漁業(yè)生物環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫研究進(jìn)展

摘要：利用宏條形碼技術(shù)可以對環(huán)境中的DNA物種信息進(jìn)行識別，從而實(shí)現(xiàn)生物群落分類監(jiān)測和生物多樣性的快速評估。該方法被廣泛應(yīng)用于漁業(yè)生物研究領(lǐng)域，借助大量的DNA條形碼數(shù)據(jù)材料，數(shù)據(jù)庫可以將其按照一定的標(biāo)準(zhǔn)保存整理，整合多種數(shù)據(jù)庫形成共享平臺，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的共享和交換。漁業(yè)生物環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建可以為漁業(yè)生物的研究和開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料和科學(xué)依據(jù)。綜述了魚類、浮游植物、底棲動物的環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫研究進(jìn)展，并對該方法應(yīng)用于漁業(yè)生物研究領(lǐng)域的前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：漁業(yè)生物；環(huán)境DNA宏條形碼；數(shù)據(jù)庫；研究進(jìn)展

中圖分類號：S932.2" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）01-0174-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.01.028 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Research progress on environmental DNA metabarcoding database of fishery biology

YANG Yan， LAN Yi， LIU Jia-min， WANG Qian

（College of Aquaculture/Tianjin Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture， Tianjin Agricultural University， Tianjin" 300384， China）

Abstract： The use of metabarcoding technology could identify DNA species information in the environment， thereby achieving the classification monitoring of biological communities and rapid assessment of biodiversity. This method was widely used in the field of fisheries biology research. With the help of a large amount of DNA barcode data materials， databases could store and organize them according to certain standards， integrate multiple databases to form a shared platform， and achieve data sharing and exchange. The construction of a DNA metabarcoding database for fishery biological environment could provide basic data and scientific basis for the research and development of fishery biology. This article reviewed the research progress of environmental DNA metabarcoding databases for fish， phytoplankton， and benthic animals， and prospected the application of this method in the field of fisheries biology research.

Key words： fishery biology； environmental DNA metabarcoding； database； research progress

中國水域資源豐富，對人類的生存和發(fā)展具有重要意義。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及氣候變化、生物入侵和人類活動等的影響，漁業(yè)生物的遺傳多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性都遭受嚴(yán)重破壞，實(shí)際漁業(yè)生物的滅絕風(fēng)險可能比以前預(yù)估的更加嚴(yán)重。為了更科學(xué)地保護(hù)水生環(huán)境，促進(jìn)漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，有效推進(jìn)科學(xué)研究的基礎(chǔ)性工作，需要快速、準(zhǔn)確地監(jiān)測生物多樣性。

面對豐富的生物圈，單靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的鑒定方法已經(jīng)不能滿足研究需求。一是物種存在遺傳變異性、個體間雜交、形態(tài)相似種和隱存種等現(xiàn)象；二是耗時長、成本高、對漁業(yè)生物及其生境破壞程度大，無法進(jìn)行長期高頻的監(jiān)測；三是分類學(xué)專家稀缺，鑒定準(zhǔn)確度受限于分類學(xué)專業(yè)知識［1］，傳統(tǒng)方法表現(xiàn)出越來越多的局限性。環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的出現(xiàn)改變了這一現(xiàn)狀，其具有耗時少、成本低、采樣方便、靈敏度高、對樣本無損傷等優(yōu)點(diǎn)［2］，逐漸成為評估生物多樣性較為可靠的補(bǔ)充手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

隨著環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了大量分散凌亂的物種分類信息，管理和共享這些信息成為阻礙該技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的因素。構(gòu)建數(shù)據(jù)庫是解決這一問題的有效方法，它可以作為存儲DNA條形碼和樣本信息的媒介，實(shí)現(xiàn)對未知漁業(yè)生物樣本的查詢和鑒定，為促進(jìn)各地區(qū)數(shù)據(jù)共享提供有效平臺［3］。因此建立全面準(zhǔn)確的環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫，對物種多樣性調(diào)查、漁業(yè)生物的監(jiān)測與評價至關(guān)重要。

