá)組，并對(duì)所有CLIC1差異基因進(jìn)行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。

1.4 研究對(duì)象 GBM細(xì)胞系U251、T98購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，液氮凍存。CLIC1、BAX、BCL2、Cleaved-Caspase3、內(nèi)參Tubulin和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG以及山羊抗兔IgG抗體均購(gòu)買于美國(guó)CST公司。DMEM培養(yǎng)基和Hyclone胎牛血清購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將不同分組的U251、T98細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)，將600個(gè)細(xì)胞鋪于6孔板中，每組至少重復(fù)三遍，每孔加入2 mL培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)2周，每隔3天更換一次培養(yǎng)基。2周后，棄上清液，4%細(xì)胞多聚甲醛固定30 min后，結(jié)晶紫染色5～10 min。拍照獲取圖像，Image J定量分析。

1.6 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將3 000個(gè)U251、T98細(xì)胞接種在96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入10% CCK8試劑，充分混勻，避光孵育2 h，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量每個(gè)孔的光密度（optical density，OD）值，根據(jù)吸光度值的變化來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng) 采用10%的胎牛血清于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)U251、T98細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右，棄上清液，使用細(xì)胞磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）輕輕緩慢沖洗培養(yǎng)皿中殘留血清，然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞5 min，加入等量10%FBS完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞于離心管中離心、重懸傳代。

1.8 慢病毒轉(zhuǎn)染 由吉?jiǎng)P基因設(shè)計(jì)并構(gòu)建的shRNA慢病毒，序列：shCLIC1#1∶5′CUUCAAUGU-UACCACCGUU-3′；shCLIC1#2∶5′GUGGAUGAA-ACCAGUGCUG-3′將適量慢病毒加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中過(guò)夜，用0.5%嘌呤霉素（Puromycin）進(jìn)行篩選，待細(xì)胞篩選穩(wěn)定后，Western Blot檢測(cè)其敲低效率。

1.9 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 提取不同處理組的細(xì)胞總蛋白，離心后獲取上清液。使用BCA比色法測(cè)定蛋白濃度，并配置成相同濃度后，加入上樣緩沖液，混勻，在100 ℃下變性5 min。設(shè)置電壓為70 V進(jìn)行電泳，待上層膠分離后，將電壓增加至140 V直至電泳結(jié)束。在冰浴條件下，以恒定電流350 mA轉(zhuǎn)膜45～90 min。轉(zhuǎn)膜后，將膜置于5％牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉液中，室溫下在慢搖床上封閉1 h。加入稀釋比例為1∶2 000的對(duì)應(yīng)抗體（兔抗Tubulin、兔抗BAX、兔抗Cleaved-Caspase3、兔抗CLIC1、鼠抗BCL2），在4 ℃下緩慢孵育過(guò)夜（至少8 h）。隨后在快搖床上洗滌3次，每次5～10 min。再加入相應(yīng)二抗，室溫下在慢搖床上孵育1 h，再次洗滌3次后顯影，并使用軟件進(jìn)行量化分析。

