膠質母細胞瘤早期復發(fā)和假性進展的癌癥免疫差異表達基因分析及活性化合物預測

【摘要】 目的 對早期復發(fā)和假性進展膠質母細胞瘤的癌癥免疫差異基因進行研究分析并預測活性化合物。方法 在高通量基因表達（GEO）數(shù)據(jù)庫中選擇GSE231994數(shù)據(jù)集作為主要分析對象，篩選二次手術后早期復發(fā)和假性進展病例樣本之間的免疫相關差異基因，進行基因本體論（GO）生物過程（BP）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析，構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，獲得樞紐基因。應用TCMSP計算系統(tǒng)生物學實驗室平臺數(shù)據(jù)庫預測可能有效的活性化合物，并在CB-Dock2服務器進行分子對接實驗。結果GSE231994數(shù)據(jù)集篩選得到140差異表達基因，其中上調基因50個，下調基因90個，其中核心基因有IL1B、IL10、CXCL8、EGFR、TLR2、CD68、CXCR4、ITGB2、CD163和CSF1R，主要參與炎癥反應、信號轉導和免疫反應生物過程，以及富集于癌癥途徑、細胞因子-細胞因子受體相互作用和PI3K/Akt信號通路。根據(jù)度值選取前三個基因，通過TCMSP平臺預測得到槲皮素可能為有效化合物。對接結果顯示槲皮素與IL1B具有更好的結合能力。結論 通過生物信息手段分析揭示免疫表達基因IL1B、IL10和CXCL8與膠質母細胞瘤早期復發(fā)和假性進展有著密切的關系，而槲皮素可作為干預的有效活性化合物。

【關鍵詞】 早期復發(fā)；假性進展；膠質母細胞瘤；生物信息學；差異基因

【中圖分類號】 R739.41" 【文獻標志碼】 A" 【文章編號】 1672-7770（2025）01-0039-08

Analysis of cancer-immune differentially expressed genes and prediction of active compounds in progression and pseudo-progression of glioblastoma

Abstract： Objective To study and analyze cancer-immune differentially expressed genes in progression and pseudo-progression glioblastoma， and predict active compounds. Methods The GSE231994 dataset was selected as the main analysis dataset in the Gene Expression Omnibus（GEO） database， and immune related differentially expressed genes were screened between samples of progression and pseudo-progression cases after secondary surgery. Biological Process（BP） of Gene Ontology（GO）， and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） analyses were performed to construct a protein-protein interaction（PPI） network and obtain hub genes. The TCMSP platform was applied to predict potentially active compounds， and molecular docking was accomplished on the CB Dock2 server. Results One hundred and forty differentially expressed genes were screened from the GSE231994 dataset， including 50 up-regulated genes and 90 down-regulated genes. The core genes included IL1B， IL10， CXCL8， EGFR， TLR， CD68， CXCR4， ITGB， CD16， and CSF1R， which mainly participated in inflammatory response， signal transduction， and immune response biological processes， as well as were enriched in the cancer pathway， cytokine-cytokine receptor interaction， and PI3K/Akt signaling pathways. The top three genes based on degree values were selected to predict， and quercetin may be an bio-active compound. The molecular docking results showed that quercetin had better binding ability with"IL1B. Conclusions It is revealed that immune expression genes IL1B， IL10， and CXCL8 are closely related to progression and pseudo-progression of glioblastoma， and quercetin can serve as an effective active compound for intervention via bioinformatics analysis.

Key words： progression; pseudo-progression; glioblastoma; bioinformatic; differentially expressed gene

膠質瘤是最常見的顱內腫瘤之一，其中膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是最為常見的惡性腦膠質瘤類型，預后極差，綜合治療后中位生存期也只有12～15個月［1］。GBM最常見的治療方法是手術治療，但手術切除后很容易復發(fā)。因此尋找膠質母細胞瘤復發(fā)的差異表達基因，并早期使用藥物干預具有重要意義。隨著基因測序技術的快速發(fā)展，各種疾病相關基因數(shù)據(jù)庫也快速崛起。近來利用基因表達譜數(shù)據(jù)庫和生物信息分析技術挖掘疾病差異表達基因，尋找新的靶標［2］，預測活性化合物并進行驗證，成為新藥篩選的新策略。本研究擬通過基因表達譜數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）篩選出早期復發(fā)和假性進展膠質母細胞瘤癌癥免疫相關的差異表達基因，通過分析獲得核心靶基因，并應用數(shù)據(jù)庫預測相關的活性化合物，為尋找抗復發(fā)膠質母細胞瘤的活性化合物提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 從GEO數(shù)據(jù)庫中選擇GSE231994基因數(shù)據(jù)集，物種類別為“Human”，該數(shù)據(jù)集包含48例膠質母細胞瘤樣本，其中27例進展并復發(fā)，21例假性進展。這些樣本均在患者二次腦切除手術時獲取。