本研究對漁業(yè)生物環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫的進(jìn)展進(jìn)行整理，通過現(xiàn)有理論研究，探析數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的步驟、關(guān)鍵環(huán)節(jié)和研究現(xiàn)狀，結(jié)合數(shù)據(jù)庫在魚類、浮游植物、底棲動物等的應(yīng)用進(jìn)行分析，為后續(xù)漁業(yè)生物環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建提供參考。

1 環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫的概況

1.1 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用

環(huán)境DNA（Environmental DNA，eDNA）是指可以直接從環(huán)境樣品中提取的DNA總和，環(huán)境DNA來源于代謝產(chǎn)物，如分泌物、唾液等，這些產(chǎn)物可以在水中保存數(shù)小時到數(shù)天，在沉積物中保存數(shù)十年到數(shù)百年［4］?！癳DNA”這一專業(yè)術(shù)語于2000年初在微生物學(xué)家的研究中出現(xiàn)［5］。2005年為探究地表水污染首次將eDNA引入水生生態(tài)系統(tǒng)［6］，2020年P(guān)awlowski等［7］對eDNA研究的范圍進(jìn)行深入的闡述。環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)［8］是通過引物對eDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合高通量測序技術(shù)對混合樣本中的物種組成進(jìn)行分析的一種新型物種鑒定技術(shù)，可以對目標(biāo)物種進(jìn)行精準(zhǔn)識別，幾十萬至幾百萬條DNA可以一次性完成快速高效測序［9］。2008年使用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)探測到美國牛蛙 （Rana catesbeiana）的存在是其首次在水生生物中的應(yīng)用［10］，隨后在淡水大型生物的eDNA 研究中證實(shí)該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)物種的快速鑒定［11］。通過Web of science檢索顯示，基于此技術(shù)在漁業(yè)生物研究的相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量基本呈上升趨勢，魚類是主要的研究對象，浮游植物和底棲動物的研究較少，如圖1所示。

目前，環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)已被證實(shí)是一種經(jīng)濟(jì)有效的水生群落調(diào)查方法，是水質(zhì)評價中很有前景的新興技術(shù)，在監(jiān)測珍稀種和入侵種方面顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢［11］。此外，該技術(shù)還用于漁業(yè)資源的有效估計(jì)［12］、種群分布［13］以及食性分析［14］等方面。

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)廣泛應(yīng)用于物種多樣性的監(jiān)測。王月［15］在調(diào)查赤水河的魚類多樣性時發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用傳統(tǒng)方法監(jiān)測到48種魚類，同期運(yùn)用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測到76種魚類，其中包含4種入侵種和珍稀種。李小闖等［16］運(yùn)用顯微鏡鏡檢法和環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對藍(lán)藻群落進(jìn)行監(jiān)測，研究表明，環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)可以監(jiān)測到更多物種，更能準(zhǔn)確揭示群落的結(jié)構(gòu)和組成，能反映不同季節(jié)和不同富營養(yǎng)化程度水體之間的差異。Hajibabaei等［17］于2011年首次證明宏條形碼技術(shù)可應(yīng)用于底棲動物的監(jiān)測，結(jié)果顯示該技術(shù)對水質(zhì)敏感昆蟲EPT類群的監(jiān)測尤為靈敏［18］。在漁業(yè)生物資源的調(diào)查中，運(yùn)用傳統(tǒng)方法很難進(jìn)行準(zhǔn)確評估，尤其是瀕危物種的估計(jì)，研究顯示環(huán)境DNA濃度與魚類相對豐度呈顯著正相關(guān)［12］，因此利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)可以更完整、高效地評估漁業(yè)資源。在種群分布研究領(lǐng)域，基于該技術(shù)得出美國芝加哥河流中鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和鳙（Hypophthalmichthys nobilis）的擴(kuò)散范圍超出了傳統(tǒng)方法所研究的區(qū)域［13］，對早期入侵物種具有識別作用。另外，基于此技術(shù)設(shè)計(jì)特異性引物來監(jiān)測不同魚類腸道中的餌料成分［14］，可以分析魚類的食性。

1.2 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的步驟

以中國漁業(yè)生物DNA條形碼信息平臺（http：//www.fishery-barcode.cn）［19］與中國底棲動物條形碼數(shù)據(jù)庫（http：//10.11.16.27：8888/benthosEDNAPlatform/index/homePage）［20］的構(gòu)建為例，總結(jié)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的步驟。