1.10 免疫熒光染色檢測(cè)BCL2、Cleaved-Caspase3的表達(dá) 將賴氨酸包被的無(wú)菌玻片置于12孔板底部，加入適量處理組的U251和T98細(xì)胞，充分混勻后培養(yǎng)至貼壁。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約70%融合度時(shí)，棄去上清液，使用PBS緩沖液洗滌3次。隨后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞25 min，再用0.5% Triton X-100進(jìn)行15 min穿膜處理，隨后再用PBS洗滌3次。接著加入3%BSA，在室溫下封閉1 h。棄去上清液，洗滌3次后待玻片干燥，加入稀釋后的抗體：小鼠抗人BCL2（1∶200）和兔抗人Cleaved-Caspase3（1∶200），在4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜（至少8 h）。之后，用PBS洗滌3次，每次5 min。再加入熒光標(biāo)記的二抗（山羊抗兔1∶200，山羊抗小鼠1∶200），室溫避光條件下孵育1 h。最后，用DAPI溶液染色細(xì)胞核，避光條件下使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.11 流式凋亡檢測(cè) 使用適量胰蛋白酶消化不同處理組的U251和T98細(xì)胞，離心收集后用PBS清洗3次。加入100 μL檢測(cè)緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入10 μL FITC標(biāo)記的Annexin-V和5 μL PI，避光反應(yīng)10 min后，再加入400 μL檢測(cè)緩沖液，并在15 min內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.12 染色 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin eosin，HE）時(shí)，將鼠腦進(jìn)行固定，石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染色，伊紅染色，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色時(shí)，準(zhǔn)備石蠟組織切片，首先對(duì)切片進(jìn)行去蠟和水化，將切片浸泡在二甲苯中以去除石蠟，再通過(guò)不同濃度的乙醇進(jìn)行水化，最后用蒸餾水清洗。接著，通過(guò)熱修復(fù)或酶修復(fù)處理切片，暴露抗原位點(diǎn)。然后，用過(guò)氧化氫溶液處理切片，抑制內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶活性，并使用封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。隨即，將切片與稀釋的一抗孵育，通常在4 ℃過(guò)夜或室溫孵育1～2 h，之后用PBS緩沖液洗滌切片以去除未結(jié)合的一抗。接著，將切片與稀釋的二抗孵育，通常在室溫下孵育30～60 min，隨后再次用PBS洗滌切片。染色反應(yīng)通過(guò)加入DAB顯色底物完成，目標(biāo)抗原在切片中形成棕色沉淀，顯色時(shí)間需嚴(yán)格控制，以免過(guò)度染色。染色結(jié)束后，用蘇木精進(jìn)行對(duì)比染色，隨后依次通過(guò)不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水，并用二甲苯透明化。最后，使用封片劑將切片封片，待固化后在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，分析目標(biāo)抗原的表達(dá)情況。

1.13 裸鼠顱內(nèi)成瘤 將轉(zhuǎn)有熒光病毒的CLIC1敲低和未敲低的U251細(xì)胞進(jìn)行裸鼠顱內(nèi)原位移植，分別在第7、14、28天進(jìn)行小動(dòng)物活體成像分析，觀察腫瘤進(jìn)展，待裸鼠自然死亡后，繪制生存曲線，取出鼠腦固定，切片，進(jìn)行HE、IHC染色，觀察腫瘤大小及凋亡相關(guān)蛋白染色強(qiáng)度，并研磨敲低組和未敲低組鼠腦組織，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Image J軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的WB數(shù)據(jù)進(jìn)行量化，并用GraphPad Prism9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 CLIC1泛癌分析 對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中33例癌癥樣本中所采集的數(shù)據(jù)分析顯示，以TCGA+GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)正常的對(duì)應(yīng)組織做對(duì)照，除了急性髓細(xì)胞樣白血?。╝cute myeloid leukemia-like，LAML）、惡性間皮瘤（malignant mesothelioma，MESO）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（pheochromocytoma and paraganglioma，PCPG）、肉瘤樣肺癌（sarcoma like lung cancer，SARC）、胸腺癌（thymic carcinoma，THYM）、葡萄膜惡性黑色素瘤（uveal melanoma，UVM）外，CLIC1在其他腫瘤的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。在GBM中，CLIC1的表達(dá)明顯高于正常腦組織（P＜0.000 1），表明CLIC1可能參與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展（圖1）。

2.2 CLIC1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及生存分析 對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中采集膠質(zhì)瘤相關(guān)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，CLIC1在膠質(zhì)瘤各級(jí)別中表達(dá)量均高于正常腦組織，且在膠質(zhì)瘤中CLIC1表達(dá)量隨著級(jí)別呈遞增趨勢(shì)（圖2A）。生存分析表明，在膠質(zhì)瘤患者中，高表達(dá)CLIC1的患者中位生存期呈明顯下降趨勢(shì)（圖2B）。