1.2 差異表達基因的篩選 應用GEO2R程序，設置|log2（FC）|gt;0.5及Plt;0.05獲得差異表達基因。

1.3 差異表達基因的功能富集分析 將差異基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫［3］，進行基因本體論（Gene Ontology，GO）生物過程和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，揭示這些基因參與的生物過程和潛在的信號通路。

1.4 蛋白互聯(lián)網絡分析 將差異基因輸入到STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白互聯(lián)分析，并應用Cytoscape .10.0軟件［4］按度值（Degree）篩選出樞紐基因。

1.5 活性化合物的篩選 針對篩選出的核心靶點，通過TCMSP計算系統(tǒng)生物學實驗室平臺［5］篩選相關化合物。設置關鍵參數(shù)，如口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18和血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）≥-0.30［6］，最終篩選得到目標化合物。

1.6 目標化合物與核心靶點的分子對接實驗 篩選得到的目標化合物與核心靶點應用CB-Dock2服務器進行在線對接，驗證目標化合物與靶點的結合能力［7，8］。

2 結 果

2.1 差異表達基因篩選結果 選取GSE231994數(shù)據(jù)集為分析對象，以|log2（FC）|gt;0.5及Plt;0.05篩選出差異表達基因共140個，其中表達上調基因50個，表達下調基因90個。差異表達基因火山圖見圖1。

2.2 差異基因的GO生物過程和KEGG通路分析結果 差異表達基因輸入注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（the Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery，DAVID），獲得差異基因生物過程和通路富集分析見圖2。GO生物過程主要包括炎癥反應、信號轉導和免疫反應等。KEGG通路分析結果顯示，目標基因主要參與癌癥的發(fā)病途徑、細胞因子-細胞因子受體相互作用和PI3K/Akt信號通路等過程。

2.3 差異表達基因的蛋白互聯(lián)分析 采用STRING數(shù)據(jù)庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，見圖3。通過Cytoscape .10.0軟件按度值篩選出前10位樞紐基因為白細胞介素-1β（interleukin 1 beta，IL1B）、IL10、CXCL8、EGFR、TLR2、CD68、CXCR4、ITGB2、CD163和CSF1R（表1），其中核心基因IL1B、IL10、CXCL8在GBM患者樣本中均為下調基因。

2.4 活性化合物的篩選結果 通過TCMSP計算系統(tǒng)生物學實驗室平臺，針對IL1B靶點共有23個化合物，IL10靶點共有14個化合物，CXCL8靶點共有18個化合物，應用Venny軟件交集獲得它們共有的3個化合物，分別是白藜蘆醇、尼古丁和槲皮素，其化合物參數(shù)見表2，設置OB≥30%、DL≥0.18和BBB≥-0.30參數(shù)，最終獲得槲皮素為最可能的活性化合物。

2.5 槲皮素與核心靶點的分子對接驗證 選取度值排序前三的基因為IL1B（PDB ID：4DEP）、IL10（PDB ID：6X93）和CXCL8（PDB ID：6WZM），從PDB網站上下載蛋白分子，并應用PyMOL .4.1軟件刪除溶劑和殘基配體，加氫離子并進行電荷平衡，然后作為對接的蛋白分子，槲皮素作為對接配體，在CB-Dock2服務器上在線對接，對接結果見表3、圖4?！癡ina score”表示的是用Vina程序以相應的口袋參數(shù)對受體和配體進行分子對接所得到復合物的得分，這個值越低代表受體和配體親和力越高；“Cavity volume”表示每個空腔的大小?！癈enter”是對接口袋的中心坐標，“Docking size”是對接口袋在x、y和z軸方向的大小。在三個蛋白中，槲皮素與IL1B結合能力最強。

2.6 槲皮素治療膠質瘤體外和體內的實驗研究有研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁及其苷元槲皮素通過下調IL10蛋白等表達水平來抑制大鼠C6膠質瘤細胞增殖和遷移［9］，見圖5。此外，利用蘆丁及其苷元槲皮素處理的C6鼠膠質瘤細胞，IL1B的mRNA表達明顯增加，在C6細胞、U251和TG1人膠質瘤細胞中IL10含量明顯降低（圖6）。大鼠體內實驗也證實了槲皮素可促進IL1B表達，降低IL10的水平來誘導產生對膠質瘤細胞生長不利的腫瘤炎癥微環(huán)境，見圖7。