構(gòu)建數(shù)據(jù)庫首先要確定物種的目標(biāo)基因以完成后續(xù)的物種鑒定。在底棲動物數(shù)據(jù)庫中選取COI完成數(shù)據(jù)的比對工作，在漁業(yè)生物DNA條形碼信息平臺中貝類選取COI和ITS， 藻類選取ITS和rbcL并完成數(shù)據(jù)的比對工作。獲得的條形碼數(shù)據(jù)收錄進(jìn)兩個子庫，一是標(biāo)準(zhǔn)庫，該庫的數(shù)據(jù)經(jīng)過驗(yàn)證，物種信息準(zhǔn)確；二是參考庫，該庫的數(shù)據(jù)來源于GenBank、BOLD數(shù)據(jù)庫，未經(jīng)過驗(yàn)證，對中國特有物種收錄較少，可作為參考數(shù)據(jù)。

信息平臺由表現(xiàn)層、訪問層和數(shù)據(jù)庫層三部分組成。表現(xiàn)層的功能是實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的開放共享，如圖2所示。訪問層有兩種方式，一是網(wǎng)頁訪問，為用戶提供完備的物種信息查詢和檢索功能；二是客戶端訪問，使用方便快捷，可隨時隨地查詢物種信息。數(shù)據(jù)庫層具體信息如圖 3所示，3個數(shù)據(jù)庫以物種的拉丁名為外鍵聯(lián)系在一起，形成“物種-標(biāo)本-DNA條形碼”的對應(yīng)關(guān)系［19］，以此實(shí)現(xiàn)三者的相互關(guān)聯(lián)。

構(gòu)建數(shù)據(jù)庫的最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)物種鑒定。用戶可以通過輸入物種名在線檢索物種，獲得該物種的樣本信息和圖像信息［20］，也可以通過粘貼未知物種的DNA條形碼，在標(biāo)準(zhǔn)庫和參考庫中同時進(jìn)行鑒定，經(jīng)過BLAST比對獲得按相似度排列的分子鑒定結(jié)果。

1.3 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1.3.1 最優(yōu)目標(biāo)基因的選擇 對于環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫中目標(biāo)基因的選擇，通用性和適用性是最需解決的問題，因?yàn)樵摷夹g(shù)的準(zhǔn)確性和有效性在很大程度上取決于PCR擴(kuò)增中引物的選擇。目前學(xué)者對同一類物種采用不同的基因開展研究，導(dǎo)致各自建立的數(shù)據(jù)庫不統(tǒng)一，數(shù)據(jù)無法共享。

目前尚未確定一種適用于魚類環(huán)境DNA宏條形碼分析的通用性較廣的引物。陳治等［21］于2022年構(gòu)建海南島淡水魚類參考數(shù)據(jù)庫時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對通用性的要求不是特別嚴(yán)格時，COI是最優(yōu)目標(biāo)基因，其次是16S rRNA、12S rRNA。劉軍等［22］對千島湖48種魚類DNA進(jìn)行擴(kuò)增后比較發(fā)現(xiàn)，16S rRNA和COI通用性較好，但16S rRNA更適合作為魚類研究的目標(biāo)基因。Zhang等［23］比較了23對魚類通用引物，得出12S rRNA優(yōu)于16S rRNA。Xiong等［24］的研究表明，大多數(shù)通用引物對是為某一特定類別的魚類設(shè)計(jì)的，例如軟骨魚類或長尾魚類等。

用于浮游生物環(huán)境DNA宏條形碼最優(yōu)目標(biāo)基因的選擇也存在不一致情況。Bombin等［25］在對墨西哥北部灣濱海藻類的多樣性研究中使用23S rRNA；郭婷等［26］發(fā)現(xiàn)使用18S rRNA對鄱陽湖真核浮游植物多樣性研究的效果最佳；胡愈炘等［27］在2021年對丹江口水庫浮游生物多樣性及群落特征分析中分別使用18S rRNA和16S rRNA對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示有97%的相似度。

陳凱等［28］在對水生生物eDNA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前不同類群使用的目標(biāo)基因不同且資源較分散。其中，魚類以COI和12S rRNA為代表，浮游動物以COI和18S rRNA為代表，水生植物以ITS為代表，除藍(lán)藻外的浮游植物以rbcL、COI和18S rRNA為代表，高等植物以線粒體基因、葉綠體基因和ITS為代表。