2.3 敲低CLIC1對(duì)GBM細(xì)胞增殖能力的影響為了研究CLIC1對(duì)GBM細(xì)胞增殖能力的影響，設(shè)計(jì)了兩條慢病毒序列。Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其敲低效率（圖3A），平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，U251、T98細(xì)胞在六孔板中培養(yǎng)14 d后，細(xì)胞增殖能力明顯高于sh-1、sh-2組（圖3B），CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，敲低組U251、T98細(xì)胞增殖曲線較未敲低組平坦，同樣說(shuō)明了敲低組細(xì)胞增殖能力下降（圖3C）。這表明，下調(diào)CLIC1表達(dá)可抑制GBM細(xì)胞增殖能力。

2.4 CLIC1對(duì)GBM細(xì)胞凋亡的影響 本研究通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出與CLIC1高度相關(guān)的3 249個(gè)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），其中1 915個(gè)上調(diào)基因、1 334個(gè)下調(diào)基因（圖4A），然后對(duì)CLIC1差異表達(dá)基因進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤中的CLIC1相關(guān)基因在凋亡通路中富集（圖4B）。為了進(jìn)一步證明CLIC1參與GBM細(xì)胞凋亡，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組和敲低組GBM細(xì)胞凋亡率的變化，結(jié)果表明，敲低組的GBM細(xì)胞凋亡率明顯增加（圖4C）。本研究用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，結(jié)果表明敲低組的凋亡蛋白Cleaved-Caspase3熒光強(qiáng)度增加，而抗凋亡蛋白BCL2熒光強(qiáng)度下降（圖4D）。這表明，敲低組的GBM細(xì)胞發(fā)生了促凋亡作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，本研究對(duì)不同處理組的細(xì)胞進(jìn)行凋亡相關(guān)蛋白免疫印跡分析，并進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，促凋亡蛋白BAX、Cleaved-Caspase3增加，抗凋亡蛋白BCL2減少（圖4E）。以上表明，CLIC1敲低促進(jìn)了GBM細(xì)胞系U251、T98發(fā)生了凋亡。

2.5 CLIC1對(duì)裸鼠顱內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響 為了驗(yàn)證CLIC1對(duì)裸鼠顱內(nèi)成瘤的影響，本研究將轉(zhuǎn)有熒光病毒的CLIC1敲低和未敲低的U251細(xì)胞進(jìn)行裸鼠顱內(nèi)原位移植，分別于第7、14、28天進(jìn)行小動(dòng)物活體成像分析，動(dòng)態(tài)觀察腫瘤大小。待裸鼠自然死亡后，取出鼠腦進(jìn)行HE染色觀察腫瘤大小。結(jié)果表明，敲低組裸鼠顱內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)較對(duì)照組緩慢（圖5A），對(duì)熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明從第14天開(kāi)始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5B）。對(duì)小鼠生存時(shí)間繪制生存曲線，結(jié)果表明，敲低組小鼠生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5C）。HE染色結(jié)果表明，敲低組小鼠腫瘤明顯小于對(duì)照組，對(duì)鼠腦切片進(jìn)行IHC染色分析，結(jié)果表明，敲低組促凋亡指標(biāo)Cleaved-Caspase3染色強(qiáng)度增高，抗凋亡指標(biāo)BCL2染色強(qiáng)度降低，增殖指標(biāo)Ki-67染色強(qiáng)度降低（圖5D）。為了進(jìn)一步分析CLIC1對(duì)體內(nèi)腫瘤的凋亡作用，本研究對(duì)裸鼠腦組織進(jìn)行研磨，提取總蛋白進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果顯示，敲低組抗凋亡指標(biāo)BCL2蛋白表達(dá)量下降，促凋亡指標(biāo)BAX、Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)量升高（圖5E），這與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。以上結(jié)果表明，CLIC1參與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。