3 討 論

GBM是成人顱內腫瘤中病死率最高的，目前治療主要采取以手術為主，結合放化療等的綜合治療方式。部分患者術后12周內復查顱腦磁共振時發(fā)現(xiàn)影像學有早期進展，然而其性質可能為早期復發(fā)，亦可能為假性進展，兩者在治療方案和預后方面存在顯著差異［10］。目前臨床還是主要采用影像組學加以鑒別診斷，但仍存在一定的誤診率。本研究從術后早期復發(fā)和假性進展GBM患者樣本中尋找癌癥免疫表達差異基因，以期發(fā)現(xiàn)特定靶基因。GEO數(shù)據(jù)庫是由美國國立生物技術信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）創(chuàng)建和維護的基因表達數(shù)據(jù)庫，涵蓋了腫瘤、非腫瘤、芯片等多個領域，是目前最大、最全面的公共基因表達數(shù)據(jù)資源［11］。應用GSE231994基因數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要為IL1B、IL10、CXCL8、EGFR、TLR2、CD68、CXCR4、ITGB2、CD163和CSF1R等。

IL1B是一種強效促炎細胞因子，主要由淋巴細胞、巨噬細胞以及單核細胞響應微生物誘導而產生。

Gao等［12］通過細胞系、患者血清和腦組織的實驗研究，確定IL1B可為GBM潛在的血漿標志物。IL10是人體中主要的免疫調節(jié)細胞因子，在調節(jié)GBM中浸潤免疫細胞和腫瘤細胞的活性方面發(fā)揮主要作用［13］。從機制上講，IL10與其包含IL10RA和IL10RB的異四聚體受體結合，導致JAK1和STAT2介導的STAT3磷酸化。反過來，STAT3易位到細胞核，從而驅動抗炎介質的表達，抑制JAK/STAT通路可將促炎和抗炎細胞因子的平衡轉移到促炎環(huán)境中［14］。在GBM中觀察到IL10表達增加，這與基質中高水平的人類白細胞抗原Ⅱ（human leukocyte antigen Ⅱ，HLA-Ⅱ）和淋巴細胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）（+）T細胞浸潤有關［15］?；赗NA-seq的星形膠質細胞基因表達分析揭示了由小膠質細胞和星形膠質細胞在腫瘤環(huán)境中抗炎細胞因子IL10的大量釋放為腫瘤免疫逃逸提供了重要驅動力［16］。白細胞介素-8（CXCL8，IL-8）是一種趨化因子，招募中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞，但不招募單核細胞，還參與中性粒細胞的活化。CXCL8由間充質GBM干細胞優(yōu)先表達和分泌，激活PI3K/Akt和NF-κB信號傳導，并通過CXCR2-JAK2/STAT3軸在腫瘤相關巨噬細胞中誘導信號傳導，通過旁分泌、細胞外源性途徑支持M2樣腫瘤相關巨噬細胞表型［17］。

應用TCMSP平臺預測獲得可能的活性化合物是槲皮素。槲皮素（5，7，3′，4′-五羥基黃酮）是自然界常見的黃酮類化合物之一，具有廣泛的生物活性，其能夠緩解炎癥反應和氧化應激反應，減輕組織水腫，緩解臟器損傷等。已有研究表明，槲皮素可以抑制多種癌癥的生長，包括胃癌、膠質瘤、卵巢癌等［9］。槲皮素的抗GBM活性主要通過調節(jié)PI3K/Akt/mTOR、白細胞介素6信號轉導子和轉錄激活子三種信號通路、熱休克蛋白表達、細胞凋亡相關蛋白，調節(jié)細胞內pH以及血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2/-9和纖連蛋白調控等［18］。還有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可能通過雙重抑制Wnt3a/β-兒茶素和Akt/NF-κB信號通路，影響關鍵DNA修復酶MGMT的表達，從而促進細胞凋亡［19］。Da Silva等人體內和體外實驗研究也證明了槲皮素可促進促炎細胞因子的生成（IL1B等），降低抗炎細胞因子（IL10等），從而誘導產生對膠質瘤生長不利的免疫微環(huán)境，抑制膠質瘤細胞增殖和遷移。

本研究的局限是GEO獲取的樣本數(shù)量有限，樣本又存在個人差異，影響生物信息分析獲得差異表達基因的準確性，TCMSP預測得到的可能活性化合物槲皮素還需要進一步細胞實驗和大鼠體內實驗進行驗證。

綜上，本研究通過生物信息手段分析揭示免疫表達基因IL1B、IL10和CXCL8與膠質母細胞瘤早期復發(fā)和假性進展有著密切的關系，成功預測獲得槲皮素可作為干預的有效活性化合物。

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