鑒于每個物種都有多種條形碼序列，不同類型條形碼的序列長度和保守性都存在差異，鑒定的準(zhǔn)確性和解析度也不相同，對于哪種基因在特異性、辨別力和可重復(fù)性等方面表現(xiàn)最佳的研究仍在推進(jìn)。

1.3.2 種間差異閾值 評價DNA條形碼可行性的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)是種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離的差異，Hebert等［29］于2003年提出種內(nèi)遺傳距離不大于2%，種間平均遺傳距離大于種內(nèi)平均遺傳距離的10倍以上，大量文獻(xiàn)中不同物種的研究結(jié)果基本符合此標(biāo)準(zhǔn)。但是當(dāng)研究區(qū)域和物種不同時，相同目標(biāo)基因下的種間差異閾值可能存在差異，這種不穩(wěn)定性不能準(zhǔn)確體現(xiàn)物種間的進(jìn)化關(guān)系，這可能是影響數(shù)據(jù)庫被廣泛應(yīng)用的重要因素。賀楊等［30］利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對三峽庫區(qū)魚類多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示魚類種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的19.11倍。朱書禮等［31］在對珠江中下游魚類多樣性研究時發(fā)現(xiàn)，魚類種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的23.65倍。陳治等［21］研究了海南島淡水魚類的3種條形碼閾值及判定的準(zhǔn)確率，表明環(huán)境DNA宏條形碼由于受擴(kuò)增子長度的限制，種間差異閾值可能都比較小，同時受魚類自身遺傳特性的限制，此技術(shù)從源頭上就難以對魚類進(jìn)行100%的區(qū)分。

1.3.3 DNA條形碼的鑒定 大部分條形碼信息缺少專家鑒定，上傳條形碼數(shù)據(jù)的科研工作者專業(yè)素質(zhì)存在差異，造成部分信息鑒定和標(biāo)記錯誤?？蒲腥藛T應(yīng)確保入庫條形碼序列與形態(tài)學(xué)物種鑒定結(jié)果保持一致，并注意將同一物種下的各項(xiàng)信息及時匯總整理，有利于物種的整合鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的研究現(xiàn)狀

構(gòu)建DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫是規(guī)范管理DNA條形碼和實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享的有效方法，可以促進(jìn)分類學(xué)科的發(fā)展，也可以對漁業(yè)生物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化起到促進(jìn)作用，研究表明數(shù)據(jù)庫的大小和質(zhì)量直接決定了鑒定的可靠性和精準(zhǔn)性［32］。2007年國際生命條形碼協(xié)會建立了國際上第一個DNA條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)BOLD，收錄了動物、植物、真菌等26.7萬個物種，566.5萬條序列［19］。中國的GSA于2015年上線，它是國內(nèi)首個被國際期刊認(rèn)可的組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)布平臺，后期發(fā)展的NGDC于2019年獲批成立，其數(shù)據(jù)量增長快且數(shù)據(jù)的可用性、標(biāo)準(zhǔn)化均與國際接軌。2011年，中國建立了中國重要漁業(yè)生物DNA條形碼信息平臺，截至2023年8月，該數(shù)據(jù)庫包含了魚類、甲殼類、藻類等60 215個標(biāo)本的45 579條序列［19］。此外，中國還建立了中國漁業(yè)生物DNA條形碼信息平臺、中國檢疫性有害生物DNA條形碼鑒定系統(tǒng)等。

截至2013年10月，BOLD已收錄了近17.75萬條輻鰭魚綱魚類的DNA條形碼序列信息，其中收錄最多的類群是鱸形目（Perciformes），其次是鯉形目（Cypriniformes）與鲇形目（Siluriformes）［33］。中國參與構(gòu)建的魚類環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫主要有水庫漁業(yè)數(shù)據(jù)庫、漁業(yè)科學(xué)數(shù)據(jù)共享平臺、漁業(yè)科學(xué)數(shù)據(jù)庫、水產(chǎn)種質(zhì)資源信息系統(tǒng)以及全球9個國際機(jī)構(gòu)管理的FishBase。其中FishBase是魚類數(shù)據(jù)庫中規(guī)模最大、開發(fā)最廣、被訪問最頻繁的魚類數(shù)據(jù)庫［34］。