3 討 論

膠質(zhì)瘤目前的治療方案，仍以手術(shù)為主，術(shù)后輔以放化療［6］。由于替莫唑胺耐藥的原因，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者生存期并沒(méi)有得到較大的延長(zhǎng)［7］?；趯?duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的較好認(rèn)識(shí)和理解，靶向治療已經(jīng)初見(jiàn)成效。目前，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)了近百種具有治療作用的抗體，其中有近1/3可用于癌癥治療［8］。例如，抗VEGF單克隆抗體之一的貝伐單抗，已被廣泛用于膠質(zhì)瘤術(shù)后靶向治療［9］，以及被廣泛用于治療黑色素、肺癌、頭頸癌、霍奇金淋巴瘤和胃癌的人源化抗體pembrolizumab ［1012］。本研究以CLIC1為基礎(chǔ)，研究CLIC1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響，希望建立一個(gè)新的精準(zhǔn)靶點(diǎn)。

CLIC1是由241個(gè)氨基酸構(gòu)成的離子通道蛋白［13］，CLIC1在小腸、胃、膽管、胰腺等人體正常組織中皆有表達(dá)［14］。研究表明，CLIC1可通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路促進(jìn)胃癌進(jìn)展［15］，以及參與胃癌淋巴轉(zhuǎn)移、淋巴浸潤(rùn)等［16］，F(xiàn)eng等［17］證實(shí)了CLIC1可通過(guò)整合素/ERK通路促進(jìn)口腔鱗癌進(jìn)展，Tian等［18］證實(shí)了CLIC1通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移，以及Nong等［19］證實(shí)了CLIC1通過(guò)影響自噬賦予胃癌耐藥性，以上表明CLIC1可通過(guò)影響多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移、自噬等功能參與腫瘤進(jìn)展。最近發(fā)表的一篇多組學(xué)分析表明，CLIC1參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展，抑制CLIC1可誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤凋亡［20］。因此，本文主要針對(duì)CLIC1對(duì)GBM細(xì)胞系凋亡影響展開(kāi)分析。

本研究通過(guò)泛癌分析結(jié)果得出，CLIC1在絕大多數(shù)腫瘤中是高表達(dá)的，其中就包括膠質(zhì)瘤。通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析可知，CLIC1不僅在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，且CLIC1表達(dá)量隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別遞增而增加。生存分析結(jié)果表明，高表達(dá)CLIC1的患者，生存時(shí)間縮短。同時(shí)，GSEA富集分析結(jié)果表明，CLIC1差異相關(guān)基因在凋亡通路中富集?；跀?shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，本研究假設(shè)敲低CLIC1可能會(huì)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞表型。結(jié)果表明，敲低CLIC1可明顯抑制GBM細(xì)胞增殖，通過(guò)流式細(xì)胞凋亡分析、免疫熒光染色以及Western Blot技術(shù)分析可知，敲低CLIC1促進(jìn)GBM細(xì)胞系U251、T98發(fā)生凋亡，并且促進(jìn)了凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved-Caspase3的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白BCL2的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低CLIC1延緩裸鼠顱內(nèi)腫瘤進(jìn)展，且明顯延長(zhǎng)了裸鼠生存時(shí)間，HE染色結(jié)果顯示，敲低組鼠腦腫瘤明顯小于對(duì)照組，IHC染色結(jié)果顯示，敲低組Cleaved-Caspase3染色強(qiáng)度增高，BCL2、Ki-67染色強(qiáng)度降低，對(duì)裸鼠腦組織進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

雖然，本研究的初步結(jié)果證實(shí)了CLIC1參與GBM惡性進(jìn)展的可能，但是針對(duì)CLIC1如何影響GBM細(xì)胞凋亡的具體過(guò)程并沒(méi)有展開(kāi)具體的研究。希望在日后的研究中，能針對(duì)CLIC1影響GBM凋亡的具體過(guò)程展開(kāi)詳細(xì)敘述。

綜上可知，CLIC1在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，參與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展，敲低CLIC1可促進(jìn)GBM細(xì)胞系U251、T98發(fā)生凋亡，延緩進(jìn)展。

［參 "考 ""文 ""獻(xiàn)］

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