浮游植物在NCBI數(shù)據(jù)庫中物種覆蓋率不高，張宛宛［35］在對太湖流域常見藻類進(jìn)行測序后，與NCBI進(jìn)行比對分析，獲得常見藻類ITS條形碼95種，表明已獲得序列與NCBI中已有序列具有較高的同源性，但是其中藍(lán)藻門（Cyanophyta）鑒別到種的信息較少，說明仍有大部分浮游植物的種屬序列尚未錄入NCBI數(shù)據(jù)庫。

中國底棲動物條形碼數(shù)據(jù)庫的發(fā)展較慢。GenBank和BOLD等公共數(shù)據(jù)庫收錄的數(shù)據(jù)在地理分布和物種覆蓋度等方面不均衡，導(dǎo)致中國特有的底棲動物種類很少被收錄。因此，在2019年11月召開的中國底棲動物條形碼數(shù)據(jù)庫研討會上確定構(gòu)建中國首個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的底棲動物條形碼數(shù)據(jù)庫［20］，現(xiàn)已完成昆蟲綱（Insecta）、寡毛綱（Oligochaeta）、軟甲綱（Malacostraca）等合計(jì)400多種的條形碼測序工作，收錄1 000多條條形碼序列。中國海洋大學(xué)于2020年發(fā)布了國際首個軟體動物綜合基因組數(shù)據(jù)庫MolluscDB［36］，是迄今物種覆蓋度較廣、組學(xué)資源較豐富的軟體動物基因組學(xué)分析平臺。2022年構(gòu)建的中國淡水大型底棲無脊椎動物條形碼數(shù)據(jù)庫已收錄800多個底棲動物物種、1 100多條條形碼序列，其中水生昆蟲數(shù)量最多，端足目（Amphipoda）、寡毛綱（Oligochaeta）等物種類群的數(shù)據(jù)仍有欠缺［20］。

2 環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用

全面準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)庫有助于漁業(yè)生物在物種鑒定、遺傳變異、群落動態(tài)、資源保護(hù)等方面的發(fā)展。不夠完善的數(shù)據(jù)庫可導(dǎo)致50%以上的宏條形碼無法確定其具體的物種信息［32］，因此需要不斷加強(qiáng)數(shù)據(jù)采集力度和完善應(yīng)用體系。

2.1 魚類環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用

魚類DNA條形碼最常用的標(biāo)記是COI，Ward等［37］用COI成功區(qū)分了澳大利亞、北大西洋大陸架地區(qū)的不同物種。柳淑芳等［38］、李鵬飛等［39］、楊凡［40］基于COI在石首魚科（Sciaenidae）、東海帶魚（Trichiurus lepturus）、中國鰈形目（Pleuronectiformes）等類群的分類鑒定中取得了較好的成效。徐春燕等［41］基于COI對福建省近海區(qū)域的仔稚魚DNA條形碼進(jìn)行分析，獲得基因序列73條，鑒定物種26種，隸屬于7目22科25屬，說明COI可以實(shí)現(xiàn)仔稚魚物種的鑒定，較多鑒定到種的水平。曲欣宇等［3］構(gòu)建的黃、渤海魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中涵蓋了300多種魚類的DNA條形碼資源，目前此平臺只支持COI的檢索，現(xiàn)已應(yīng)用于相關(guān)水域的魚類生產(chǎn)中，確保物種甄別的準(zhǔn)確性。

不是所有魚類都可以用COI鑒定，Kruck等［42］發(fā)現(xiàn)鱚屬（Sillago）的兩個近緣種需要使用多基因條形碼才能進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，易發(fā)生種間雜交現(xiàn)象的某些特定魚類、雜交個體及其雙親也需要利用多基因條形碼鑒定。因此，在未來使用多基因條形碼技術(shù)鑒別魚類的某些類群可能是更有效的方法。

2.2 浮游植物環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用

浮游植物DNA條形碼的研究已在硅藻、綠藻、甲藻、藍(lán)藻等物種中開展，使用的基因有ITS、rbcL、COI等，這些基因各有優(yōu)勢，目前尚未發(fā)現(xiàn)適合藻類鑒定的統(tǒng)一條形碼基因。

硅藻是海洋浮游植物中生物量最高的類群之一，目前認(rèn)為rbcL測序效率較高，適合作為硅藻的首選條形碼基因［43］。對于使用雙基因條形碼技術(shù)鑒別硅藻，Macgillivary等［44］在對比ITS、18S rRNA和rbcL后認(rèn)為將rbcL與5.8S+ITS2區(qū)域搭配使用效果最佳。

綠藻在已有的藻類基因序列數(shù)據(jù)中所占的比例較小，使用的基因包括COI、rbcL、tufA、ITS等，目前認(rèn)為tufA擴(kuò)增效率高、種間差異大、很少有內(nèi)含子，適合作為綠藻分類鑒定的基因［45］。

在真核生物中，甲藻有龐大的核基因組，大部分基因在細(xì)胞核內(nèi)，線粒體中基因較少，所以在物種鑒定時要避免某些條形碼基因多態(tài)性對測序分析、引物設(shè)計(jì)及多樣性評估帶來的干擾［33］。經(jīng)過嘗試認(rèn)為ITS和28S rRNA更適合作為甲藻鑒定的條形碼基因，Stern等［46］運(yùn)用ITS對甲藻中的78個物種進(jìn)行鑒別，可以有效區(qū)分絕大多數(shù)物種，但需要同其他條形碼基因輔助使用。Raho等［47］在鑒別鰭藻屬（Dinophysis）時發(fā)現(xiàn)，相較于ITS和COB，COI雖然表現(xiàn)出較強(qiáng)的種間差異性，但無法有效區(qū)分所有的物種。

在藍(lán)藻多樣性的研究中，16S rRNA被認(rèn)為是最優(yōu)基因，有高度保守性區(qū)域和高度變異性區(qū)域，可同時反映物種間的差異及親緣關(guān)系［48］。GenBank數(shù)據(jù)庫中藍(lán)藻16S rRNA序列呈指數(shù)趨勢增加，提升了藍(lán)藻鑒定的精確度［49］。

為了向用戶提供更加準(zhǔn)確的藻類分類鑒定、生物多樣性評估的信息平臺，未來數(shù)據(jù)庫會錄入更多的藻類DNA條形碼信息。

2.3 底棲動物環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用

海綿動物被認(rèn)為是最原始的后生動物類群，初步預(yù)測已被描述的物種僅有53.3%［50］。由于海綿動物形態(tài)結(jié)構(gòu)高度相似，采用傳統(tǒng)方法難以準(zhǔn)確鑒別，因此它是最早建立全球性條形碼計(jì)劃的無脊椎動物類群。研究顯示，COI下游的I3-M11區(qū)［51］和ITS區(qū)［52］適合作為海綿動物的條形碼標(biāo)記基因。

原生動物結(jié)構(gòu)簡單，但種類繁多、數(shù)量龐大、分布較廣。Santoferrara等［53］在沙殼纖毛蟲目（Tintinnida）的物種鑒定中，比較了18S rRNA、18S rRNA高變異區(qū)V4、18S rRNA高變異區(qū)V9及28S rRNA 4個片段，結(jié)果顯示28S rRNA有效鑒別出86%的形態(tài)類型，具有明顯的優(yōu)勢。此外，COI能準(zhǔn)確區(qū)分纖毛蟲屬（Tetrahymen）的不同類群，適合作為纖毛蟲類標(biāo)準(zhǔn)條形碼基因［54］。卞小宇等［55］構(gòu)建的污水環(huán)境原生動物數(shù)據(jù)庫，收錄原生動物702種，涉及32目88科284屬，對每個階元的原生動物都有主要的形態(tài)特征描述，為污水環(huán)境中原生動物的鑒定及分析做出重要貢獻(xiàn)。

軟體動物是動物界的第二大類群，DNA條形碼技術(shù)在腹足綱（Gastropoda）、頭足綱（Cephalopoda）、雙殼綱（Lamellibranchia）中應(yīng)用較廣泛，但在單板綱（Aplacophora）、多板綱（Polyplacophora）及無板綱（Aplacophora）中的應(yīng)用較少［33］。目前主要使用COI，結(jié)合16S rRNA和ITS等輔助基因鑒別軟體動物類群。Liu等［56］在研究櫛江珧（Atrina pectinate）群體的隱存種及個體間雜交時，運(yùn)用ITS和COI基因分別發(fā)現(xiàn)了5個和6個明顯分化的支系，還在同一個體中發(fā)現(xiàn)多種ITS序列，對研究其雜交現(xiàn)狀提供了重要依據(jù)。

甲殼動物DNA條形碼的研究較完善，目前鑒定該類群較理想的基因是COI ［33］，在鑒定加拿大多種蝦類［57］以及橈足類時結(jié)果較好。對于某些甲殼動物而言，完成物種的準(zhǔn)確鑒定需要使用多基因，例如結(jié)合COI和16S rRNA片段成功鑒定出香港海域的口足目（Stomatopoda）物種［58］。

總體來說，底棲動物的DNA條形碼研究工作已在物種鑒定、隱種甄別等方面展開［33］，但現(xiàn)有底棲動物類群條形碼數(shù)據(jù)仍存在存儲混亂、信息零散以及數(shù)據(jù)庫之間難以建立聯(lián)系等問題。

3 展望

雖然，環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建正在從根本上改變生物評估的方式，但仍存在以下問題需要進(jìn)一步完善。①數(shù)據(jù)共享存在障礙。當(dāng)前用于物種鑒定的數(shù)據(jù)庫分類標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，導(dǎo)致數(shù)據(jù)的存儲和共享過程存在障礙。②條形碼信息存在鑒定和標(biāo)記錯誤。條形碼信息缺少專家鑒定或未及時更新都會導(dǎo)致這種錯誤。③測序錯誤。在數(shù)據(jù)獲得階段由于樣本污染等原因?qū)е伦罱K得到的序列并不是目標(biāo)物種序列。④序列沖突。多個物種的條形碼序列相同，導(dǎo)致無法對這些物種進(jìn)行有效區(qū)分。條形碼針對的目標(biāo)物種范圍越廣，出現(xiàn)這一問題的可能性就越高。⑤物種覆蓋度不高。各地區(qū)物種多樣性存在差異，對條形碼研究的投入也不相同，公共數(shù)據(jù)庫對于特有種、少見種和地理亞種收集較少。⑥構(gòu)建數(shù)據(jù)庫過程費(fèi)時費(fèi)力。自建數(shù)據(jù)庫完全覆蓋高通量測序結(jié)果的情況尚未出現(xiàn)，可見構(gòu)建全面準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)庫難度較大。⑦存在假陽性問題。采樣工具清洗不到位、實(shí)驗(yàn)室受到污染、引物通用性不高或者樣本中含有PCR抑制劑均可能使試驗(yàn)結(jié)果存在假陽性［2］。

未來，數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建將趨于系統(tǒng)、準(zhǔn)確、完善。第一，為實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫資源共享，需統(tǒng)一分子標(biāo)記，并篩選出適用性最好的目標(biāo)基因來充實(shí)數(shù)據(jù)庫；第二，不僅著眼于熱門類群數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，對易忽視類群、形態(tài)鑒定困難類群的條形碼信息也要加大采集力度；第三，要積極構(gòu)建本土自主的數(shù)據(jù)庫，鑒于水產(chǎn)遺傳育種、水產(chǎn)品安全保障、水產(chǎn)藥物開發(fā)等方面的社會需求日益增長，構(gòu)建數(shù)據(jù)庫必須有一定的針對性和兼顧性；第四，要加強(qiáng)全球資源共享。未來，中國將不斷促進(jìn)國內(nèi)外各地區(qū)的數(shù)據(jù)共享和合作交流，在開展物種種質(zhì)資源研究和生物多樣性保護(hù)工作中發(fā)揮更大作用。隨著測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，條形碼技術(shù)也將向著更加高通量、智能化的方向發(fā)展，隨著新方法和新技術(shù)的應(yīng)用，環(huán)境DNA宏條形碼數(shù)據(jù)庫會在生物多樣性保護(hù)和生態(tài)學(xué)研究方面引領(lǐng)新的方向，促進(jìn)全球生物物種條形碼信息數(shù)字化時代的到來。

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